植物来源的细胞外囊泡、其用途及包含其的产品的制作方法

植物来源的细胞外囊泡、其用途及包含其的产品
1.本发明是申请日为2021年03月26日、申请号为202110327946.9、发明名称为“植物来源的细胞外囊泡、其用途及包含其的产品”的原申请的分案申请。
技术领域
2.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种植物来源的细胞外囊泡、其用途及包含其的产品。


背景技术：

3.在自然杀伤细胞(natural killer cell，nk)的表面上，表达了抑制nk细胞活化的受体分子(kir)。由于主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，mhc)分子可以与kir结合，因此表达mhc分子的细胞可以发送信号，从而不会被nk细胞杀死。正常细胞总是表达mhc分子以表明自身，因此nk细胞不会杀死表达mhc分子的正常细胞。如果不表达mhc蛋白的“癌细胞”出现，则nk细胞将杀死这些癌细胞。
4.nk细胞疗法旨在将该特性应用于癌症治疗。然而，经验表明，用nk细胞治疗实体瘤是非常困难的。原因之一是正常的nk细胞培养方法不能很好地将其激活，或者由于自体细胞移植，免疫系统的许多细胞由于抗癌药物治疗的副作用而枯竭。一般认为这是nk细胞自身攻击癌细胞的能力大大降低的原因。另外，现如今为了增加nk细胞的治疗效果，会在体外或体内运用nk细胞增殖剂，如il-2(白细胞介素-2)或il-15(白细胞介素-2)促进nk细胞的增殖，增加nk细胞的数量，维持nk细胞长期生长。但是nk细胞在增殖过程中会出现衰老的情况，进而使得应用nk细胞的治疗效果欠佳。
5.因此，需要探索一种能够有效激活nk细胞以治疗癌症的药剂。


技术实现要素：

6.(一)解决的技术问题
7.针对现有技术的不足，本发明提供了一种植物来源的细胞外囊泡(extracellular vesicle,ev)与患者自身nk细胞体外共同培养的新用途，所述植物来源的细胞外囊泡可以激活nk细胞穿孔素和颗粒酶的释放，增强nk细胞对癌细胞的攻击能力，克服以往nk细胞自身攻击癌细胞能力降低的问题。
8.(二)技术方案
9.一方面，本发明提供了一种nk细胞激活剂，所述nk细胞激活剂包含植物来源的细胞外囊泡。
10.另一方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含本发明的nk细胞激活剂，和nk细胞增殖扩增剂。
11.另一方面，本发明提供了本发明的nk细胞激活剂或本发明的组合物在制备治疗癌症的药物中的应用。
12.另一方面，本发明提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含
本发明的nk细胞激活剂或本发明的组合物，和药学上可接受的载体。
13.另一方面，本发明提供了一种用于治疗癌症的方法，包括向受试者施用本发明的nk细胞激活剂、组合物或药物组合物。
14.(三)有益效果
15.与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：
16.nk细胞的胞质颗粒含有诸如穿孔素和颗粒酶之类的蛋白质，它们在杀死癌细胞的细胞毒性活性中起着核心作用。穿孔素由受伤的细胞释放并刺穿癌细胞的细胞膜，从而使颗粒酶和相关分子进入。颗粒酶是丝氨酸蛋白酶，其在靶细胞例如癌细胞的细胞质中诱导凋亡。本发明发现植物来源的细胞外囊泡可用于激发nk细胞释放大量蛋白质(例如穿孔素和颗粒酶)，这些蛋白质是该nk细胞的细胞毒性的主要功能因子。本发明提供的植物来源的细胞外囊泡克服了以往nk细胞自身攻击癌细胞能力降低的问题，增强了nk细胞对癌细胞的攻击能力，增强了nk细胞对癌症的治疗效果。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1显示了nk细胞的颗粒酶的表达量增加；
19.图2显示了nk细胞的fas-l的表达量增加；
20.图3显示了nk细胞的tnf-α的表达量增加；
21.图4显示了nk细胞的il-2的分泌量增加。
具体实施方式
22.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.植物来源的细胞外囊泡
24.本发明提供的植物来源的细胞外囊泡可以使nk细胞释放蛋白质(例如穿孔素和颗粒酶)的量增加。这些蛋白质是nk细胞的细胞毒性的主要功能因子，是nk细胞攻击癌细胞的武器。
25.本发明提供的植物来源的细胞外囊泡也可以使nk细胞表面上tnf家族分子(例如fas-l、trail、tnf-α和tweak)的表达量升高。tnf家族分子与靶细胞上表达的相应受体结合，从而诱导凋亡。
26.本发明提供的植物来源的细胞外囊泡也可以使nk细胞分泌白介素-2(il-2)的量增加。il-2可以激活各种免疫细胞，包括b细胞、nk细胞、lak细胞、单核细胞、巨噬细胞和少突胶质细胞。
27.本发明提供的植物来源的细胞外囊泡通过以上作用中的一种或多种来增强nk细
胞对癌细胞的杀伤效果。
28.在本发明中所描述的细胞外囊泡来源于海藻。在一个具体的实施方案中，细胞外囊泡来源于褐藻纲(phaeophyceae)植物。在一个更具体的实施方案中，细胞外囊泡来源于水云属(ectocarpus)植物。在一个更具体的实施方案中，细胞外囊泡来源于水云或海云(nemacystus decipiens)。在一个更具体的实施方案中，细胞外囊泡来源于通常称为“mozuku”的粘附藻。它是一种褐色藻类，自古以来就已在世界范围内食用，它是丝状的，厚度约为1至3.5毫米，长度为25至40厘米。特征是叶状体的表面具有粘附性，其粘稠成分中的
29.岩藻聚糖(fucoidan)含量约为裙带菜和海带的5至8倍。在本发明的一个实施方案中，细胞外囊泡是从提取自海藻的岩藻聚糖中提取的。
30.在本发明的一个实施方案中，细胞外囊泡通过以下步骤制备：
[0031]-从海藻中提取岩藻聚糖，
[0032]-通过超离心法从岩藻聚糖中提取细胞外囊泡。
[0033]
在本发明的一个实施方案中，细胞外囊泡可以通过以下步骤制备：
[0034]-从褐藻纲植物中提取精炼出低分子的power岩藻聚糖
[0035]-离心沉淀后取上清液(不要取到沉淀物)，
[0036]-通过超离心法取得上清液(有绿色沉淀，将其除去)，
[0037]-在上清液中得到植物来源的细胞外囊泡。
[0038]
在本发明的一个实施方案中，细胞外囊泡通过以下步骤制备：
[0039]-从海藻中提取岩藻聚糖，
[0040]-将岩藻聚糖溶解于pbs中，
[0041]-在2,000
×
g，4℃条件下离心10分钟，
[0042]-取上清液在4℃下以35,000rpm离心70分钟，
[0043]-用pbs洗涤沉淀，
[0044]-再次在4℃下以35,000rpm离心70分钟，
[0045]-弃去上清液，将底部含有悬浮物的pbs液体在4℃、10,000x g条件下离心10分钟，除去绿色沉淀，获得含有细胞外囊泡的上清液。
[0046]
在本发明中，制备步骤中所涉及的数字包括该数值
±
10％的范围。例如，10分钟包括9分钟至11分钟的范围。又例如35,000rpm包括31,500rpm至38,500rpm的范围。
[0047]
在一个优选的实施方案中，岩藻聚糖的分子量小于或等于约500道尔顿，例如小于或等于400dal，小于或等于450dal，小于或等于460dal，小于或等于470dal，小于或等于480dal，小于或等于490dal，小于或等于495dal，小于或等于500dal，小于或等于505dal，或小于或等于510dal。
[0048]
从海藻中提取低分子化(约500分子量以下)的power岩藻聚糖是本领域已知的，例如九州大学白畑實隆教授所公布的方法。或者，可以使用市售的power岩藻聚糖(例如jan:4580123711060)。因此，在一个具体的实施方案中，植物来源的细胞外囊泡提取自岩藻聚糖。
[0049]
在本发明的一个实施方案中，细胞外囊泡是外泌体(exosome)。
[0050]
nk细胞增殖扩增剂
[0051]
植物来源的细胞外囊泡可以单独使用，或者可以与nk细胞增殖扩增剂一起使用，
来激活nk细胞。nk细胞增殖扩增剂包括il-2和/或il-15。
[0052]
因此，在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包括本发明的nk细胞激活剂，和nk细胞增殖扩增剂。在一个更具体的实施方案中，药物组合物包括nk细胞激活剂和il-2。在另一个更具体的实施方案中，药物组合物包括nk细胞激活剂和il-15。在另一个更具体的实施方案中，药物组合物包括nk细胞激活剂、il-2和il-15。
[0053]
癌症
[0054]
本发明提供的植物来源的细胞外囊泡可用于治疗癌症。
[0055]
在一个具体的实施方案中，癌症可以是血液肿瘤或实体肿瘤。
[0056]
在一个更具体的实施方案中，实体肿瘤可以是卵巢癌、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、复发难治型神经母细胞瘤、梅克尔细胞癌、直肠癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、宫颈癌、胆管癌、胃肉瘤、神经胶质瘤、骨肉瘤或脑癌。
[0057]
在一个更具体的实施方案中，血液肿瘤可以是白血病、骨髓瘤或淋巴瘤。
[0058]
在一个更具体的实施方案中，白血病可以是急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、毛细胞白血病、t细胞幼淋巴细胞白血病或大颗粒状淋巴细胞白血病。
[0059]
在一个更具体的实施方案中，骨髓瘤可以是无症状性骨髓瘤、冒烟型骨髓瘤(smm)、多发性骨髓瘤(mm)或轻链型骨髓瘤。
[0060]
在一个更具体的实施方案中，淋巴瘤可以是霍奇金淋巴瘤、t细胞淋巴瘤和b细胞淋巴瘤的非霍奇金淋巴瘤。
[0061]
药物组合物
[0062]
本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的nk细胞激活剂，和药学上可接受的载体。
[0063]
发明还提供了一种药物组合物，其包含本发明的nk细胞激活剂和nk细胞增殖扩增剂，和药学上可接受的载体。
[0064]
在一个具体的实施方案中，药学上可接受的载体可以是稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、ph调节剂、抗氧剂、抑菌剂和缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
[0065]
治疗方法
[0066]
本发明提供了一种治疗癌症的方法，包括向受试者施用本发明的nk细胞激活剂。
[0067]
在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，包括：向患者施用治疗有效量的植物来源的细胞外囊泡。植物来源的细胞外囊泡在体内激活nk细胞，促进nk细胞分泌穿孔素、颗粒酶、tnf家族分子和il-2的表达或释放，增强了nk细胞对癌细胞的杀伤能力。
[0068]
给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药或经皮给药。
[0069]
联合疗法
[0070]
本发明的nk细胞激活剂还可以与其他抗癌药物组合使用。因此，任意上述药物组合物还可以包含其他抗癌药物。
[0071]
药物组合物的剂型可以为注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、冻
干粉末、气雾剂或微球。
[0072]
在一个具体的实施方案中，其他抗癌药物的实例包括顺铂、沙利度胺、奥沙利铂、卡铂、米托蒽醌、阿霉素、舒尼替尼、伊马替尼、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、卡莫司汀、司莫司汀、洛莫司汀、链脲霉素、甲氨喋呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁、克拉屈滨、氟达拉滨、长春花碱、长春新碱、紫杉醇、多西紫杉醇、依托泊苷、替尼泊苷、托泊替康、伊立替康、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、丝裂霉素、去甲氧基柔红霉素、表柔比星、布舍瑞林、泼尼松、己酸羟基孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、己烯雌酚、炔雌醇、他莫昔芬、阿那曲唑、氟甲睾酮、氟他胺、比卡鲁胺、硼替佐米和亮丙瑞林中的任意一种或至少两种的组合。
[0073]
在一个具体的实施方案中，本发明的药物组合物和抗癌药物可以同时或相继施用。
[0074]
其他抗癌药物给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药或经皮给药。
[0075]
实施例
[0076]
实施例1：植物来源的细胞外囊泡的制备
[0077]
1.将1包power岩藻聚糖(jan:4580123711060)转移到50ml试管中。
[0078]
2.使用20毫升注射器(无针头)进出5次将其充分均匀。
[0079]
3.分别将1g等分试样加到50ml pbs中。
[0080]
4.用搅拌器搅拌1小时。
[0081]
5.静置15分钟。
[0082]
6.取45ml上清液，在2,000
×
g，4℃条件下离心10分钟。
[0083]
7.取上清液(不要取到沉淀物)。
[0084]
8.通过0.22um过滤器。
[0085]
9.在4℃下以35,000rpm离心70分钟。
[0086]
10.用pbs洗涤沉淀。
[0087]
11.再次在4℃下以35,000rpm离心70分钟。
[0088]
12.丢弃上清液，将底部含有悬浮物的pbs液体转移至1.5ml试管中。
[0089]
13.在4℃、10,000x g条件下离心10分钟(有绿色沉淀，将其除去)。
[0090]
14.将上清液转移到新管中得到植物来源的细胞外囊泡。
[0091]
实施例2：植物来源的细胞外囊泡增强nk细胞颗粒酶含量的作用
[0092]
首先，对不添加细胞外囊泡的人nk细胞(lonza，poieticstm人nk细胞；产品代码：2w-501)的颗粒酶b的量进行定量，将其设置为1.0。然后，以100个细胞外囊泡/人nk细胞的浓度，将人nk细胞用实施例1制备的植物来源的细胞外囊泡孵育48小时，然后计算颗粒酶b的量的相对值。另外设置了对照组。以100个细胞外囊泡/人nk细胞的浓度，将人nk细胞用dc细胞(树突状)来源的细胞外囊泡孵育48小时，然后计算颗粒酶b的量的相对值。dc细胞来源的细胞外囊泡的制备方法在本领域是已知的。颗粒酶b的量通过elisa法，使用granzyme b elisa开发试剂盒(人碱性磷酸酶)(产品代码：3485-1a-6，cosmo bio inc.)遵循所附说明书方案进行定量。实验结果绘制在图1中。
[0093]
如图1所示，添加植物来源的细胞外囊泡后，nk细胞中颗粒酶b的表达增加了8倍以
上。而添加dc细胞来源的细胞外囊泡后，nk细胞中颗粒酶b的表达增加了5倍以上(数据未显示)。
[0094]
实施例3：植物来源的细胞外囊泡增强nk细胞中fas-l表达水平的作用
[0095]
fas-l是在nk细胞表面表达的tnf家族分子，通过与在靶细胞(例如癌细胞)上表达的fas-l受体结合而诱导细胞死亡。因此，定量分析了植物来源的细胞外囊泡是否增加了人nk细胞中fas-l的表达水平。为了定量fas-l，使用elisa试剂盒(fasl，可溶性elisa试剂盒；cosmo bio产品代码：alx-850-246-ki01)通过比色法定量测定人可溶性fasl配体。该方法遵循所附说明书。
[0096]
首先，用试剂盒定量未添加细胞外囊泡的人nk细胞的fas-l量，将该值设置为1.0。然后，以100个细胞外囊泡/人nk细胞的浓度，将人nk细胞用实施例1制备的植物来源的细胞外囊泡孵育72小时，然后计算fasl量的相对值。另外设置了对照组。以100个细胞外囊泡/人nk细胞的浓度，将人nk细胞用dc细胞来源的细胞外囊泡孵育72小时，然后计算fasl量的相对值。实验结果绘制在图2中。
[0097]
如图2显示，加入植物来源的细胞外囊泡后，nk细胞中fas-l的表达增加了3倍。加入dc细胞来源的细胞外囊泡后，nk细胞中fas-l的表达增加了1.9倍(数据未显示)。
[0098]
实施例4：植物来源的细胞外囊泡增强nk细胞中tnf-α表达水平的作用
[0099]
与fas-l相似，作为tnf家族分子的tnf-α与靶细胞(例如癌细胞)上表达的tnf-α受体结合，从而诱导细胞死亡。因此，定量分析了细胞外囊泡是否增加了人nk细胞中tnf-α的表达水平。通过夹心法在包被有捕获抗体的96孔板上通过elisa试剂盒(人tnf-α测定elisa试剂盒；cosmo bio产品代码：ke00068)定量tnf-α。实测时该方法遵循所附说明书。
[0100]
首先，用试剂盒定量不含细胞外囊泡的人nk细胞中tnf-α的量，将其设置为1.0。然后，以100个细胞外囊泡/人nk细胞的浓度，将人nk细胞用实施例1制备的植物来源的细胞外囊泡孵育48小时，然后计算tnf-α量的相对值。另外设置了对照组。以100个细胞外囊泡/人nk细胞的浓度，将人nk细胞用dc细胞来源的细胞外囊泡孵育48小时，然后计算tnf-α量的相对值。实验结果绘制在图3中。
[0101]
如图3中显示，加入植物来源的细胞外囊泡后，nk细胞中的tnf-α表达增加了3.4倍。添加dc细胞来源的细胞外囊泡后，nk细胞中的tnf-α表达增加了2.3倍(数据未显示)。
[0102]
实施例5：植物来源的细胞外囊泡增强nk细胞中il-2分泌
[0103]
白介素2(il-2)是t细胞响应抗原刺激和促有丝分裂原激活产生的主要免疫调节细胞因子。通过il-2受体途径发出的信号对于t细胞增殖很重要，并为正常的免疫反应提供了其他必要的功能。il-2通过il-2受体复合物发出信号。il-2还激活各种免疫细胞，包括b细胞、nk细胞、lak细胞、单核细胞、巨噬细胞和少突胶质细胞。il-2是广泛用于治疗处方的主要细胞因子。因此，定量分析了植物来源的细胞外囊泡是否增加人nk细胞的il-2表达水平。为了定量il-2，使用elisa试剂盒(人il-2测定elisa试剂盒；cosmobio产品代码：ke00017)通过夹心法在包被有捕获抗体的96孔板上通过夹心法定量人可溶性il-2。该方法遵循所附说明书。
[0104]
首先，用试剂盒定量未添加细胞外囊泡的人nk细胞中il-2的量，将其设置为1.0。然后，以100个细胞外囊泡/人nk细胞的浓度，将人nk细胞用实施例1制备的植物来源的细胞外囊泡孵育48小时，然后计算il-2量的相对值。另外设置了对照组。以100个细胞外囊泡/人
nk细胞的浓度，将人nk细胞用dc细胞来源的细胞外囊泡孵育48小时，然后计算il-2量的相对值。实验结果绘制在图4中。
[0105]
如图4所示，加入植物来源的细胞外囊泡后，nk细胞分泌的il-2量增加了2.9倍。添加后，nk细胞分泌的il-2量增加了1.8倍(数据未显示)。
[0106]
讨论
[0107]
相较于未添加任何细胞外囊泡的对照组以及添加了dc细胞来源的细胞外囊泡的对照组，本发明的植物来源的细胞外囊泡可以显著增加nk细胞的蛋白质(包括穿孔素和颗粒酶)的释放量，和tnf家族分子和il-2的表达量。因此nk细胞被有效激活，从而克服了以往nk细胞自身攻击癌细胞能力降低的问题，增强了nk细胞对癌细胞的攻击能力，增强了nk细胞对癌症的治疗效果，能够特异性抑制癌细胞。
[0108]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。