一种重组Ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料的制作方法

一种重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料。


背景技术：

2.皮肤浅表性擦伤、切割伤、小创口、激光、光子、果酸换肤、微整形术后是临床上比较常见皮肤损伤，如果创面处理不当，会造成伤口的微生物感染，有时会深入组织内部，导致组织坏死，严重的则会危及生命。所以，当皮肤出现浅表性损伤时，应及时进行清创处理与保护。
3.目前，临床上对伤口的处理还是采用传统方法，用碘伏、双氧水或生理盐水等消毒剂清创处理后用棉纱布进行覆盖。传统纱布敷料，质地柔软，有较强的吸收能力并可以防止创面渗液积聚，对创面有一定的保护作用。但随着人们对伤口愈合研究的深入，认识到使用敷料的目的远远不止是为了覆盖创面，敷料还必须能帮助伤口愈合。
4.以前的观点认为，应尽可能的为伤口创造一个干燥的环境，减少感染的机会，有利于伤口的愈合。但是，近年来的研究表明，在湿润的环境中伤口愈合得更快。那么，传统纱布敷料就显出了它的局限性，如对创面愈合无促进作用，无保湿作用，肉芽组织容易长入纱布网眼中致粘连结痂，易在换药时给创面造成第二次损伤，并且愈后病灶易形成瘢痕等。所以寻找一种方便、安全性高、保湿性能好的创面敷料产品显得尤为重要。
5.随着人们生活水平改善，激光技术在对整形美容的应用上越来越广泛，人们对激光美容后皮肤的修复效果要求也越来越高，然而，针对于激光整形美容术后辅助治疗的可体外吸收医用用品较少。
6.现在人们生活、工作节奏都很快，没有更多的时间为了一个皮肤的小伤口去到医疗机构进行处理，希望能有一款产品在家就能很方便的护理好伤口，保护创面不被微生物感染。随着材料学及工业学的进步，为新型伤口敷料的研发提供了很好的基础。
7.因此，迫切需要研究开发具有良好修复效果的医用产品，以填充国内空白市场。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料，且由该敷料制备得到的产品具有促进皮肤损伤部位的修复功能，能够接外敷于创面，形成保护层，遮蔽伤口，为伤口提供一个湿润的愈合环境，解决了现有产品对微创面伤口处理易导致感染、伤口愈合率低下、干燥环境易使皮肤组织与纱布敷料粘连对创面造成二次损伤的技术问题。
9.本发明通过以下技术方案实现：
10.一种重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料，所述重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料主要由以下质量分数的原料制备得到：
11.重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白0.03wt％-0.10wt％，d-(+)-海藻糖二水合
物0.06wt％-0.18wt％，卡波姆0.2wt％-0.8wt％，丁二醇1.5wt％-3.5wt％，甘油1wt％-2.5wt％，三乙醇胺0.1wt％-0.5wt％，余量为纯化水。
12.作为优选地，所述重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料主要由以下质量分数的原料制备得到：
13.重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白0.07wt％，d-(+)-海藻糖二水合物0.15wt％，卡波姆0.5wt％，丁二醇3wt％，甘油2wt％，三乙醇胺0.35wt％，余量为纯化水。
14.上述该重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料中，主要是由三螺旋结构的重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白与d-(+)-海藻糖二水合物、甘油、卡波姆、丁二醇、三乙醇胺组成。
15.其中，重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白具有三螺旋结构，三重螺旋(多个三重螺旋)是一组三个相同的几何螺旋，它们具有相同的轴，但沿轴的平移度不同。这意味着每个螺旋线与中心轴保持相同的距离。与单螺旋一样，三螺旋可以通过其螺距，直径和惯用性来表征。三螺旋的实例包括三链dna、三联rna的胶原螺旋和胶原蛋白样蛋白。氨基酸序列的排列时，每隔两个氨基酸(脯氨酸(proline)或羟脯氨酸(hydroxyproline))就有一个甘氨酸(glycine)，甘氨酸(glycine)形成的弯曲填满螺旋的内部，脯氨酸(proline)和羟脯氨酸(hydroxyproline)链在螺旋周围形成光滑的弯曲，由此形成紧密稳定的三维螺旋结构。这种稳定的三螺旋结构式通过三个氨基酸的重复序列形成的
‑‑‑
每隔两个氨基酸是一个甘氨酸(glycine)。甘氨酸(glycine)是一种小型的氨基酸，能够很好的组装在螺旋内部。链中剩余位置被其他氨基酸取代：如脯氨酸(proline)和羟脯氨酸(hydroxyproline)填充。重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白具有能够增加弹性，赋予了胶原蛋白保湿、增加弹性、抗皱、祛斑等的功效，可在受损组织表面形成一层保护膜，隔离、屏障皮肤创面；具有较好的细胞粘附性，促进损伤部位的修复；可调节创面氧张力，提高细胞活性，使受损老化的皮肤得到填充和修复。d-(+)-海藻糖二水合物具有优异的保持细胞活力和生物大分子活性的特性，具有成膜特性和稳定性；丁二醇具有保湿的作用，甘油是最为普遍的保湿剂，能提高护肤用品的溶解性和渗透性，可调节肌肤的水合功能，增加含水量，改善肌肤干燥，还可促进受损细胞的自修复，保护肌肤避免外界环境的刺激。
16.重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白：cas号：2406308-23-2，分子式：c
1798h2819n603o601
s2，分子量：43.6kda，重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白是由水溶性胶原肽构成，具有胶原蛋白的特征性结构：g-x-y重复结构，g代表甘氨酸，y代表脯氨酸为主。溶解性：溶解度＞5wt％(20℃)，热稳定性：发酵液加热到100℃，30min，稳定。与人体胶原序列的相似度：100wt％。重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白来自于酵母发酵产物，酵母菌是真核细胞，具有与人细胞类似的蛋白质翻译后修饰能力，胶原蛋白合成后会经过修饰加工成为具有生理活性的胶原蛋白，可被人体细胞识别并粘附，通过信号传导途径激发细胞合成胶原蛋白。在本品中利用其优良的三螺旋结构特性，蛋白质的功能决定于它的结构，只有具有完整三螺旋稳定结构的胶原蛋白才能发挥它所有的功效。这种稳定的三螺旋结构式通过三个氨基酸的重复序列形成的
‑‑‑
每隔两个氨基酸是一个甘氨酸(glycine)。甘氨酸(glycine)是一种小型的氨基酸，能够很好的组装在螺旋内部，达到在皮肤表面成膜以及细胞粘附的作用。
17.d-(+)-海藻糖二水合物：cas号：6138-23-4，分子式:c
12h22o11
·
2h2o，收载于《中国
药典》四部；在医学上已经成功地应用海藻糖替代血浆蛋白作为血液制品、疫苗、淋巴细胞、细胞组织等生物活性物质的稳定剂，海藻糖可应用于研究用生物试剂的保存，例如各种工具酶、细胞膜、细胞器、抗体、抗原及病毒等，使得生命科学研究更为方便快捷有效；海藻糖在化妆品上的应用是基于其具有优异的保持细胞活力和生物大分子活性的特性。皮肤细胞，尤其是表皮细胞在高温、高寒、干燥、强紫外线辐射等环境下，极易失去水分发生角质化，甚至死亡脱落使皮肤受损。海藻糖在这种情况下能够在细胞表层形成一层特殊的保护膜，从膜上析出的粘液不仅滋润着皮肤细胞，还具有将外来的热量辐射出去的功能。从而保护皮肤不致受损。在本品中利用其既有优良的成膜性能，同是也是良好的稳定剂。
18.一种重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料在制备重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白凝胶成品或重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白原液成品中的应用。
19.一种重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白凝胶成品的制备方法，采用所述的重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料进行制备，包括如下步骤：
20.(1)按照相应质量分数选取卡波姆和纯化水，在均质速度为20-30hz下进行乳化处理，获得备用物a；
21.(2)按照相应质量分数选取三乙醇胺和纯化水混合溶解，获得备用物b；
22.(3)按照相应质量分数选取重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白和纯化水混合溶解，获得备用物c；
23.(4)按照相应质量分数选取甘油、丁二醇和d-(+)-海藻糖二水合物搅拌混合后与备用物a混合、均质处理后加热至80-90℃时保温20-30min，冷却至50-60℃时，加入备用物b搅拌；
24.(5)继续降温至不高于45℃时，加入备用物c，均质处理至料体分散均匀澄清透明，过滤，放料，获得成品。
25.作为优选地，所述步骤(4)中，甘油、丁二醇和d-(+)-海藻糖二水合物搅拌混合时，搅拌时长为3-5分钟，搅拌速度为600-800转/分钟；
26.所述均质处理时，采用高速均质5-8分钟，均质速度为30-40hz；
27.所述加入备用物b搅拌时，采用低速20-30hz均质,并充分搅拌2-3分钟，搅拌速度为15-20hz进行搅拌处理。
28.作为优选地，所述步骤(5)中，均质处理时长为3-5分钟，均质处理速度为15-20hz；
29.所述过滤时采用200-400目滤布。
30.一种重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白原液成品的制备方法，采用所述的重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料进行制备，包括如下步骤：
31.(1)按照相应质量分数选取三乙醇胺和纯化水混合溶解，获得备用物a；
32.(2)按照相应质量分数选取重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白和纯化水混合溶解，获得备用物b；
33.(3)按照相应质量分数选取甘油、丁二醇和d-(+)-海藻糖二水合物搅拌混合后，加入卡波姆和纯化水进行加热、均质处理后保温20-30min，冷却至50-60℃时，加入备用物a搅拌混合；
34.(4)继续降温至不高于45℃时，加入备用物b，均质处理至料体分散均匀澄清透明，过滤，放料，获得成品。
35.作为优选地，所述步骤(3)中，甘油、丁二醇和d-(+)-海藻糖二水合物搅拌混合时，搅拌时长为3-5分钟，搅拌速度为600-800转/分钟；
36.所述加热至85-92℃时，采用高速均质5-8分钟，均质速度为30-40hz进行均质处理；
37.所述加入备用物a搅拌混合时，采用低速20-30hz均质,并充分搅拌2-3分钟，搅拌速度为15-20hz进行搅拌处理。
38.作为优选地，所述步骤(4)中，均质处理时长为3-5分钟，均质处理速度为15-20hz；
39.所述过滤时采用200-400目滤布。
40.与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
41.(一)本发明提供了一种重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料，其主要是由三螺旋结构的重组ⅲ型胶原蛋白与d-(+)-海藻糖二水合物、甘油、卡波姆、丁二醇、三乙醇胺组成。
42.其中，重组ⅲ型胶原蛋白：利用所含重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白具有的三螺旋结构，与创面中断裂的胶原蛋白通过分子间范德华力形成超螺旋结构，这种网状的超螺旋结构可在受损组织表面形成一层保护膜，隔离、屏障皮肤创面；
②
重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白具有较好的细胞粘附性(重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白其带电荷的氨基酸残基与细胞表面的电荷，通过物理的电荷相吸作用发生细胞黏附)，为细胞提供外部支撑，以促进损伤部位的修复。
③
依据湿性愈合理论，湿性环境能增加表面细胞的迁移速度，可调节创面氧张力，促进毛细血管形成，有利于坏死细胞和纤维蛋白溶解吸收，能促进多种生长因子释放，加速伤口愈合，添加的多种保湿剂及成膜剂，促使产品在皮肤表层形成一层透明的水化膜，阻止皮肤内部水分蒸发，起到物理屏障作用，为创面愈合提供湿润性微环境。
43.(二)该重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料产品具有滋养抗衰、紧致除皱、保湿美白、安全修复四个方面的功能。其具体表现为能够与人体表皮组织的细胞外基质完美地结合，为保持细胞活性提供非常好的组织环境，有效抑制细胞的凋亡，从而实现表层皮肤的抗衰老功效；凭借重组ⅲ型胶原蛋白的三螺旋稳定结构形成致密规整的超螺旋胶原纤维网，从而保持皮肤角质层水分并促进皮肤组织的新陈代谢，增强表层皮肤的血液循环，让皱纹从表层皮肤中消失，起到紧致除皱的作用
44.(三)该重组ⅲ型胶原蛋白含有的大量亲水性氨基酸不仅可以为细胞活性创造良好的环境，同时也能够为表层皮肤提供重组的结合水。保证皮肤含水量的同时，也间接作用到了皮肤的光泽程度，能够起到美白的效果。而它具备的三螺旋稳定结构更是拥有非常强的锁水能力，可以激活细胞的代谢功能，降低表层皮肤的色素沉着，避免形成色斑，为皮肤的白皙提供充足水源；具有与人体人身产生的iii型胶原蛋白100wt％相似的功能性结构序列，使得排异反应出现的概率降到了最低且对不同细胞系的存活率影响为0，安全级别，同时其还可以协助皮肤细胞正常生长与更新，重建皮肤原有的轮廓，达到修复的效果。
45.(四)该重组ⅲ型胶原蛋白发挥其优秀的生物学活性、组织相容性，促使真皮层成纤维母细胞增生，提高细胞活性，并被成纤维细胞作为合成胶原蛋白的原料吸收，刺激细胞更多的合成胶原蛋白、使受损老化的皮肤得到填充和修复，重建网状结构，增强受损皮肤的扩张力，恢复皮肤弹性。使肌肤达到抗衰修复、安肌祛敏、祛疤消印、补水亮肤。
46.(五)重组ⅲ型胶原蛋白是利用基因工程技术，以人胶原ⅲ型原始基因序列经过优化重组表达得到与人体天然胶原氨基酸序列高度一致，重组优化表达得到的重组ⅲ型胶原蛋白，其富含亲水性氨基酸残基，具有较高的生物学活性、亲水性、低免疫排斥反应。同时，还具有引导上皮细胞快速迁移受损部位的趋向性，促进皮肤再生速度和缩短创伤愈合时间，从而恢复皮肤屏障功能。
47.(六)本发明在以重组ⅲ型胶原蛋白为主要原材料研发一种医用重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料，主要用于皮肤的浅二度创伤、激光美容术的辅助治疗恢复皮肤的屏障功能。
附图说明
48.图1为试验例一实验处理贴敷皮肤部位示意图。
具体实施方式
49.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
50.本发明的一种具体实施方式的技术方案为：
51.一种重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料，所述重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料主要由以下质量分数的原料制备得到：
52.重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白0.03wt％-0.10wt％，d-(+)-海藻糖二水合物0.06wt％-0.18wt％，卡波姆0.2wt％-0.8wt％，丁二醇1.5wt％-3.5wt％，甘油1wt％-2.5wt％，三乙醇胺0.1wt％-0.5wt％，余量为纯化水。
53.作为优选地，所述重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料主要由以下质量分数的原料制备得到：
54.重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白0.07wt％，d-(+)-海藻糖二水合物0.15wt％，卡波姆0.5wt％，丁二醇3wt％，甘油2wt％，三乙醇胺0.35wt％，余量为纯化水。
55.一种重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料在制备重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白凝胶成品或重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白原液成品中的应用。
56.一种重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白凝胶成品的制备方法，采用所述的重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料进行制备，包括如下步骤：
57.(1)按照相应质量分数选取卡波姆和纯化水，在均质速度为20-30hz下进行乳化处理，获得备用物a；
58.(2)按照相应质量分数选取三乙醇胺和纯化水混合溶解，获得备用物b；
59.(3)按照相应质量分数选取重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白和纯化水混合溶解，获得备用物c；
60.(4)按照相应质量分数选取甘油、丁二醇和d-(+)-海藻糖二水合物搅拌混合后与备用物a混合、均质处理后加热至80-90℃时保温20-30min，冷却至50-60℃时，加入备用物b搅拌；
61.(5)继续降温至不高于45℃时，加入备用物c，均质处理至料体分散均匀澄清透明，过滤，放料，获得成品。
62.作为优选地，所述步骤(4)中，甘油、丁二醇和d-(+)-海藻糖二水合物搅拌混合时，搅拌时长为3-5分钟，搅拌速度为600-800转/分钟；
63.所述均质处理时，采用高速均质5-8分钟，均质速度为30-40hz；
64.所述加入备用物b搅拌时，采用低速20-30hz均质,并充分搅拌2-3分钟，搅拌速度为15-20hz进行搅拌处理。
65.作为优选地，所述步骤(5)中，均质处理时长为3-5分钟，均质处理速度为15-20hz；
66.所述过滤时采用200-400目滤布。
67.一种重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白原液成品的制备方法，采用所述的重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白敷料进行制备，包括如下步骤：
68.(1)按照相应质量分数选取三乙醇胺和纯化水混合溶解，获得备用物a；
69.(2)按照相应质量分数选取重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白和纯化水混合溶解，获得备用物b；
70.(3)按照相应质量分数选取甘油、丁二醇和d-(+)-海藻糖二水合物搅拌混合后，加入卡波姆和纯化水进行加热、均质处理后保温20-30min，冷却至50-60℃时，加入备用物a搅拌混合；
71.(4)继续降温至不高于45℃时，加入备用物b，均质处理至料体分散均匀澄清透明，过滤，放料，获得成品。
72.作为优选地，所述步骤(3)中，甘油、丁二醇和d-(+)-海藻糖二水合物搅拌混合时，搅拌时长为3-5分钟，搅拌速度为600-800转/分钟；
73.所述加热至85-92℃时，采用高速均质5-8分钟，均质速度为30-40hz进行均质处理；
74.所述加入备用物a搅拌混合时，采用低速20-30hz均质,并充分搅拌2-3分钟，搅拌速度为15-20hz进行搅拌处理。
75.作为优选地，所述步骤(4)中，均质处理时长为3-5分钟，均质处理速度为15-20hz；
76.所述过滤时采用200-400目滤布。
77.[0078][0079]
实施例1：
[0080]
一种重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白凝胶成品的制备方法，包括如下步骤：
[0081]
(1)将称量好的纯化水899.3g及卡波姆5g加入乳化锅中，打开均质速度为20-30hz；
[0082]
(2)称量配方中纯化水10g及三乙醇胺3.5g充分搅拌，使其溶解；
[0083]
(3)称量配方中纯化水30g及重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白0.7g充分搅拌，使其溶解；
[0084]
(4)将甘油20g、丁二醇30g、d-(+)-海藻糖二水合物1.5g放入容器中，用电动搅拌器搅拌3分钟，速度为600-800转/分钟，充分搅拌溶解后再加入乳化锅内，高速均质5分钟，均质速度为30-40hz，加热升温至90℃左右时保温20分钟，开冷却水冷却物料；当物料温度降至60℃左右时，加入预先单独溶解好的步骤(2)中的三乙醇胺溶液，再次进行低速20-30hz均质，并充分搅拌2-3分钟，搅拌速度为15-20hz；
[0085]
(4)待温度降至45℃以下时，将步骤(3)中的重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白溶液加入乳化锅中，充分搅拌3分钟，搅拌速度为15-20hz，至料体分散均匀澄清透明，取样检验合格后，用200目滤布过滤后，放料。
[0086]
实施例2：
[0087]
一种重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白凝胶成品的制备方法，包括如下步骤：
[0088]
(1)将称量好的纯化水899.3g及卡波姆5g加入乳化锅中，打开均质速度为20-30hz；
[0089]
(2)称量配方中纯化水10g及三乙醇胺3.5g充分搅拌，使其溶解；
[0090]
(3)称量配方中纯化水30g及重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白0.7g充分搅拌，使其溶解；
[0091]
(4)将甘油20g、丁二醇30g、d-(+)-海藻糖二水合物1.5g放入容器中，用电动搅拌器搅拌5分钟，速度为600-800转/分钟，充分搅拌溶解后再加入乳化锅内，高速均质8分钟，均质速度为30-40hz，加热升温至80℃左右时保温30分钟，开冷却水冷却物料；当物料温度降至50℃左右时，加入预先单独溶解好的步骤(2)中的三乙醇胺溶液，再次进行低速20-30hz均质，并充分搅拌2-3分钟，搅拌速度为15-20hz；
[0092]
(4)待温度降至45℃以下时，将步骤(3)中的重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白溶液加入乳化锅中，充分搅拌5分钟，搅拌速度为15-20hz，至料体分散均匀澄清透明，取样检验合格后，用400目滤布过滤后，放料。
[0093]
实施例3：
[0094]
一种重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白原液成品的制备方法，包括如下步骤：
[0095]
(1)将称量好924.3g的纯化水加入乳化锅中，打开均质速度为20-30hz，加入卡波姆；
[0096]
(2)称量配方中纯化水10g及三乙醇胺3.5g充分搅拌，使其溶解；
[0097]
(3)称量处方中30g纯化水溶解处方量中的重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白；
[0098]
(4)将甘油、丁二醇、黄原胶、d-(+)-海藻糖二水合物装容器中，用电动搅拌器搅拌3-5分钟，速度为600-800转/分钟，充分搅拌均匀后，倒入乳化锅内，加热升温至92℃左右，高速均质5-8分钟，均质速度为30-40hz，保温30分钟后。开冷却水冷却物料，当物料温度降至60℃左右时。加入步骤(2)中的三乙醇胺溶液，再次进行低速20-30hz均质,并充分搅拌2-3分钟，搅拌速度为15-20hz；
[0099]
(5)待温度降至45℃以下时，将步骤(3)中的重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白溶液加入乳化锅中，搅拌速度为15-20hz，分散均匀至料体澄清透明，取样检验合格后，用200目滤布过滤后，放料。
[0100]
实施例4：
[0101]
一种重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白原液成品的制备方法，包括如下步骤：
[0102]
(1)将称量好924.3g的纯化水加入乳化锅中，打开均质速度为20-30hz，加入卡波姆；
[0103]
(2)称量配方中纯化水10g及三乙醇胺3.5g充分搅拌，使其溶解；
[0104]
(3)称量处方中30g纯化水溶解处方量中的重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白；
[0105]
(4)将甘油、丁二醇、黄原胶、d-(+)-海藻糖二水合物装容器中，用电动搅拌器搅拌3-5分钟，速度为600-800转/分钟，充分搅拌均匀后，倒入乳化锅内，加热升温至85℃左右，高速均质5-8分钟，均质速度为30-40hz，保温20分钟后。开冷却水冷却物料，当物料温度降至50℃左右时。加入步骤(2)中的三乙醇胺溶液，再次进行低速20-30hz均质,并充分搅拌2-3分钟，搅拌速度为15-20hz；
[0106]
(5)待温度降至45℃以下时，将步骤(3)中的重组ⅲ型人源化三螺旋结构胶原蛋白溶液加入乳化锅中，搅拌速度为15-20hz，分散均匀至料体澄清透明，取样检验合格后，用400目滤布过滤后，放料。
[0107]
使用方法：清洁患处皮肤，取本品外敷于患处。
[0108]
1.皮炎湿疹、特应性皮炎、激素依赖性皮炎、皮肤干燥症、敏感性肌肤、激光治疗后等各种原因引起的皮肤炎症的辅助治疗：每天2～3次，每两周为一个疗程。
[0109]
2.轻中度痤疮以及痤疮愈后色素沉着和瘢痕的辅助治疗：轻度痤疮患者每天2～3次，每两周为一个疗程；中度痤疮患者每天2～3次，每四周为一个疗程。
[0110]
3.激光治疗后引起的色素沉着与瘢痕的辅助治疗：每天2～3次，每两周为一个疗程。
[0111]
4.创面愈合与皮肤修复：每天2～3次，每两周为一个疗程。
[0112]
试验例：
[0113]
试验一：皮肤刺激试验
[0114]
方法：急性皮肤刺激试验，取实施例1制备得到的试验例浸透吸水性纱布贴敷于实验兔背部皮肤，接触至少4h后去除贴敷物，并标记贴敷试验部位。
[0115]
同上部位方法法操作阴性对照组：0.9wt％氯化钠注射液浸透吸水性纱布。
[0116]
在去除贴敷物后1h、24h、48h和72h，观察试验部位及其皮肤组织反应，包括红斑、水肿和坏死等记录，根据红斑、水肿发生情况进行等级记分。重复皮肤刺激试验，在急性皮肤刺激观察72h后，每天同上法操作贴敷给与试验例及阴性对照组，每次接触前记录接触部位情况。将每只动物全部原发性刺激记分相加后再除以动物总数(一般为3只)得出试验例的原发性刺激指数。将试验例原发性刺激记分减去阴性对照组记分，即得出原发性刺激记分。该值即为原发性刺激指数。多次接触试验按规定计算累计刺激指数。
[0117]
结果：试验例对实验兔急性皮肤刺激试验原发性刺激指数0；试验例对实验兔重复皮肤刺激试验原发性刺激指数为0。
[0118]
结论：在本试验条件下，实施例1制备得到的产品对实验兔急性皮肤刺激试验原发性刺激指数为0；对实验兔重复皮肤刺激试验原发性刺激指数为0。皮肤刺激反应类型为极轻微刺激反应。
[0119]
具体试验方法；
[0120]
试验前准备：试验前，对动物进行标识，在动物背部脊柱两侧除去足够面积被毛(约10cm
×
15cm区域)，用作试验和观察部位。
[0121]
试验步骤：将试验例和阴性对照组分别置于动物背部相应的皮肤部位，用一层玻璃纸覆盖再用压敏胶带半封闭性固定敷贴片至少4h。重复接触试验，在急性皮肤刺激试验观察72h后，每天贴敷1次，连续贴敷14d。从第二天开始，每次涂抹前剪毛，用水清除残留受试物。
[0122]
阴性对照组试验区和试验例的试验区同样处理。贴敷与皮肤的部位详见图1。图1图注说明：1-头部；2-试验部位；3-阴性对照部位；4-去毛的背部区域；5-尾部。
[0123]
试验观察：急性皮肤刺激试验，接触期结束后取下敷贴片，并用温水除去残留试验材料。在除去敷贴片后1h、24h、48h和72h观察并记录各接触部位情况，按皮肤反应记分系统描述每一接触部位在每一规定时间内皮肤红斑和水肿情况并评分。重复接触皮肤刺激试验，在急性皮肤刺激试验观察72h后，每次在除去敷贴片后(1
±
0.1)h以及再次接触前记录接触部位情况。末次接触后，分别在除去敷贴片后1h、24h、48h和72h观察并记录各接触部位情况。
[0124]
急性皮肤刺激给药日期：2021年8月30日
[0125]
急性皮肤刺激观察日期：2021年8月30日-2021年9月2日
[0126]
重复接触皮肤刺激给药日期：2021年9月2日-2021年9月15日
[0127]
重复接触皮肤刺激观察日期：2021年9月2日-2021年9月18日
[0128]
结果与评价：皮肤刺激试验观察评分标准：无红斑，0分；极轻微红斑(勉强可见)，1分；清晰红斑，2分；中度红斑，3分；重度红斑(紫红色)至无法进行红斑分级的焦痂形成，4分。无水肿，0分；极轻微水肿(勉强可见)，1分；清晰水肿(肿起边缘清晰)，2分；中度水肿(皮肤隆起约1mm)，3分；重度水肿(皮肤隆起超过1mm，并超出接触区)，4分。最高分总分值为8分。
[0129]
皮肤刺激强度评价标准：0～0.4分，极轻微；0.5～1.9分，轻度；2.0～4.9分，中度；5.0～8.0分，重度。
[0130]
急性皮肤刺激试验按下列规定确定原发性剌激指数(pii)。仅使用(24
±
2)h、(48
±
2)h和(72
±
2)h的观察数据进行计算。试验之前或72h后的恢复观察数据不用于计算。在72h评分后，分别将每只动物试验试验例和阴性对照在(24
±
2)h、(48
±
2)h和(72
±
2)h引起的全部红斑和水肿记分相加，再将所有记分之和除以6(两个试验/观察部位，3个时间点)计算出某一动物的原发剌激指数。将每只动物全部原发性剌激记分相加后再除以动物总数(一般为3)得出试验试验例原发性剌激指数。
[0131]
当采用空白或阴性对照时，计算出对照原发性剌激记分，将试验材料原发性剌激记分减去该记分，即得出原发性刺激记分。
[0132]
重复接触试验，应按照上述方法计算每只动物原发性剌激记分，考虑全部评价终点。按下列规定计算累积刺激指数。
[0133]
将全部动物剌激记分相加后再除以动物总数。该值即为累积剌激指数。
[0134]
将累积剌激指数按照皮肤刺激强度评价标准给出的剌激反应，报告相应的反应类型。
[0135]
试验例对实验兔急性皮肤刺激试验原发性刺激指数为0；试验例对实验兔重复接触皮肤刺激试验原发性刺激指数为0。结果如下表所示：
[0136]
表1兔皮肤刺激反应评分结果(单次接触试验)
[0137][0138]
表2兔皮肤刺激反应(重复接触试验)评分结果
[0139]
[0140]
[0141][0142]
试验例二：皮肤致敏试验
[0143]
方法：豚鼠经过一段时间反复接触试验例进行诱导后(阴性对照组给予0.9wt％氯化钠注射液浸透吸水性纱布；阳性对照给予1-氯-2,4-二硝基苯配制得到的溶液浸透吸水性纱布)，用试验例对试验组全部试验动物在剃毛的未试部位进行激发。并在除去敷贴片后24h、48h对所有动物激发部位皮肤反应进行分级。阴性对照组动物同法操作。
[0144]
结果：试验组动物和阴性对照组动物激发部位皮肤均未见敷贴试验反应，评分等级均为0，致敏发生率均为0。
[0145]
结论：在本试验条件下，试验例对豚鼠皮肤致敏试验未引起豚鼠皮肤致敏反应。
[0146]
实验方法：阴性对照品：0.9wt％氯化钠注射液和吸水性纱布，保存条件，密闭保存。
[0147]
供试品制备：取实施例3制备得到的产品0.5ml/份浸透2.5cm
×
2.5cm的吸水性纱布；阴性对照用0.5ml/份0.9wt％氯化钠注射液浸透2.5cm
×
2.5cm的吸水性纱布。
[0148]
阳性对照品的制备：诱导，称取1-氯-2，4-二硝基苯100mg，加75wt％乙醇溶液，配制成1wt％的溶液，0.5ml/份浸透2.5cm
×
2.5cm的吸水性纱布；激发称取1-氯-2，4-二硝基苯50mg，加75wt％乙醇溶液，配制成0.1wt％的溶液，0.5ml/份浸透2.5cm
×
2.5cm的吸水性纱布。
[0149]
试验方法：准备：在试验开始前剃除动物全部试验部位被毛，选用健康、皮肤无损伤动物进行试验。
[0150]
诱导阶段：用样品0.5ml/份浸透2.5cm
×
2.5cm的吸水性纱布，置于玻璃纸之上，用压敏胶带封闭固定于每只动物的左上背部位。6h后除去固定物和敷贴片。一周连续3天重复该步骤，同法连续操作3周。对照组动物使用0.5ml/份0.9wt％氯化钠注射液浸透2.5cm
×
2.5cm的吸水性纱布同法操作。
[0151]
激发阶段：最后一次诱导贴敷后14d，用试验例对全部试验动物和对照动物进行激发。
[0152]
取试验例0.5ml/份浸透2.5cm
×
2.5cm的吸水性纱布，置于同样大小的玻璃纸之上，用压敏胶带封闭固定于每只动物的右上背部位。6h后除去固定物和贴敷片，去除敷贴片
24h后剃去激发部位及周围动物被毛并用温水清洗脱毛区。
[0153]
诱导日期：2021年8月23日-2021年8月25日；2021年8月23日-2021年9月1日；2021年9月6日-2021年9月8日；激发日期：2021年9月22日。
[0154]
观察：除去贴敷片后24h、48h观察试验组和对照组动物激发位皮肤反应情况，按magnusson和kligman分级标准对每一激发部位和每一观察时间皮肤红斑和水肿反应进行描述并分级。等级：0：无明显改变；1：散发性或斑点状红斑；2：中度融合性红斑；3：重度红斑和/或水肿。
[0155]
观察结果：试验过程中试验组和阴性对照组所有动物未见异常表现。
[0156]
致敏反应结果：试验组动物与阴性对照组动物激发部位皮肤均未见敷贴试验反应，未观察到明显致敏反应症状，评分等级为0，致敏发生率均为0。具体情况详见表4。
[0157]
阳性对照组动物激发后(24h和48h)激发部位皮肤均可见明显敷贴试验反应(本实验室每6个月进行一次阳性对照试验)，激发后24h动物平均记分等级为3.0，致敏发生率均为100wt％；激发后48h动物平均记分等级为1.8，致敏发生率均为100wt％。详见表5。
[0158]
表4致敏反应试验观察结果
[0159]
[0160][0161][0162]
表5致敏阳性反应试验观察结果
[0163][0164]
结论：在本试验条件下，试验例对豚鼠皮肤致敏试验未引起豚鼠皮肤致敏反应。
[0165]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。