大籽獐牙菜总黄酮的提取及其在清除氧自由基中的应用

本发明涉及一种大籽獐牙菜总黄酮的制备方法，并对大籽獐牙菜总黄酮的体外dpph自由基清除活性，羟基自由基清除活性和超氧阴离子消除活性进行研究，以期用于制备自由基清除活性的保健品和药物中，属于植物有效成分分离领域和医药领域。

背景技术：

1、大籽獐牙菜（学名： swertia macrosperma (c. b. clarke) c. b. clarke）是龙胆科獐牙菜属植物，别名龙胆草。主要产于西藏、四川等高海拔地区，贵州、广西、湖北等地也有分布，是一种传统的民间全草用药材，在藏药中常作为“蒂达”和“藏茵陈”的替代品，主要用来治疗肝胆疾病，具有清热解毒、疏肝利胆之功效。迄今文献报道从大籽獐牙菜中分离得到的化合物主要包括黄酮及苷元、山酮、环烯醚萜、甾体及三萜类等。药理研究表明该属植物具有抗氧化、强心、抗菌、抗内毒素、降血糖、保肝、及抗肝脏自发性脂质过氧化等作用。熊成文等研究了大籽樟牙菜抗氧化作用，通过测定大籽樟牙菜不同提取部位对血浆总抗氧化能力（t-aoc）、对家兔肝脏自发性脂质过氧化作用，发现大籽璋牙菜具有很强的提高血浆总抗氧化能力及抗肝脏自发性脂质过氧化的作用。目前，对于大籽獐牙菜提取物及活性部位对体外dpph自由基清除活性，羟基自由基清除活性和超氧阴离子消除活性的研究尚未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种大籽獐牙菜总黄酮的制备方法，并测定了总黄酮的体外dpph自由基清除活性，羟基自由基清除活性和超氧阴离子消除活性，为大籽獐牙菜提取物制备自由基清除活性的保健品和药物研究提供数据支撑。

2、一、大籽獐牙菜总黄酮的制备

3、本发明大籽獐牙菜总黄酮的制备方法，包括以下工艺步骤：

4、（1）将大籽獐牙菜洗净，阴干，再粉碎至细度为0.1~3.0 厘米。

5、（2）将大籽獐牙菜粉用醇-水混合溶液进行提取，提取液经过滤，浓缩，得到总黄酮粗提物。

6、醇-水混合溶液中，醇为甲醇或乙醇，醇在溶液中的体积百分数为30~100%。

7、总黄酮粗提物可以通过加热回流法提取，具体提取工艺为：大籽獐牙菜粉与醇-水混合溶液的质量比为1:5~1:15，加热温度为50~100℃，提取2~3次，每次提取1.0~2.0小时。

8、总黄酮粗提物也可以通过超声波辅助提取，具体提取工艺为：大籽獐牙菜粉与醇-水混合溶液的质量比为1:5~1:15，加热温度为50~80℃，提取2~3次，每次提取0.5~1.0小时。

9、（3）将总黄酮粗提物用水充分溶解后加入d-101大孔吸附树脂柱中，静置吸附24小时；用3.5倍量的60%甲醇溶液洗脱，洗脱液分别浓缩至稠膏，得到大籽獐牙菜总黄酮。

10、（4）使用亚硝酸钠-硝酸铝法测定大籽獐牙菜总黄酮的含量。结果显示，加热回流法提取的浸膏中总黄酮含量最高为67.0%。超声波辅助提取浸膏中总黄酮含量最高为65.0%。

11、二、大籽獐牙菜总黄酮的活性测定

12、1、大籽獐牙菜总黄酮体外dpph自由基清除活性

13、实验步骤：精密称取 40.0 毫克的 dpph 试剂，加100 毫升无水乙醇溶解，避光保存。分别准确吸取2.0 毫升不同质量浓度的样品溶液，加入2.0 毫升l 0.4 毫克/毫升dpph溶液，混合均匀，室温下避光反应30 分钟后，用无水乙醇调零，测定溶液在517 纳米处测定吸光度a1；然后用无水乙醇代替样品溶液后在同一波长处测定吸光度为a0；用无水乙醇代替dpph溶液后测定的吸光度为a2。用维生素c（vc）作阳性对照组，每个样品重复测三次取均值代入计算dpph自由基清除率的公式中进行抗氧化活性研究。计算公式如下：

14、dpph自由基清除率（%）=[a0-(a1-a2)/a0]×100%

15、式中，a0表示dpph溶液+无水乙醇的吸光度；a1表示dpph自由基溶液+样品溶液的吸光度；a2表示样品溶液+无水乙醇的吸光度。

16、图1为大籽獐牙菜提取液对dpph自由基的消除能力。由图 1 可以看出，加热回流法和超声波法提取大籽獐牙菜中总黄酮的样品浓度与dpph 自由基的清除能力均具有较好的量效关系。当样品溶液的浓度从0.05毫克/毫升增加到 0.8 毫克/毫升时，加热回流样品对dpph 自由基的消除能力从50.66%增加到92.11%，超声提取组对 dpph 自由基的消除能力从34.98%增加到90.64%；从0.08毫克/毫升增加到1.6毫克/毫升时，加热回流组对dpph自由基的清除能力从92.11%增加到92.54%，超声组对dpph自由基的清除能力从90.64%增加到90.96%，dpph自由基清除能力趋于平缓；样品浓度为1.6毫克/毫升时，加热回流组对dpph自由基清除能力最大达到92.54%，超声组对dpph自由基清除能力最大达到90.96%。阳性对照组维生素c（vc）部分的不同浓度均对dpph自由基具有较强的清除能力，随着维生素c（vc）浓度的升高dpph自由基清除能力增加不明显，当维生素c（vc）浓度达到0.4 毫克/毫升后，dpph自由基清除率达到平衡，继续增加维生素c（vc）浓度dpph自由基的消除能力不再发生变化。

17、2、大籽獐牙菜总黄酮体外羟基自由基清除活性

18、实验步骤：取不同浓度系列的测试提取的大籽獐牙菜总黄酮2 毫升，再分别加入9毫摩尔/升的feso4·7h2o溶液0.5 毫升和4.5 摩尔/升的水杨酸-乙醇溶液0.5 毫升，摇匀后加入h2o2溶液，在37℃条件下恒温水浴放置30 分钟，取出后510 纳米波长处测定总黄酮对·oh自由基的清除能力，以维生素c（vc）为对照品，通过测定不同浓度的总黄酮对羟基自由基的清除能力来评价其抗氧化活性。

19、羟基自由基清除率（%）=[a0-(a1-a2)/a0]×100%

20、式中，a0表示2 毫升水+0.5 毫升 feso4·7h2o溶液+2 毫升水杨酸溶液+2 毫升h2o2溶液的吸光度；a1表示2 毫升样品溶液+0.5 毫升l feso4·7h2o溶液+2 毫升水杨酸溶液+2 毫升 h2o2溶液的吸光度；a2表示2 毫升样品溶+0.5 毫升 feso4·7h2o溶液+2 毫升水杨酸溶液+2 毫升水的吸光度。

21、图2为大籽獐牙菜提取液对羟基自由基的消除率。如图2所示，以加热回流法提取总黄酮和以超声辅助提取的及维生素c（vc）c均对•oh自由基具有一定的清除能力，在0.1~2.5 毫克/毫升质量浓度范围内，随着浓度的增加对•oh自由基清除能力先增大再趋于平缓，且在同一质量浓度下，加热回流法提取的总黄酮对•oh自由基的清除能力较超声辅助提取总黄酮强，表明回流法和超声辅助提取的大籽獐牙菜中的总黄酮对•oh自由基均具有较好的清除能力。

22、3、大籽獐牙菜总黄酮体外超氧阴离子消除活性

23、实验步骤：分别取不同浓度系列的测试提取的大籽獐牙菜总黄酮1 毫升，再加3毫升 50毫摩尔/升 tris-hcl缓冲液，并在25℃条件下水浴反应20 分钟后，加0.6 毫升 20毫摩尔/升邻苯三酚溶液，保温4 分钟后滴加1 毫升 10 毫摩尔/升盐酸终止该反应。最后在325 纳米波长处测定以上样品溶液对超氧阴离子的清除能力，相同条件下测定空白对照溶液吸光度，以维生素c（vc）为阳性对照组。

24、超氧阴离子的清除率（%）=[a0-(a1-a2)/a0]×100%

25、式中，a0表示1 毫升蒸馏水+3 毫升 tris-hcl缓冲液+0.6 毫升邻苯三酚溶液+1毫升盐酸的吸光度；a1表示1 毫升样液+3 毫升tris-hcl缓冲液+0.6 毫升邻苯三酚溶液+1毫升盐酸的吸光度；a2表示1 毫升样液+3 毫升 tris-hcl缓冲液+0.6 毫升蒸馏水+1 毫升盐酸的吸光度。

26、图3为大籽獐牙菜提取液中的总黄酮对超氧阴离子消率。由图 3可知，不同提取法制备的大籽獐牙菜中的总黄酮及维生素c（vc）均对超氧阴离子具有一定的清除能力，在质量浓度为0.05~1.0 毫克/毫升质量浓度范围内，随着提取液质量浓度的增加对超氧阴离子的清除率也逐渐增大，这说明二者之间存在明显的量效关系。加热回流法和超声辅助提取的提取液在质量浓度为0.8 毫克/毫升时，提取液中的总黄酮对超氧阴离子清除率分别为46.43%，30.23%，分别相当于该浓度下维生素c（vc）清除超氧阴离子能力的51.83%及33.75%，表明大籽獐牙菜总黄酮对超氧阴离子具有较好的清除能力。

27、综上所述，本发明通过加热回流法、超声波辅助法提取了大籽獐牙菜总黄酮粗提物，再将总黄酮粗提物用水充分溶解后加入d-101大孔吸附树脂柱中静置吸附后；用60%甲醇溶液洗脱，洗脱液分别浓缩至稠膏，得到大籽獐牙菜总黄酮。总黄酮具有良好的体外dpph自由基清除活性，羟基自由基清除活性和超氧阴离子消除活性，可以作为活性成分用于制备清除自由基的保健品和药物。