一种真菌提取物在制备溃疡性结肠炎治疗药物中的应用

1.本发明属于溃疡性结肠炎技术领域，尤其涉及一种真菌提取物在制备溃疡性结肠炎治疗药物中的应用。


背景技术：

2.溃疡性结肠炎是一种慢性非特异性炎症性肠病，患者的临床症状主要是腹痛、腹泻、黏液脓血便等肠道症状，重症患者常常伴有高热及中毒症状。近年来，溃疡性结肠炎在我国以及世界范围内的发病率都呈现出明显增加的趋势。
3.在溃疡性结肠炎的发展过程中，肠道的炎性环境会导致肠黏膜屏障结构损伤，导致氧化应激反应异常，引起肠上皮黏膜通透性增加，使肠腔内抗原进入黏膜和黏膜下层，诱发免疫紊乱并加重肠道炎症。因此，通过抑制肠道炎性和降低肠道损伤将有助于治疗溃疡性结肠炎。
4.目前，临床上常用的溃疡性结肠炎的治疗药物主要为氨基水杨酸类制剂，类固醇激素类制剂和免疫抑制剂类，尽管这些药物较为有效，但是容易引起严重的副反应。因此，开发新的并且安全的溃疡性结肠炎治疗药物是十分必要的。
5.agrocybin多肽是从田头菇中提取的一种多肽，其ncbi的gi号为91208278，现有的研究表明agrocybin多肽可能具有抗细菌，真菌和病毒的作用，然而关于agrocybin多肽在溃疡性结肠炎中的作用尚无研究涉及。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供agrocybin多肽在制备治疗溃疡性结肠炎中的新用途。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：第一方面，本发明提供了一种真菌提取物在制备溃疡性结肠炎治疗药物中的应用，所述真菌提取物为agrocybin多肽。
8.优选地，所述agrocybin多肽减少巨噬细胞分泌炎症因子，所述炎症因子为tnf-a和il-6。
9.优选地，所述agrocybin多肽减少肠道上皮通透性，所述agrocybin多肽增加肠道上皮细胞连接蛋白zo-1和occludin的蛋白表达。
10.优选地，所述agrocybin多肽抑制nf-kb信号通路。
11.第二方面，本发明提供agrocybin多肽在制备抑制巨噬细胞分泌炎症因子的药物中的应用。
12.优选地，所述炎症因子为tnf-a和il-6。
13.第三方面，本发明提供了agrocybin多肽在制备降低肠道上皮细胞通透性的药物中的应用。
14.优选地，所述药物通过增加细胞连接蛋白zo-1和occludin的蛋白表达来降低肠道上皮细胞通透性。
15.本发明的有益效果是：本发明提供了agrocybin多肽在抑制巨噬细胞分泌炎症因子和降低肠道上皮细胞通透性的新用途，为进一步开发agrocybin多肽提供了可能，同时为治疗溃疡性结肠炎提供了一种新的安全有效的药物。
附图说明
16.图1为agrocybin多肽对于raw264.7细胞的细胞毒性的检测结果；图2为agrocybin多肽对于caco-2细胞的细胞毒性的检测结果；图3为agrocybin多肽对于raw264.7细胞分泌的tnf-a的影响；图4为agrocybin多肽对于raw264.7细胞分泌的il-6的影响；图5为agrocybin多肽对于raw264.7细胞的nf-kb通路的影响；图6为agrocybin多肽对于caco-2细胞的电阻值的影响；图7为agrocybin多肽对于caco-2细胞的连接蛋白zo-1和occludin的蛋白表达的影响。
具体实施方式
17.所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
18.实施例1（1）将raw264.7和caco-2按照2.5
×
104/ml分别接种于96孔板中，每孔接种100μl；（2）将96孔板放置在细胞培养箱中，培养过夜后，实验组1-5加入含有25,50,100,200,400
µ
mol/l的agrocybin多肽，对照组更换新的培养基，每组设置有3个重复孔，处理24h后，加入10μl cck-8后孵育3h后，检测450nm od值，计算细胞的存活率。
19.检测的结果如图1（raw264.7细胞）和图2（caco-2细胞）所示，从图中我们可以得出agrocybin多肽对于raw264.7和caco-2细胞不会产生毒性。
20.实施例2（1）按照2
×
105个/孔将raw264.7细胞接种于24孔板中，轻轻十字摇晃使细胞在培养基中均匀分布后，将24孔板放入到细胞培养箱中进行培养；（2）过夜培养后，实验组1和2分别添加含有200,400
µ
mol/l的agrocybin多肽预处理2h，更换培养基加入含有500ng/ml lps的培养基处理10h，对照组1只更换培养基不添加药物，对照组2只添加lps，每组处理设置有3个重复；（3）处理结束后，使用elisa法测定上清中的tnf-a和il-6的含量，检测的结果如图3和图4所示。
21.从图3和图4中，我们可以得出使用agrocybin多肽预处理后可以有效的降低lps导致的tnf-a和il-6上调，即agrocybin多肽可以有效的抑制lps导致的炎症。
22.实施例3（1）按照5
×
105个/孔将raw264.7细胞接种于6孔板中，轻轻十字摇晃使细胞在培养基中均匀分布后，将6孔板放入到细胞培养箱中进行培养；
（2）过夜培养后，实验组1和2分别添加含有200,400
µ
mol/l的agrocybin多肽预处理2h，更换培养基加入含有500ng/ml lps的培养基处理10h，对照组1只更换培养基不添加药物，对照组2只添加lps，每组处理设置有3个重复；（3）处理结束后，将培养基吸除并加入pbs清洗细胞，清洗2遍后，加入100μl的细胞蛋白裂解液，将细胞刮下后，将细胞收集到离心管中，冰上裂解30min后，离心收集上清；（4）使用bca法测定各组的蛋白浓度后，加入loading buffer混匀后，将离心管置于水浴锅中，95℃加热10min；（5）配置10%分离胶，使用异丙醇压平后，去除异丙醇，使用双蒸水清洗后，将配置好的5%浓缩胶加入，插入梳子用于后续实验；（6）将不同实验组的蛋白样品加入到样品孔中，同时添加蛋白marker，加入电泳液进行电泳；（7）浓缩胶电压为90v，分离胶电压为100v，待溴酚蓝到达胶体底部时，停止电泳；（8）按照红色面-海绵-三层滤纸-pvdf膜-聚丙烯胺凝胶-三层滤纸-海绵-黑色面的顺序组装电转夹，组装好后，加入电转液，恒流250ma转膜90min；（9）电转结束后，将pvdf转移至封闭液中，室温下封闭1h；（10）参照抗体说明书配置nf-kb，p-nf-kb，gapdh的一抗，将一抗孵育pvdf膜，4℃孵育过夜；（11）孵育结束后，使用pbs洗膜三次，每次10min；（12）洗膜后，孵育二抗，室温下孵育2h后，去除二抗，使用pbs清洗3次后，进行显色和拍照。
23.实验结果如5所示，从图中我们可以得出lps刺激后会明显提高p-nf-kb的蛋白表达，而agrocybin多肽可以降低p-nf-kb的蛋白表达，说明agrocybin多肽可以通过nf-kb通路来发挥抗炎作用。
24.实施例4（1）将caco-2制备成15
×
104个/ml的细胞悬液，将1ml的细胞悬液加入12孔transwell板的上层微孔膜中，下层加入2ml细胞完全培养液，连续培养21天得到单层细胞；（2）实验组1和2分别添加含有200,400
µ
mol/l的agrocybin多肽预处理2h，更换培养基加入含有500ng/ml lps的培养基处理10h，对照组1只更换培养基不添加药物，对照组2只添加lps，每组处理设置有3个重复；（3）处理结束后，使用细胞电阻仪检测各组的电阻值。
25.实验结果如图6所示，lps可以显著的降低ter值的大小，而使用agrocybin多肽预处理后，则可以显著的提高ter值，因此我们得出agrocybin多肽处理可以有效的降低肠道上皮细胞的细胞屏障通透性。
26.实施例5（1）将caco-2制备成15
×
104个/ml的细胞悬液，将1ml的细胞悬液加入12孔transwell板的上层微孔膜中，下层加入2ml细胞完全培养液，连续培养21天得到单层细胞；（2）实验组1和2分别添加含有200,400
µ
mol/l的agrocybin多肽预处理2h，更换培养基加入含有500ng/ml lps的培养基处理10h，对照组1只更换培养基不添加药物，对照组2只添加lps，每组处理设置有3个重复；
（3）处理结束后，将培养吸除并加入pbs清洗细胞，清洗2遍后，加入100μl的细胞蛋白裂解液，将细胞刮下后，将细胞收集到离心管中，冰上裂解30min后，离心收集上清；（4）使用bca法测定各组的蛋白浓度后，加入loading buffer混匀后，将离心管置于水浴锅中，95℃加热10min；（5）配置10%分离胶，使用异丙醇压平后，去除异丙醇，使用双蒸水清洗后，将配置好的5%浓缩胶加入，插入梳子用于后续实验；（6）将不同实验组的蛋白样品加入到样品孔中，同时添加蛋白marker，加入电泳液进行电泳；（7）浓缩胶电压为90v，分离胶电压为100v，待溴酚蓝到达胶体底部时，停止电泳；（8）按照红色面-海绵-三层滤纸-pvdf膜-聚丙烯胺凝胶-三层滤纸-海绵-黑色面的顺序组装电转夹，组装好后，加入电转液，恒流250ma转膜90min；（9）电转结束后，将pvdf转移至封闭液中，室温下封闭1h；（10）参照抗体说明书配置zo-1，occludin，gapdh的一抗，将一抗孵育pvdf膜，4℃孵育过夜；（11）孵育结束后，使用pbs洗膜三次，每次10min；（12）洗膜后，孵育二抗，室温下孵育2h后，去除二抗，使用pbs清洗3次后，进行显色和拍照。
27.实验结果如图7所示，lps可以有效的降低肠道上皮细胞连接蛋白zo-1和occludin的蛋白表达水平，而agrocybin多肽处理可以有效的提高zo-1和occludin的蛋白表达水平，因此我们得出agrocybin多肽可以通过提高zo-1和occludin的蛋白表达来降低肠道上皮细胞的细胞屏障通透性。
28.综合上述的实施例，本发明得出如下结论agrocybin多肽能够通过条件p-nf-kb来降低巨噬细胞产生炎症因子tnf-a和il-6，同时通过提供zo-1和occludin的蛋白表达来降低肠道上皮细胞的通透性，从而可以将其用于治疗溃疡性结肠炎。
29.最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。