细胞组合物及其医疗用途的制作方法

1.本发明属于生物技术和生物医药领域，涉及使用细胞治疗剂治疗卵巢早衰(premature ovarian failure，pof)的方法。具体地说，本发明首先涉及从动员外周血(mobilized peripheral blood，mpb，亦可简称为外周血)中快速分离制备动员外周血浓缩细胞的细胞治疗剂，接着将其与gm-csf(粒细胞巨噬细胞刺激因子，亦称为粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，granulocyte/macrophage colony-stimulating factor，gmcsf)配制成细胞治疗剂的组合物，进而使用此种动员外周血浓缩细胞组合物治疗早发性卵巢功能不全和卵巢早衰的方法。使用本发明方法可以有效的提高从动员外周血中分离动员外周血浓缩细胞的效率，提供一种安全、高效、简捷获得动员外周血浓缩细胞用于治疗卵巢早衰和卵巢功能不全例如早发性卵巢功能不全的方法。本发明还通过使所制得的外周血浓缩细胞与gm-csf组合为治疗卵巢早衰提供了一个新的有效途径。


背景技术：

2.卵巢早衰(premature ovarian failure，pof)，是指由于卵巢功能衰竭，导致女性40岁之前闭经、不孕的现象。pof是一种以闭经、不孕、雌激素缺乏、卵泡减少和促性腺激素增高为特征的疾病，并伴有一系列低雌激素症状如：潮热多汗、面部潮红、性欲低下等，严重影响女性的身心健康。此外，pof的女性，患骨质疏松症、心血管疾病和老年痴呆的风险增加。pof是导致女性不孕的重要原因之一。育龄女性pof的发病率约1-3％，且呈上升和年轻化趋势。
3.根据欧洲人类生殖与胚胎学学会的指南(eshre)，pof的诊断标准：少经或闭经至少4个月，间隔4周以上的两次fsh水平升高》40iu/l。卵巢早衰病因不明，可能与遗传和自身免疫性疾病、环境因素以及医源性和特发性情况有关，尚无有效的治疗方法。激素替代疗法(hrt)是pof最常见的治疗方法之一，但效果并不理想，而且已被证明会增加静脉血栓、乳腺癌和卵巢癌的风险。pof除了少经、闭经、不孕等症状，还可出现潮热、多汗、焦虑、抑郁、心悸、失眠等更年期症状，可能加快女性衰老，导致骨质疏松、心血管疾病、痴呆症等绝经后疾病，影响女性生活质量和寿命。
4.pof病因复杂，尚未完全阐明，可能与自身免疫应答、感染、遗传因素、化疗、放疗、手术等治疗效果及内分泌功能障碍有关，尚无有效的治疗方法。目前，pof的最常用的治疗方法是激素替代疗法(hormone replacement therapy，hrt)。该疗法虽然对pof的临床症状具有一定的缓解作用，然而，hrt不能从根本上修复受损的卵巢，恢复卵巢功能。此外，研究表明，长期hrt治疗增加心脏病和中风的风险，可能会增加乳腺癌和卵巢癌的风险。因此，需要新的治疗策略来恢复pof患者的卵巢功能。
5.造血干细胞(hematopoietic stem cells，hscs)是一种可以分化为血液循环中的红细胞、白细胞和血小板的细胞亚群。间充质干细胞(mesenchymal stem cell，mscs)是一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群，mscs通过旁分泌多种生长因子，对hscs起到支持的作用，维持骨髓造血微环境的稳定。目前，骨髓移植
成为治疗血液疾病的有效手段，但是骨髓移植由于费用高，来源缺乏等诸多因素限制，逐渐由外周血造血干细胞移植替代，外周血造血干细胞(pbsc)通过集落刺激因子的动员，使pbsc变得更易采集，利用pbsc的造血和提高免疫力的功能，来治疗急、慢性白血病、多发性骨髓瘤等血液肿瘤疾病。
6.正常外周血中，外周血造血干细胞(pbsc)含量很少，通过集落刺激因子，把骨髓中的干细胞动员到外周血中，以便更好的采集pbscs，是动员外周血的一种方式。外周血造血干细胞动员是外周血造血干细胞移植(pbsct)中的重要环节，直接影响pbsct的疗效。目前在临床上干细胞动员的方案有三种，即大剂量化疗、单用造血生长因子(hgf)和二者联合。
7.正常情况下，pbsc数目很少，只占有形核细胞的0.1％左右，尽管形态上无法鉴别pbsc，但是可以根据它们的免疫表型来区别。一般认为pbsc包括外周血中的cd34+细胞等。通过集落刺激因子动员后，一般第4～6天外周血干细胞出现高峰，此时通过外周静脉单采术获得pbsc，干细胞和粒细胞在离心后与红细胞和血浆成分分离，红细胞和血浆回输给供者。
8.动员外周血浓缩细胞是将动员外周血经过离心、分离后获得的有核细胞的浓缩物。此类浓缩细胞中包含富集的造血干细胞(hscs)和间充质干细胞(mscs)，以及大量的多种细胞生长因子。hscs可以分化为血液循环中的红细胞、白细胞和血小板。mscs是一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。动员外周血浓缩细胞中含有血管内皮生长因子(vegf)、血小板衍生生长因子(pdgf)、转化生长因子β(tgf-β)、肝细胞生长因子(hgf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、胰岛素样生长因子i(igf-i)、骨形态发生蛋白(bmp-2、bmp-7)和白细胞介素(il-1，il-6，il-8)等多种生长因子和细胞因子。
9.动员外周血浓缩细胞具有抗炎、免疫调节特性、促血管生成、促进组织再生修复等作用。临床前和初步临床研究证实，动员外周血浓缩细胞通过改善卵巢微环境，促进血管生成，促进卵泡发育，增加窦状卵泡数量，促进排卵，从而改善卵巢功能，是治疗pof患者潜在的治疗方法。
10.然而，动员外周血在传统上采用手工操作方式以密度梯度离心法进行分离，存在操作复杂、耗时长、易污染、结果重复性差等非常棘手的问题。本领域技术人员期待有一种操作简单、耗时短、不易受到污染、结果可重复性好等一个或者多个方面有益效果的处理动员外周血以获得动员外周血浓缩物即动员外周血浓缩细胞的方法。此一技术进步已在本研究团队的中国专利申请号2021116067853中得以实现。
11.粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)主要由t细胞和巨噬细胞产生，能够诱导粒细胞前体和巨噬细胞前体细胞呈集落生长，故简称为粒-巨细胞集落刺激因子。gm-csf在体内的主要生物学作用是维持粒细胞系和单核细胞系细胞的存活、促进生长、诱导分化和增强吞噬功能和杀菌作用；诱导树突状细胞成熟和功能分布。临床上使用的粒细胞巨噬细胞刺激因子通常为重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子，其通常适用于癌症化疗和在用骨髓抑制疗法时所引起的白细胞减少症，亦适用于治疗骨髓衰竭患者的白细胞低下，也可预防白细胞减少时可能潜在的感染并发症，还能使感染引起的中性粒细胞减少的恢复加快。
12.现有的治疗卵巢早衰的方法仍然有待改进。因此，本领域技术人员还期待提供一种治疗卵巢早衰的方法例如使用动员外周血浓缩细胞治疗剂治疗卵巢早衰的方法。


技术实现要素：

13.本发明的一个目的在于提供一种制备外周血例如动员外周血浓缩细胞的方法，期待该种方法具有操作简单、耗时短、不易受到污染、结果可重复性好等一个或者多个方面的有益效果；或者，本发明的一个目的在于提供一种新的治疗卵巢早衰的方法，该新的方法通过使动员外周血浓缩细胞和gm-csf配制成组合治疗剂得以实现。已经出人意料地发现，本发明通过使用封闭式的pxp细胞自动分离系统制备动员外周血浓缩细胞，和/或通过使获得的动员外周血浓缩细胞与gm-csf配制成组合治疗剂来治疗卵巢早衰，能够实现上述一个或者多个目的，本发明基于此类发现而得以完成。
14.为此，本发明第一方面提供了一种制备外周血例如动员外周血浓缩细胞的方法，其包括如下步骤：
15.(1)提供生物样本外周血例如动员外周血浓缩细胞，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；
16.(2)取下细胞自动分离系统的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离系统是封闭式的pxp分离系统，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)datatrak软件处理系统；
17.(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
[0018][0019][0020]
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
[0021]
4a)p1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
[0022]
4b)p2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
[0023]
4c)p3期进一步将处理室中的细胞分层，p4期降低离心力以进一步除去红细胞；
[0024]
4d)p5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至p6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
[0025]
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“p”即合格状态，从控制模块中取出分离
杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的外周血例如动员外周血浓缩细胞。
[0026]
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)提供的生物样本的体积为20～200ml。
[0027]
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)中另外抽取1ml样本以备检测。
[0028]
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为枸橼酸钠溶液。
[0029]
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.5％枸橼酸钠溶液。
[0030]
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.5％枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.12mg/ml磷脂酰胆碱。
[0031]
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂与生物样本的体积比为1：12。
[0032]
根据本发明第一方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60℃搅拌使溶解，加水至全量，0.22μm微孔滤膜过滤，121℃热压灭菌，即得。
[0033]
根据本发明第一方面的方法，其还包括以下步骤：(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用datatrak软件处理系统处理离心过程中所捕获的数据。
[0034]
进一步的，本发明第二方面提供了一种外周血例如动员外周血浓缩细胞，其是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
[0035]
(1)提供生物样本外周血例如动员外周血，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；
[0036]
(2)取下细胞自动分离系统的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离系统是封闭式的pxp分离系统，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)datatrak软件处理系统；
[0037]
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
[0038]
程序号加速减速相对离心力/rcf时间/minp19920008.5p299502p3995002p499501p5992500.5p699501
[0039]
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
[0040]
4a)p1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
[0041]
4b)p2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
[0042]
4c)p3期进一步将处理室中的细胞分层，p4期降低离心力以进一步除去红细胞；
[0043]
4d)p5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至p6期降低离心力，使细胞浓缩层通过
输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
[0044]
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“p”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的外周血例如动员外周血浓缩细胞。
[0045]
根据本发明第二方面的外周血例如动员外周血浓缩细胞，其中步骤(1)提供的生物样本的体积为20～200ml。
[0046]
根据本发明第二方面的外周血例如动员外周血浓缩细胞，其中步骤(1)中另外抽取1ml样本以备检测。
[0047]
根据本发明第二方面的外周血例如动员外周血浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂为枸橼酸钠溶液。
[0048]
根据本发明第二方面的外周血例如动员外周血浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.5％枸橼酸钠溶液。
[0049]
根据本发明第二方面的外周血例如动员外周血浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.5％枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.12mg/ml磷脂酰胆碱。
[0050]
根据本发明第二方面的外周血例如动员外周血浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂与生物样本的体积比为1：12。
[0051]
根据本发明第二方面的外周血例如动员外周血浓缩细胞，其中步骤(1)所用抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60℃搅拌使溶解，加水至全量，0.22μm微孔滤膜过滤，121℃热压灭菌，即得。
[0052]
根据本发明第二方面的外周血例如动员外周血浓缩细胞，其还包括以下步骤：(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用datatrak软件处理系统处理离心过程中所捕获的数据。
[0053]
进一步的，本发明第三方面提供了外周血例如动员外周血浓缩细胞在制备用于治疗卵巢早衰的细胞治疗剂中的用途，所述外周血例如动员外周血浓缩细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
[0054]
(1)提供生物样本外周血例如动员外周血，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；
[0055]
(2)取下细胞自动分离系统的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离系统是封闭式的pxp分离系统，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)datatrak软件处理系统；
[0056]
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
[0057]
程序号加速减速相对离心力/rcf时间/minp19920008.5p299502p3995002p499501
p5992500.5p699501
[0058]
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
[0059]
4a)p1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
[0060]
4b)p2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
[0061]
4c)p3期进一步将处理室中的细胞分层，p4期降低离心力以进一步除去红细胞；
[0062]
4d)p5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至p6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
[0063]
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“p”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的外周血例如动员外周血浓缩细胞。
[0064]
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)提供的生物样本的体积为20～200ml。
[0065]
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)中另外抽取1ml样本以备检测。
[0066]
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)所用抗凝剂为枸橼酸钠溶液。
[0067]
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.5％枸橼酸钠溶液。
[0068]
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.5％枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.12mg/ml磷脂酰胆碱。
[0069]
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)所用抗凝剂与生物样本的体积比为1：12。
[0070]
根据本发明第三方面的用途，其中步骤(1)所用抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60℃搅拌使溶解，加水至全量，0.22μm微孔滤膜过滤，121℃热压灭菌，即得。
[0071]
根据本发明第三方面的用途，其还包括以下步骤：(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用datatrak软件处理系统处理离心过程中所捕获的数据。
[0072]
进一步的，本发明第四方面提供了治疗卵巢早衰的方法，该方法包括给予有需要的受试者施用包含治疗有效量的外周血例如动员外周血浓缩细胞的细胞治疗剂，所述外周血例如动员外周血浓缩细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的：
[0073]
(1)提供生物样本外周血例如动员外周血，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用；
[0074]
(2)取下细胞自动分离系统的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离系统是封闭式的pxp分离系统，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)datatrak软件处理系统；
[0075]
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
[0076][0077][0078]
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
[0079]
4a)p1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
[0080]
4b)p2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
[0081]
4c)p3期进一步将处理室中的细胞分层，p4期降低离心力以进一步除去红细胞；
[0082]
4d)p5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至p6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
[0083]
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“p”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的外周血例如动员外周血浓缩细胞。
[0084]
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)提供的生物样本的体积为20～200ml。
[0085]
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)中另外抽取1ml样本以备检测。
[0086]
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为枸橼酸钠溶液。
[0087]
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.5％枸橼酸钠溶液。
[0088]
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂为3.5％枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.12mg/ml磷脂酰胆碱。
[0089]
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂与生物样本的体积比为1：12。
[0090]
根据本发明第四方面的方法，其中步骤(1)所用抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60℃搅拌使溶解，加水至全量，0.22μm微孔滤膜过滤，121℃热压灭菌，即得。
[0091]
根据本发明第四方面的方法，其还包括以下步骤：(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用datatrak软件处理系统处理离心过程中所捕获的数据。
[0092]
进一步的，本发明第五方面提供了一种由动员外周血浓缩细胞制成的细胞组合物，其包含浓缩细胞、粒细胞巨噬细胞刺激因子和任选的赋形剂。
[0093]
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中所述浓缩细胞与粒细胞巨噬细胞刺激因子的比例为，浓缩细胞以cd45
+
细胞数计5x10^6个细胞：10～15ng粒细胞巨噬细胞刺激因子；例如比例为，浓缩细胞以cd45
+
细胞数计5x10^6个细胞：12.5ng粒细胞巨噬细胞刺激因
子。
[0094]
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中所述赋形剂为生理盐水或5％葡萄糖溶液。
[0095]
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中所述赋形剂为生理盐水，粒细胞巨噬细胞刺激因子在组合物中的浓度为10～15ng/ml，例如为12.5ng/ml。
[0096]
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中所述粒细胞巨噬细胞刺激因子是人粒细胞巨噬细胞刺激因子。
[0097]
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中所述粒细胞巨噬细胞刺激因子是重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子。
[0098]
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中所述浓缩细胞如本发明第二方面任一实施方案所述。
[0099]
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中还包含谷氨酰胺和亚硒酸钠。
[0100]
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中还包含谷氨酰胺和亚硒酸钠，粒细胞巨噬细胞刺激因子与谷氨酰胺和亚硒酸钠在组合物中的重量比为12.5ng：0.1～0.5mg：5～20μg。
[0101]
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中还包含谷氨酰胺和亚硒酸钠，粒细胞巨噬细胞刺激因子与谷氨酰胺和亚硒酸钠在组合物中的重量比为12.5ng：0.2～0.3mg：10～15μg。
[0102]
根据本发明第五方面的细胞组合物，其中还包含谷氨酰胺和亚硒酸钠，粒细胞巨噬细胞刺激因子与谷氨酰胺和亚硒酸钠在组合物中的重量比为12.5ng：0.25mg：12.5μg。
[0103]
根据本发明第五方面的细胞组合物，其包含：cd45
+
细胞数4～6x10^6的浓缩细胞、10～15ng的gmcsf、0.1～0.5mg谷氨酰胺、5～20μg亚硒酸钠、生理盐水适量至1ml。
[0104]
根据本发明第五方面的细胞组合物，其包含：cd45
+
细胞数4～6x10^6的浓缩细胞、10～15ng的gmcsf、0.2～0.3mg谷氨酰胺、10～15μg亚硒酸钠、生理盐水适量至1ml。
[0105]
根据本发明第五方面的细胞组合物，其包含：cd45
+
细胞数5x10^6的浓缩细胞、12.5ng的gmcsf、0.2～0.3mg谷氨酰胺、10～15μg亚硒酸钠、生理盐水适量至1ml。
[0106]
根据本发明第五方面的细胞组合物，其包含：cd45
+
细胞数5x10^6的浓缩细胞、12.5ng的gmcsf、0.25mg谷氨酰胺、12.5μg亚硒酸钠、生理盐水适量至1ml。
[0107]
进一步的，本发明第六方面提供了本发明第五方面任一项所述细胞组合物在制备用于治疗卵巢早衰的药物中的用途。
[0108]
进一步的，本发明第七方面提供了制备本发明第五方面任一项所述细胞组合物的方法，其包括使规定量的浓缩细胞、粒细胞巨噬细胞刺激因子、谷氨酰胺、亚硒酸钠、和任选的赋形剂混合配制成无菌制剂的步骤。
[0109]
本文所述的短语“cd45
+
细胞数5x10^6的浓缩细胞”中的5x10^6是指5乘以10的6次方，其余类似表述亦具有相同含义。
[0110]
在本发明上述各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
[0111]
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不
会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
[0112]
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
[0113]
本发明使用pxp自动化细胞快速处理系统，应用自动分离和浓缩的封闭式系统，安全、高效、简捷获得bmac的方法，为bmac用于治疗pof患者的临床应用奠定了基础。本发明提供的快速分离获得外周血例如动员外周血浓缩细胞的方法，该方法将取自人的外周血例如动员外周血，使用封闭式自动化细胞分离系统，分离获得外周血例如动员外周血浓缩细胞。本发明获得的外周血例如动员外周血浓缩细胞作为治疗卵巢损伤的活性成分，能够促进血管生成、卵泡发育，从而改善卵巢功能。
[0114]
现有的研究业已证实，污染性红细胞与干细胞/祖细胞功能的下降有关，红细胞污染细胞浓缩物被认为会降低细胞治疗的效果。为了更好地发挥细胞治疗的潜力，行业迫切需要能提高靶细胞纯度和污染性红细胞去除率的新处理系统。
[0115]
本发明具体实验中使用的细胞分离系统为自动分离系统，其型号为80065-01，供应商为深圳博雅感知医疗科技有限公司，生产商为美国thermogenesis公司。创新的pxp系统解决了当前市场上现有系统的许多缺陷。pxp系统使临床医生能够在几乎没有红细胞污染的情况下，通常少于起始样本的5％，迅速获得很高的干细胞和祖细胞回收率。
[0116]
pxp系统针对开发和使用细胞治疗技术的临床机构在手术室环境下快速、高效、无菌的细胞处理需求，是一种相当高效的手术室即时系统(point-of-care)产品。作为前沿的自动化细胞快速处理系统，pxp系统不需要细胞分离介质或沉淀剂，可以同时处理多个样本，mnc和cd34+、cd45+细胞回收率高，能够让临床医生在医院外科中心或者诊所实现30分钟之内从生物样品(例如外周血例如动员外周血)中高效提取干细胞，并且红细胞的去除率超过90％。此外，该pxp系统还配备了专利的datatrak软件来追踪捕获数据，以方便为客户提供gmp流程控制和报告信息。
[0117]
pxp系统目前已经通过多国卫生部的医疗器械产品注册，这套设备系统的临床应用场景广泛，多用于骨科疾病的细胞疗法，有机构通过pxp系统实现了手术室环境的高效、高质量的自体骨髓干细胞制备，将治疗中心的骨科疾病细胞疗法带上了新的台阶，也为治疗中心争取了长足的竞争力。本发明将pxp系统用于处理外周血例如动员外周血，能够实时快速自动化处理外周血例如动员外周血细胞，确保单个核细胞(mnc)的回收率，能够同时处理多个外周血例如动员外周血单元，并且不需要细胞分离介质或沉淀剂。与上述骨髓干细胞类似，外周血细胞亦可用于卵巢早衰的治疗。
[0118]
本发明具体试验中使用的pxp系统的优点包括但不限于：稳定优异的mnc(单核细胞)和cd34+、cd45+细胞回收率、30分钟内快速处理外周血例如动员外周血样本、95％以上的红细胞去除率、自动化封闭式无菌系统、快速准确的数据追踪和文档记录、样本处理数据可以通过datatrak软件上传到计算机，提供符合gmp要求的生产记录和报告信息。
[0119]
研究表明，正常情况下，外周血循环中仅有极少量造血干细胞，应激、内毒素、剧烈
运动、化疗及细胞因子可显著增加cd45
+
和cd34+等造血干细胞数，即造血干细胞的动员，临床上后两者的动员最有效。这一发现使外周血成为造血干细胞移植(hsct)中干细胞的重要来源。外周血动员大会(即外周造血干细胞动员)是使骨髓中的造血干细胞释放到外周血中，使外周血中的干/祖细胞比例明显增高的方法。正常人外周血中的干/祖细胞的含量占有核细胞数的1％左右，经有效动员后，骨髓中的造血干细胞会释放到外周血中，使外周血中的干/祖细胞比例明显增高。外周血动员的方法是本领域公知的成熟技术，动员外周血的获得亦可通过常规技术获得。
[0120]
本发明通过使用pxp系统进行细胞分离获得了令人满意的效果。
[0121]
gm-csf可以是人粒细胞巨噬细胞刺激因子，亦可以是重组粒细胞巨噬细胞刺激因子，其已载入多个版本的中国药典并有诸多品牌的产品被批准用于临床。在本发明中，若未另外说明，试验所用gm-csf是市售注射用重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(s19991012，规格750000iu/75μg，10iu/ng)的产品，配制组合物时若有必要可以预先用0.9％氯化钠注射液稀释至适宜浓度。gm-csf(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，或粒细胞巨噬细胞刺激因子)，其作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。gm-csf是临床上用于各种原因引起的白细胞或粒细胞减少症的药物，其能兴奋骨髓的造血功能、刺激粒细胞、单核细胞、t细胞的增殖，并能促进单核细胞和粒细胞的成熟。此外，gm-csf还能克服放疗和化疗引起的骨髓毒性，缩短肿瘤化疗时中性粒细胞减少时间，使患者易于耐受化疗。gm-csf能够通过增强单核细胞、粒细胞、嗜酸性细胞和巨噬细胞功能，进而提高机体抗肿瘤及抗感染免疫力。
[0122]
本发明通过使经pxp系统分离获得的动员外周血浓缩细胞与gm-csf组合，使用卵巢早衰模型进行验证，获得了积极的效果。
具体实施方式
[0123]
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。
[0124]
在本发明中，如未另外说明，具体实验中使用的细胞分离系统为自动分离系统，其在本发明中亦可简称为pxp系统、pxp细胞自动分离系统、pxp自动分离系统、pxp分离系统等。实验中使用的该pxp系统的型号为80065-01，供应商为深圳博雅感知医疗科技有限公司，生产商为美国thermogenesis公司。在本发明中，术语“外周血浓缩细胞”亦可称为“外周血浓缩细胞制剂”，如无特别的语境，二者具有相同含义。
[0125]
实施例1：快速分离制备动员外周血浓缩细胞
[0126]
(1)提供生物样本动员外周血(可以处理20～200ml体积的样本)，使其置于含有抗凝剂的无菌袋中备用，另抽取1ml样本以备检测；所述抗凝剂为3.5％枸橼酸钠溶液，其中增补添加0.5mg/ml组氨酸和0.12mg/ml磷脂酰胆碱，抗凝剂与生物样本的体积比为1：12；抗凝剂的配制方法为：使枸橼酸钠、组氨酸和磷脂酰胆碱加至适量水中，加热至60℃搅拌使溶
解，加水至全量，0.22μm微孔滤膜过滤，121℃热压灭菌，即得；
[0127]
(2)取下细胞自动分离系统的输入管上的护帽，将注射器连接到输入管鲁尔锁定接头上，以缓慢而稳定的速度通过血栓过滤器，将抗凝的生物样本转移到一次性无菌分离杯中，沿水平轴摇动混合样本；所述细胞自动分离系统是封闭式的pxp分离系统，其由四个部件组成：a)一次性无菌分离杯、b)控制模块、c)用于传输数据的分离底座、d)datatrak软件处理系统；
[0128]
(3)将一次性分离杯放入控制模块中，离心前控制模块状态显示为“0”，将分离杯/控制模块组件称重，配平后，放置于可编程的离心机中，并按照如下程序设定离心机的参数：
[0129]
程序号加速减速相对离心力/rcf时间/minp19920008.5p299502p3995002p499501p5992500.5p699501
[0130]
(4)启动离心机进行离心，进程如下：
[0131]
4a)p1期使生物样本中的细胞通过离心密度分层在一次性分离杯中分为下中上三个组分：红细胞层、细胞浓缩层、血浆层；
[0132]
4b)p2期使大部分红细胞进入红细胞回收舱；
[0133]
4c)p3期进一步将处理室中的细胞分层，p4期降低离心力以进一步除去红细胞；
[0134]
4d)p5期使细胞浓缩层和血浆进一步分层，至p6期降低离心力，使细胞浓缩层通过输送管转移至回收舱室，血浆保留在中央舱室中；
[0135]
(5)离心完成后，确认控制模块窗口显示“p”即合格状态，从控制模块中取出分离杯，将注射器连接至分离杯与回收舱室连通的输出管上，收集得到的动员外周血浓缩细胞；
[0136]
(6)使分离杯和控制模块置于分离底座上以传输数据并用datatrak软件处理系统处理离心过程中所捕获的数据。
[0137]
本实施例1对收集的10份生物样本人动员外周血(动员外周血可通过本领域公知的方法获取，例如本发明的生物样本是健康供者每天皮下注射重组人粒细胞刺激因子注射液(rhg-csf，立生素)7.5μg/kg进行外周血干细胞动员，连续注射5天，于第6天采集的外周血)进行细胞分离制备，获得10份动员外周血浓缩细胞，分别标记为no.1～no.10。
[0138]
试验例1：分析动员外周血和动员外周血浓缩细胞中mnc回收率
[0139]
使用实施例1的方法，对收集的10份人动员外周血(分离前体积在157～164ml范围内)进行细胞分离；接着，参考中国专利申请号2021116067853记载的方法，对各分离级分进行细胞检测，10份样品的结果：输入外周血均值为161.2ml、输出外周血浓缩细胞均值为17.7ml、红细胞(rbc)去除率均值为98.1％、单个核细胞(mnc)回收率均值为97.3％、mnc浓度平均提升9.11倍。例如某一份外周血(no.1)的结果：分离前体积＝159.4ml、终体积＝17.8ml、红细胞去除率＝98.3％、mnc回收率＝97.2％、mnc浓缩倍数＝8.96。
[0140]
结果显示，使用pxp动分离系统能够以操作简单、耗时短、不易受到污染、结果可重
复性好的方式富集动员外周血中的mnc，同时去除大部分红细胞。
[0141]
试验例2：动员外周血和动员外周血浓缩细胞样本中的细胞活率
[0142]
针对试验例1涉及的10个样本进行考察。细胞活率是表示细胞是否具有生物学功能的最直观的指标。动员外周血样本采集24-36小时内(t《36小时)，使用fc500流式细胞仪，应用7-aad染色法，分析动员外周血、动员外周血浓缩细胞中的细胞活率。pxp处理前的10份外周血样本细胞活率＝85.62
±
3.23％、pxp处理后的10份外周血样本细胞活率＝97.87
±
2.42％，例如某一份外周血样本(no.1)的结果：外周血的细胞活率＝86.07％、外周血浓缩细胞的细胞活率＝97.53％。显示外周血浓缩细胞样本中的细胞活率显著高于外周血细胞活率。
[0143]
试验例3：动员外周血和动员外周血浓缩细胞样本中cd45+、cd34+细胞计数
[0144]
针对试验例1涉及的10个样本进行考察。在fc500流式细胞仪上，应用7-aad染色法，对所有处理前、处理后的动员外周血及其浓缩细胞样本中的cd45+和cd34+细胞数量和细胞活率进行了分析，结果：
[0145]
cd45+活细胞数量方面，动员外周血样本＝(14.16
±
2.44)x10^6/ml、动员外周血浓缩细胞样本＝(97.53
±
6.36)x10^6/ml，增加6.9倍；
[0146]
cd34+活细胞数量方面，动员外周血样本＝(92.3
±
7.9)x10^3/ml、动员外周血浓缩细胞样本＝(674.2
±
25.1)x10^3/ml，增加7.3倍。
[0147]
试验例4：动员外周血样本无菌检测
[0148]
针对试验例1涉及的10个样本进行考察。使用革兰氏染色法进行无菌检测，制备动员外周血、动员外周血浓缩细胞样本的涂片，用甲醇固定，染色后测试，结果：10个动员外周血样本的革兰氏染色分析样本涂片均未见微生物，10个动员外周血浓缩细胞样本的革兰氏染色分析样本涂片均未见微生物。
[0149]
本发明使用pxp系统制备动员外周血浓缩细胞的过程具有快速、封闭、全程无菌的特点。
[0150]
试验例5：细胞水平有效性研究
[0151]
本发明使用pxp系统制备的动员外周血浓缩细胞是一种细胞制剂的注射液，其中含有多种干细胞成分，包括造血干细胞(hscs)，间充质干细胞(mscs)，内皮祖细胞(epcs)，以及多种细胞因子，如血管内皮生长因子(vegf)，基质细胞衍生因子(sdf-1)，内皮抑素(entostatin)等，促进新血管生成和内皮细胞迁移。
[0152]
本试验例针对试验例1涉及的10个样本进行考察，通过cfu集落形成能力评价动员外周血浓缩细胞的干细胞生物学效力，elisa定量检测动员外周血浓缩细胞中富含的细胞因子。
[0153]
5.1、干细胞生物学效力—cfu集落形成实验
[0154]
动员外周血浓缩细胞干细胞生物学效力(potency assays)，通过体外cfu集落形成实验，鉴定分析祖/干细胞的集落形成能力，表征动员外周血浓缩细胞混合细胞中的细胞干性。采用cfu-h(造血祖/干细胞)，cfu-f(基质祖细胞)对动员外周血和动员外周血浓缩细胞样本中多种干细胞的效能进行了分析，结果：
[0155]
cfu-h(造血祖/干细胞)方面，动员外周血样本＝(23.3
±
4.1)x10^3/ml、动员外周血浓缩细胞样本＝(196.4
±
21.6)x10^3/ml，增加8.4倍；
[0156]
cfu-f(基质祖细胞)方面，动员外周血样本＝(42.6
±
5.3)x10^3/ml、动员外周血浓缩细胞样本＝(347.6
±
30.3)x10^3/ml，增加8.2倍。
[0157]
结果表明，pxp系统能够有效地富集干细胞，同时维持干细胞的生物学效力。
[0158]
5.2、细胞因子定量分析
[0159]
pxp系统制备的动员外周血浓缩细胞注射液中含有多种细胞因子。酶联免疫吸附实验(elisa)定量检测分析动员外周血和动员外周血浓缩细胞样品中，转化生长因子-β(tgf-β)、血管内皮生长因子(vegf)和肝细胞生长因子(hgf)水平，结果：
[0160]
动员外周血和动员外周血浓缩细胞的tgf-β分别为27.2
±
4.1pg/ml和212.3
±
12.4pg/ml，
[0161]
动员外周血和动员外周血浓缩细胞的vegf分别为19.3
±
3.6pg/ml和167.3
±
14.6pg/ml，
[0162]
动员外周血和动员外周血浓缩细胞的hgf分别为195.2
±
18.4pg/ml和1084.3
±
33.7pg/ml。
[0163]
结果显示，bmac中的tgf-β、vegf和hgf，显著高于bma中的tgf-β、vegf和hgf水平(p《0.01)，表明pxp系统能够有效地浓缩富集细胞生长因子。
[0164]
试验例6：动员外周血浓缩细胞治疗卵巢早衰(pof)的有效性
[0165]
中国专利申请号2021116067853中使用外周血浓缩细胞进行了治疗卵巢早衰(pof)的有效性研究。本试验例使用上文制备的外周血浓缩细胞配合gm-csf(本文亦记作gmcsf)进行pof的有效性研究。
[0166]
(1)建立pof小鼠模型
[0167]
给8周龄雌性c57bl/6小鼠腹腔注射50mg/kg/day环磷酰胺(ctx)，连续腹腔注射15d，每天同一时间注射，建立卵巢早衰(pof)小鼠模型。对照组不做任何处理。pof造模完成后进行动员外周血浓缩细胞移植治疗，模型动物随机分组。
[0168]
(2)通过激素水平、卵泡数和生育测试等指标来评估卵巢的储备功能。
[0169]
a.激素水平
[0170]
动物分组：
[0171]
对照组(n＝20)、
[0172]
pof模型组(n＝20)、
[0173]
动员外周血浓缩细胞治疗组(n＝20)、
[0174]
动员外周血浓缩细胞+gmcsf治疗组(n＝20)。
[0175]
动员外周血浓缩细胞治疗组小鼠，分别于pof建模后第1天，每只动物尾静脉注射给予动员外周血浓缩细胞组合物200μl(该200μl的浓缩细胞组合物为实施例1涉及的no.1号浓缩细胞样本，用无菌生理盐水稀释制成以cd45
+
细胞计浓度为4x10^6细胞/200μl的溶液)；
[0176]
动员外周血浓缩细胞+gmcsf治疗组小鼠，分别于pof建模后第1天，每只动物尾静脉注射给予动员外周血浓缩细胞gmcsf组合物200μl；
[0177]
pof模型组注射等体积生理盐水；对照组不作注射处理；
[0178]
细胞移植后各组同等正常给予饮食和饮水。
[0179]
注：以上动员外周血浓缩细胞+gmcsf治疗组给予的动员外周血浓缩细胞gmcsf组
合物(其可简称为外周血细胞gmcsf组合物)，其每200μl中包含：实施例1所得no.1号动员外周血浓缩细胞样本适量以cd45
+
细胞数计为1x10^6、2.5ng的gmcsf、无菌生理盐水定容，即得组合物；该组合物在配制后2～4℃温度条件下保存并在4小时内完成注射给药，gmcsf为市售冻干粉针剂。
[0180]
经动员外周血浓缩细胞移植后14天和28天，每组分别取10只小鼠，眼眶采血，分离血清，-20℃保存。酶联免疫吸附试验(elisa)分析雌二醇(e2)、促卵泡素(fsh)的水平(具体方法参考相丽论文(相丽，等，人胎盘间充质干细胞移植通过降低超氧化物歧化酶1和解耦联蛋白-2的表达提高卵巢功能，中华生殖与避孕杂志，2018年02期)方法进行)，结果见下表。
[0181][0182]
结果显示：与pof模型组相比，动员外周血浓缩细胞组小鼠血清中e2水平在28d升高，fsh水平下降，均具有显著性差异(p《0.05)；另外，已经发现，通过与gm-csf组合使用，可以显著地减少外周血浓缩细胞的用量并且可以获得基本相同的效果。
[0183]
b.小鼠卵巢组织的卵泡计数
[0184]
动员外周血浓缩细胞移植后28天，每组分别取10只小鼠，处死，取小鼠左侧卵巢组织于4％多聚甲醛固定，将固定后的组织进行系列酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，切片厚度5um，进行he染色，显微镜下观察。
[0185]
结果显示：相比于对照组，pof模型组小鼠初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡数量明显减少，闭锁卵泡数量明显增加；动员外周血浓缩细胞治疗后28天，各级卵泡数均有不同程度的恢复，颗粒细胞生长增加，凋亡减少，卵巢上皮细胞形态稳定，初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡数量明显增加，闭锁卵泡数量明显减少。动员外周血浓缩细胞移植后28天各级卵泡计数，与pof组比较有显著差异，具体结果见下表。
[0186][0187]
与pof模型组比较，**p《0.01。
[0188]
c.小鼠生育能力观察
[0189]
在动员外周血浓缩细胞移植后第28天，将雌雄小鼠按2：1比例合笼饲养，统计小鼠的生育率，并对小鼠的产仔数进行比较，观察动员外周血浓缩细胞移植对小鼠卵巢功能的修复作用，结果显示动员外周血浓缩细胞组与pof组比较有显著差异。小鼠产仔数比较结果如下表。
[0190]
组别对照组pof模型组外周血浓缩细胞组外周血浓缩细胞+gmcsf治疗组产仔数13～15只1～2只7～9只8～10只
[0191]
根据上文结果可见，动员外周血浓缩细胞移植治疗可明显改善pof小鼠受损卵巢的储备功能，卵泡数增加，雌孕激素升高，小鼠生育力得到恢复，为动员外周血浓缩细胞应用于pof的临床治疗提供了实验依据。
[0192]
试验例7：动员外周血浓缩细胞+gmcsf组合物
[0193]
以上试验例6所用动员外周血浓缩细胞+gmcsf组合物在配制后尽快完成注射给药，本发明人发现，该呈液体状态的组合物在4℃条件下放置12小时和24小时后，gm-csf的生物学活性呈现下降的趋势，并且通过向该液体组合物中添加微量谷氨酰胺和亚硒酸钠能够显著缓解这种生物学活性下降的趋势，具体试验如下。
[0194]
配方a：使用实施例1所得no.1～no.5的5种动员外周血浓缩细胞，照如下配方制成5种呈液体状态的组合物分别记为组合物ano.1～组合物ano.5：包含cd45
+
细胞数5x10^6的外周血浓缩细胞、12.5ng(即125iu)的gmcsf、无菌生理盐水适量至1ml；
[0195]
配方b：照上述配方a但不添加外周血浓缩细胞，制成呈液体状态的组合物，记为组合物b；
[0196]
配方c：使用实施例1所得no.1～no.5的5种外周血浓缩细胞，照上述配方a但还添加谷氨酰胺(至终浓度0.25mg/ml)和亚硒酸钠(至终浓度12.5μg/ml)，制成5种呈液体状态的组合物，分别记为组合物cno.1～组合物cno.5；
[0197]
配方d：使用实施例1所得no.1～no.5的5种外周血浓缩细胞，照上述配方a但还添加谷氨酰胺(至终浓度0.25mg/ml)，制成5种呈液体状态的组合物，分别记为组合物dno.1～组合物dno.5；
[0198]
配方e：使用实施例1所得no.1～no.5的5种外周血浓缩细胞，照上述配方a但还添加亚硒酸钠(至终浓度12.5μg/ml)，制成5种呈液体状态的组合物，分别记为组合物eno.1～组合物eno.5。
[0199]
上述各种组合物的配制方法为本领域技术人员熟知的常规方法，例如，在无菌操作条件下，将规定量冻干粉状态的gmcsf及任选的谷氨酰胺和任选的亚硒酸钠用无菌生理盐水定量溶解至规定体积，另外将外周血浓缩细胞用无菌生理盐水稀释至以cd45
+
细胞计的适宜浓度，按配方比例将两种溶液用无菌生理盐水稀释至规定浓度，用玻璃瓶分装，即得。
[0200]
将上述5种配方的各组合物置4℃条件下放置，分别于0h、12h、24h取样，照中国药典2015年版四部附录之“3526重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子生物学活性测定法”，测定各组合物在规定时间的生物学活性(iu/ml)；对于某一组合物，以其12h或24h的生物学活性除以0h的生物学活性再乘以100％所得百分数，即为该组合物在该时间点gmcsf生物学活性的残余百分数。
[0201]
结果：
[0202]
配方a至配方e的全部组合物在0h的生物学活性均在126.4～133.2iu/ml范围内例如组合物ano.1在0h的生物学活性为131.6iu/ml；
[0203]
配方b组合物12h残余百分数为98.1％，
[0204]
配方c的全部组合物12h残余百分数均在98～103％范围内例如组合物cno.1之12h残余百分数为102.3％，
[0205]
配方a、配方d、配方e的全部组合物12h残余百分数均在81～85％范围内例如组合物ano.1在12h的残余百分数为82.1％；
[0206]
配方b组合物24h残余百分数为93.5％，
[0207]
配方c的全部组合物24h残余百分数均在92～95％范围内例如组合物cno.1之24h残余百分数为93.1％，
[0208]
配方a、配方d、配方e的全部组合物24h残余百分数均在65～71％范围内例如组合物ano.1在24h的残余百分数为69.1％。
[0209]
这些结果表明，包含有细胞的组合中gmcsf生物学活性下降较快，当向该种组合物中添加微量谷氨酰胺和亚硒酸钠后可以显著克服这种生物学活性下降的现象。
[0210]
另外，照上文试验例3方法测定cd45+活细胞数量，结果：
[0211]
配方a和配方c至配方e的全部组合物在0h的cd45+活细胞数量均在496～537x10^4/ml范围内例如组合物ano.1在0h的cd45+活细胞数量为526.1x10^4/ml，
[0212]
配方a和配方c至配方e的全部组合物在24h的cd45+活细胞数量均在157～233x10^4/ml范围内例如组合物ano.1在24h的cd45+活细胞数量为214.6x10^4/ml；
[0213]
这些结果表明，各组合物在不同时间点的cd45+活细胞数量无明显差异，进而可以预期谷氨酰胺和亚硒酸钠不会影响细胞的生物学活性。因此，尽管配方a的外周血浓缩细胞+gmcsf组合物能够呈现优良的治疗卵巢早衰的生物学效果，然而当增补添加少量谷氨酰胺和亚硒酸钠后能够显著改善组合物中gmcsf生物学活性的稳定性，并且组合物中的活细胞无明显差异，这种gmcsf生物学活性稳定性的改善对于治疗应用来讲将是极其有意义的。
[0214]
另外，由于gmcsf廉价易得，通过与可获得性差的外周血浓缩细胞组合可以显著降低细胞的用量但仍然能够获得优良的治疗卵巢早衰的生物学效果。
[0215]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论
从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。