1.本发明涉及水蛭粉加工技术领域，尤其涉及一种高活性水蛭粉加工制备方法。
背景技术：
2.水蛭，俗称蚂蟥，始载于《神农本草经》，富含水蛭素等多种抗凝血成分，是经典的破血逐疲类中药，对大量因淤血所致的疑难杂症力专效宏。现代研究表明，水蛭对血液系统具有抗凝、纤溶、抑制血小板聚集、降低血比黏度、降血脂、抗血栓作用；对心脑血管系统有增加血流量、改善功能状态的作用。这些作用均来自水蛭素等蛋白质成分，其缺陷是这些蛋白质类成分很容易在加工过程中受热变性失去活性。因此，近年来通过冷冻干燥等技术对鲜品水蛭进行加工，结合辐照灭菌技术，生产的各类水蛭冻干粉成为众多心脑血管疾病患者福音。
3.文献号为cn102008509a中国发明专利公开了一种脉血康肠溶片剂的制备方法，该肠溶片剂是以活体水蛭为原料进行加工制备，其制备方法为：取活体水蛭洗净泥沙，冷冻，组织捣碎机制匀浆，低温干燥，灭菌、粉碎成细粉，以获得水蛭冻干粉，再以所述水蛭冻干粉为原料将其制备为肠溶片。该种水蛭冻干粉在生产加工过程中具有如下两方面缺陷：第一，水蛭具有很好的柔韧性，鲜品水蛭匀浆过程中极不容易粉碎，影响产量和生产效率；第二，为保障冻干粉用药安全，必须通过大剂量c
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辐照杀灭其中的病毒、真菌等多种微生物。一方面导致蛋白质变性，影响药物活性，另一方面辐照使其中的活性物质的化学键断裂，产生新物质，给临床用药带来潜在风险。
技术实现要素：
4.为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种高活性水蛭粉制备加工方法，该方法克服了现有的冻干水蛭粉的生产缺陷，是一种可均匀灭菌、快速、简便、高效的水蛭粉生产制备方法，具有巨大的市场应用价值。
5.为达到上述技术效果，本发明采用了以下技术方案：
6.第一方面，本发明提供一种高活性水蛭粉加工制备方法，包括以下步骤：
7.s1：取鲜品水蛭，加入5～15倍质量的乙醇溶液，浸泡1～3小时后将其放入低温冰柜，冷冻至-40℃～-20℃后制匀浆，其中，乙醇溶液的加入量优选为鲜品水蛭的10倍质量。
8.s2：将上述匀浆液过筛，并将过筛后获得的滤液在40℃以下减压干燥，即得高活性水蛭粉。
9.进一步地，所述s2中过筛为过100～200目筛。
10.进一步地，所述制匀浆过程可加入鲜品水蛭质量3～5倍的乙醇溶液。
11.进一步地，所述乙醇溶液的浓度为75～95％，优选为95％。
12.优选地，所述鲜品水蛭来源于水蛭科动物蚂蟥whitmania pigra、水蛭 hirudo nipponica或柳叶蚂蟥whitmania acranulata及菲牛蛭poecilobdellamanillensis。
13.第二方面，本发明提供一种采用上述高活性水蛭粉加工制备方法制备得到的高活
性水蛭粉在制备抗凝溶栓的药物、保健品原料、化妆品原料中的应用。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
15.首先，本发明提供的一种高活性水蛭粉加工制备方法通过高浓度乙醇加入，均匀无死角地杀灭了鲜品水蛭中所有的病毒、真菌等微生物，无需后续再进行灭菌处理，降低了水蛭粉的加工成本；其次，乙醇在进行灭菌的同时，通过夺取水蛭细胞中的水分，使水蛭细胞皱缩，在低温状态变得易碎，易于匀浆。此外，由于水蛭的水匀浆液分散性差，黏性大，难于通过筛网，而加入至该匀浆中的乙醇则提高了该匀浆的分散性，使其容易通过筛网，提高了生产效率；最后，传统的冷冻干燥设备投入大，生产周期长，而本方法设备投入小，制备方法简便、高效，易于大批量、高效率地生产加工。
16.综上所述，本发明克服了现有冻干水蛭粉生产缺陷，提供了一种均匀灭菌且快速、简便、高效的高活性水蛭粉生产制备方法，具有巨大的市场应用价值。
具体实施方式
17.下面对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂或仪器未注明生产厂商者，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料，且实施例中未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行。
18.实施例1
19.本实施例为本发明的制备实施例，本实施例分别采用水蛭科动物蚂蟥 whitmania pigra、水蛭hirudo nipponica或柳叶蚂蟥whitmania acranulata 及菲牛蛭poecilobdella manillensis为原料进行加工制备。
20.1.1以水蛭hirudo nipponica为制备原料，制备方法具体包括步骤：
21.s1：取鲜品水蛭(hirudo nipponica)5公斤，放入50l带盖塑料桶中，加入95％乙醇50l，置于冰柜中，冷冻至-20℃。
22.s2：捞出冷冻后的水蛭，放入匀浆机中，加入塑料桶中15l乙醇溶液，匀浆；匀浆液过100目筛网。如有少许不能过筛网的残渣，再放回匀浆机中再次进行匀浆，然后将其过100目筛网后合并两次过滤获得的匀浆液，放入减压干燥器中，40℃减压干燥，得水蛭粉450g。同时，在减压干燥过程真空减压管连接-10℃冷凝水，回收乙醇。
23.1.2本实施例为本发明的制备实施例，且制备原料为蚂蟥whitmaniapigra，其具体制备方法参照1.1中的制备方法，以蚂蟥whitmania pigra原料5公斤，可制备得到510g高活性水蛭粉。
24.1.3本实施例为本发明的制备实施例，且制备原料为柳叶蚂蟥whitmaniaacranulata，其具体制备方法参照1.1中的制备方法，以柳叶蚂蟥whitmaniaacranulata原料5公斤，可制备得到494g高活性水蛭粉。
25.1.4本实施例为本发明的制备实施例，且制备原料为菲牛蛭poecilobdellamanillensis，其具体制备方法参照1.1中的制备方法，以菲牛蛭 poecilobdella manillensis原料5公斤，可制备得到596g高活性水蛭粉。
26.实施例2
27.2.1高活性水蛭粉的制备
28.本实施例共制备四种高活性水蛭粉，该四种高活性水蛭粉分别以水蛭 (hirudo nipponica)、蚂蟥whitmania pigra、柳叶蚂蟥whitmania acranulata 及菲牛蛭poecilobdella manillensis为原料，其具体制备方法如下：
29.s1：分别称取水蛭(hirudo nipponica)、蚂蟥whitmania pigra、柳叶蚂蟥whitmania acranulata及菲牛蛭poecilobdella manillensis各200g，加入虫媒病毒、疱疹病毒、大肠杆菌溶液各5ml(浓度为106个/ml)，加入95％乙醇2l，浸泡3小时；放入冰柜冷冻至-20℃，采用匀浆机进行匀浆；
30.s2：匀浆液过100目筛网，过滤液于35℃～40℃减压干燥，得高活性水蛭粉，依次记录为样1-样4。
31.2.2病毒灭活和杀菌效果验证
32.2.2.1分别取样1-样4适量，按照1:20比例，分别接种到病毒敏感细胞，试验组设为样品组(a、b、c、d组)、虫媒病毒阳性对照组(a1、b1、c1、d1 组)、疱疹病毒阳性对照组(a2、b2、c2、d2组)，同时设病毒敏感细胞设为阴性对照组。
33.将各组试验细胞放入培养箱内培养(37℃)，于第一日、第三日、第七日观察致细胞病变效应：样品组(a、b、c、d组)和阴性对照组第1至第7天观察均为阴性；虫媒病毒(a1、b1、c1、d1组)、疱疹病毒(a2、b2、c2、d2 组)第1至第7天观察均为阳性。
34.该实验结果说明，通过本发明的高活性水蛭粉加工制备方法对水蛭粉中的虫媒病毒和疱疹病毒有良好的杀灭效果。
35.2.2.2分别取样1～样4适量，按照中国药典(2020版)中的“大肠杆菌检测”方法进行检验，结果表明，样品样1～样4中均未检出大肠杆菌，说明该高活性水蛭粉加工制备方法对包括大肠杆菌在内的革兰氏均的杀菌效果良好。
36.综上所述，本发明提供的一种高活性水蛭粉加工制备方法对病毒及大肠杆菌等微生物具有完全杀灭作用，其在制备高活性水蛭粉的过程中即可完成。
37.实施例3
38.本实施例为高活性水蛭粉的凝血酶活性测定实施例，其具体操作为：
39.s1：供试品溶液的制备：
40.分别取实施例1中的4种水蛭粉各约1g，精密称定并加入0.9％氯化钠溶液5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并实施振摇，离心，取上清液1ml，用0.9％氯化钠溶液稀释50倍，精密量取上清液100μl，置试管(8mm
×
38mm)中，加入含0.5％(牛)纤维蛋白原(以凝固物计)的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液 200μl(临用配制，配制方法为：0.2mol/l三羟甲基氨基甲烷溶液25ml与 0.1mol/l盐酸溶液各40ml，加水至100ml)，摇匀，置水浴中(37℃
±
0.5℃) 温浸5分钟；
41.s2：凝血酶活性测定
42.供试品溶液滴加每1ml中含40单位的凝血酶溶液(临用配制，配制方法为：取凝血酶试剂适量，加生理盐水配制成每1ml含凝血酶40个单位或10个单位的溶液)，滴加速度为每1分钟滴加1次，每次5μl，边滴加边轻轻摇匀直至供试品溶液凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式公式u＝(c1v1/c2v2) 计算：样1～样4分别为176u、105u、118u、480u。
43.式中：u
‑‑
每1g含凝血酶活性单位，单位为u/g；c1
‑‑
凝血酶溶液的浓度，单位为μ/
ml；c2
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供试品溶液的浓度，单位为g/rnl；v1
‑‑
消耗凝血酶溶液的体积，μl；v2
‑‑
供试品溶液的加入量，单位为μl。
44.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。