一种共交联后双键交联生物瓣膜材料及其制备方法和应用

1.本发明涉及介入材料技术领域，具体涉及一种双键后交联生物瓣膜材料及其制备和应用。
2.该申请是针对申请号为202210273149.1、申请日为2022-03-18、申请人为四川大学、发明名称为“一种共交联后双键交联生物瓣膜材料及其制备方法和应用”的分案申请。


背景技术：

3.生物心脏瓣膜通常采用猪或牛的心包膜制备而成，用于替换功能缺损的人体自有心脏瓣膜；生物心脏瓣膜相比于机械心脏瓣膜有很多优点：生物心脏瓣膜植入后患者不需要长期服用抗凝药、生物心脏瓣膜可以采用微创介入的手术方式，这些优点使得生物心脏瓣膜在临床应用当中逐步成为市场主流。
4.当前市场上的生物瓣膜产品几乎全部是采用戊二醛进行交联制备而成，戊二醛可以交联心包膜当中的胶原蛋白，但是，戊二醛交联的生物瓣膜其抗钙化及抗凝血性能有待改进。


技术实现要素：

5.本技术提供一种共交联后双键交联生物瓣膜材料及其制备方法和应用，提高生物材料的抗钙化性能。
6.一种共交联后双键交联生物瓣膜材料的制备方法，其特征在于，包括：
7.(1)将生物材料浸泡于含第一功能单体的溶液中进行物理渗透；所述第一功能单体具有至少一个碳碳双键和至少一个与醛基反应的基团；
8.(2)向步骤(1)的体系中加入醛基交联剂，进行共交联；
9.(3)将经步骤(2)处理后的生物材料浸泡于含第二功能单体的溶液中进行物理渗透；所述第二功能单体具有至少一个碳碳双键；
10.(4)向步骤(3)的体系中加入引发剂，引发双键聚合。
11.可选的，所述醛基交联剂为戊二醛或甲醛。
12.可选的，步骤(1)中所述溶液的溶剂为水、生理盐水、ph中性缓冲液或乙醇的水溶液；所述溶液中第一功能单体的浓度为10～100mm；浸泡时间为2～20h。
13.可选的，步骤(2)中，所述交联剂的浓度为10～800mm；共交联时间为10～30h。
14.可选的，在步骤(3)之前还包括步骤(2m)：将经步骤(2)处理后的生物材料浸泡于含第三功能单体的溶液中，消除残留醛基；所述第三功能单体具有至少一个与醛基反应的基团。
15.可选的，步骤(2m)中，所述溶液的溶剂为水、生理盐水、ph中性缓冲液或乙醇的水溶液；所述溶液中第三功能单体的浓度为10～100m m；浸泡时间为2～48h。
16.可选的，所述第一功能单体和第三功能单体中与醛基反应的基团各自独立地选自氨基或酰肼。
17.可选的，所述第一功能单体和第三功能单体各自独立地选自2-甲基烯丙胺、3-丁烯-1-胺、戊-4-烯-1-胺、甲基丙烯酸2-氨基乙酯、甲基丙烯酰肼、丙烯酰肼中的一种。
18.可选的，所述第一功能单体还具有至少一个功能性基团；所述第三功能单体还具有至少一个碳碳双键和/或至少一个功能性基团；所述第一功能单体和第三功能单体的功能性基团各自独立地选自羟基、羧基、酰胺基、磺酸基中的至少一种。
19.可选的，所述第一功能单体和第三功能单体各自独立地选自2-氨基-7-烯-辛酸、6-烯-庚氨酸、2-氨基戊-4-烯酸、dl-2-氨基-4-戊烯酸、4-(1-氨基-2-甲基-丙基)-七-1,6-二烯-4-醇、4-(1-氨基-乙基)-七-1,6-二烯-4-醇、双键化多聚赖氨酸中的一种。
20.可选的，所述第二功能单体为聚乙二醇二丙烯酸酯、1,4-丁二醇二丙烯酸酯、丙烯酸乙酯、n-甲基-2-丙烯酰胺、n-2,2-丙烯基-2-丙烯酰胺、n-乙基丙烯酰胺、n,n'-乙烯基双丙烯酰胺、(乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基)二丙烯酸酯、双键化透明质酸中的一种。
21.可选的，步骤(3)中：将第二功能单体加入前步处理的体系中；或将前步处理后的生物材料清洗后再浸泡于含第二功能单体的溶液中。
22.可选的，所述含第二功能单体的溶液中溶剂为水、生理盐水、ph中性缓冲液或乙醇的水溶液；第二功能单体的质量百分浓度为1～10％；浸泡时间为2～20h。
23.可选的，所述引发剂为过硫酸铵和亚硫酸氢钠的混合物，所述过硫酸铵和亚硫酸氢钠的浓度分别为10～100mm；或
24.所述引发剂为过硫酸铵和n,n,n',n'-四甲基乙二胺的混合物，所述过硫酸铵和n,n,n',n'-四甲基乙二胺的质量百分浓度分别为2％～5％和0.2％～0.5％。
25.本技术还提供一种共交联后双键交联生物瓣膜材料，由所述的制备方法制备得到。
26.本技术还提供一种共交联后双键交联生物瓣膜材料，包括：
27.(1)将生物材料浸泡于含第一功能单体的溶液中进行物理渗透；所述第一功能单体具有至少一个碳碳双键和至少一个与醛基反应的基团；
28.(2)向步骤(1)的体系中加入醛基交联剂，进行共交联；
29.(3)将经步骤(2)处理后的生物材料浸泡于含第二功能单体的溶液中进行物理渗透；所述第二功能单体具有至少一个碳碳双键；
30.(4)向步骤(3)的体系中加入引发剂，引发双键聚合；
31.(5)将经步骤(4)处理后的生物材料经过脱水干燥处理。
32.本技术还提供一种生物瓣膜，包括支架和瓣膜，所述瓣膜为所述的交联后双键交联生物瓣膜材料制成。
33.可选的，所述生物瓣膜为心脏瓣膜。
34.与现有技术相比，本技术至少具有如下有益效果之一：
35.(1)本技术的方法通过醛基共交联和双键聚合二次交联对生物材料进行交联处理，两次交联处理得到的生物材料其交联度好；
36.(2)本技术在共交联的同时可封闭部分残留醛基，改善生物材料的抗钙化性能，并进一步提高生物材料的交联度；
37.(3)共交联结束后，对剩余残留醛基消除的同时引入碳碳双键，为后续的双键聚合
提供更多碳碳双键，进一步提高生物材料的交联度。
38.(4)本技术通过在双键聚合步骤加入第二功能单体共聚，形成更多更大的聚合物交联网络，可以提高生物材料的交联度和提升抗钙化性能。
附图说明
39.图1为本技术一种较优选实施方式的工艺流程图；
40.图2为本技术一种较优选实施方案的反应原理图；
41.图3为本技术另一种较优选实施方案的反应原理图；
42.图4为实施例1的样品1与对照组1心包膜(ga)的红外光谱图；
43.图5为实施例1的样品1与对照组1心包膜(ga)大鼠皮下植入后弹性蛋白定量结果示意图；
44.图6为实施例1的样品1与对照组1心包膜(ga)大鼠皮下植入后挂钙量检测示意图；
45.图7为实施例2的样品2与对照组2心包膜(ga)水接触角示意图；
46.图8为实施例2的样品2与对照组2心包膜(ga)乳酸脱氢酶检测以及溶血率示意图；
47.图9为实施例2的样品2与对照组2心包膜(ga)钙离子浓度示意图；
48.图10为实施例3的基本原理图
49.图11为对照组3的对照样植入30天后得茜素红染色切片图；
50.图12为样品3植入30天后得茜素红染色切片图；
51.图13为样品4植入30天后得茜素红染色切片图；
52.图14为样品5植入30天后得茜素红染色切片图；
53.图15为样品6植入30天后得茜素红染色切片图；
54.图16为样品7植入30天后得茜素红染色切片图。
具体实施方式
55.下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
56.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本技术。
57.当前市场上的生物瓣膜主要为戊二醛交联生物膜，戊二醛可以交联心包膜当中的胶原蛋白，但是，戊二醛交联的生物瓣膜其抗钙化及抗凝血性能有待改进。本技术在戊二醛交联基础上通过交联手段的改进，改善戊二醛交联膜的机械性能、抗钙化及抗凝血性能。
58.本技术改进的交联方案中，在戊二醛交联前引入带有碳碳双键和与醛基反应基团的功能单体，该功能单体先物理渗透进入生物材料，然后与醛基交联剂进行共交联，功能单体的氨基与醛基反应，将碳碳双键和功能性基团同时引入生物材料中；再进一步通过第二功能单体物理渗透引入一部分碳碳双键，最后引发生物材料上的碳碳双键和第二功能单体碳碳双键聚合，形成交联网络，进一步提高生物材料的交联度。
59.具体的，包括：
60.(1)将生物材料浸泡于含第一功能单体的溶液中进行物理渗透；所述第一功能单体具有至少一个碳碳双键和至少一个与生物材料上的残留醛基反应的基团；
61.(2)向步骤(1)的体系中加入醛基交联剂，进行共交联；
62.(3)将经步骤(2)处理后的生物材料浸泡于含第二功能单体的溶液中进行物理渗透；所述第二功能单体具有至少一个碳碳双键；
63.(4)向步骤(3)的体系中加入引发剂，引发双键聚合。
64.本技术的反应原理：
65.第一步：第一功能单体先物理渗透进入生物材料中，引入的第一功能单体带有碳碳双键和与醛基反应的基团，第一功能单体渗透后加入醛基交联剂(如戊二醛)，进行共交联，共交联过程中，所发生的反应至少包括：
66.1)一部分交联剂两端的醛基均与生物材料的氨基反应；2)一部分交联剂其中一端的醛基与生物材料的氨基反应、另一端的醛基与功能单体的氨基反应；3)一部分交联剂其中一端的醛基与生物材料的氨基反应、另一端的醛基在生物材料上形成残留醛基；4)部分残留醛基与功能单体的氨基反应，将碳碳双键引入生物材料。
67.第二步：第二功能单体先物理渗透进入完成共交联并一次引入碳碳双键后的生物材料，进一步引入碳碳双键，该步骤引入碳碳双键为物理渗透，待第二功能单体渗透后，引发第二功能单体的碳碳双键与生物材料表面的碳碳双键共聚合，进行二次交联，形成交联网络。
68.本技术的方法通过醛基共交联和双键聚合二次交联对生物材料进行交联处理，两次交联处理得到的生物材料其交联度好；本技术共交联引入碳碳双键后再次通过第二功能单体进一步引入碳碳双键，第二次通过物理渗透引入的碳碳双键使在双键聚合过程中有额外的功能单体参与共聚，形成更大的聚合物交联网络，有利于提升生物瓣膜交联度和抗钙化性能。
69.本技术的交联剂采用当前主流交联方法所用的多醛基交联剂，可选的，所述多醛基交联剂可选择戊二醛、甲醛中的至少一种。
70.本技术所采用的生物材料为现有戊二醛交联工艺中常规的生物材料。所述生物材料的胶原含量为60％～90％。所述生物材料为动物组织，动物来源为猪、牛、马或羊，包括心包膜、瓣膜、肠膜、脑膜、肺膜、血管、皮肤或韧带的一种或多种。
71.较为优选的实施方式中，可选的，在步骤(3)之前还包括步骤(2m)：将经步骤(2)处理后的生物材料浸泡于含第三功能单体的溶液中，消除剩余部分的残留醛基；该步骤的第三功能单体具有至少一个与醛基反应的基团。
72.本技术的第一功能单体具有至少一个与醛基反应的基团，在共交联过程中，第一功能单体通过该基团与生物材料上的部分残留醛基反应，将碳碳双键引入生物材料中。可选的，所述第一功能单体中与醛基反应的基团包括但不限于氨基和酰肼。
73.在包括步骤(2m)的方案中，第三功能单体具有至少一个与醛基反应的基团，浸泡过程中与生物材料上的剩余残留醛基反应。可选的，所述第三功能单体中与醛基反应的基团包括但不限于氨基和酰肼。
74.第一功能单体具有至少一个氨基和至少一个碳碳双键，一种方案中，可直接采用
市购产品，可选的，所述第一功能单体为2-甲基烯丙胺、3-丁烯-1-胺、戊-4-烯-1-胺、甲基丙烯酸2-氨基乙酯、甲基丙烯酰肼、丙烯酰肼中的一种。
75.本技术的第三功能单体具有至少一个氨基，较优选的方案中，第三功能单体也具有至少一个碳碳双键，再次用第三功能单体溶液处理生物材料时，通过功能单体上的氨基与生物膜上的残留醛基反应，封闭剩余残留醛基的同时可再次引入碳碳双键，增加后续双键聚合的双键基数。
76.可选的，所述第三功能单体为2-甲基烯丙胺、3-丁烯-1-胺、戊-4-烯-1-胺、甲基丙烯酸2-氨基乙酯、甲基丙烯酰肼、丙烯酰肼中的一种。
77.本技术的第一功能单体和第三功能单体中除带有碳碳双键和氨基外，还可带有功能性基团，可选的，所述第一功能单体和第三功能单体中的功能性基团各自独立地选自羟基、羧基、酰胺基、磺酸基中的至少一种。
78.引入羟基可改善生物材料的亲水性；引入羧基可使生物材料呈现电中性；引入羟基可改善生物瓣膜的亲水性；引入羧基可维持步骤(1)反应体系ph中性；引入酰胺基可通过水分子与酰胺基之间的氢键相互作用增加生物瓣膜亲水性；引入磺酸基可通过水分子与磺酸基之间的离子水合作用增加生物瓣膜亲水性。
79.关于同时满足带有至少一个氨基、至少一个碳碳双键和至少一个如前所述的功能性基团的功能单体，一种方案中，可直接采用市购产品。可选的，所述第一功能单体和第三功能单体各自独立地选自2-氨基-7-烯-辛酸、6-烯-庚氨酸、2-氨基戊-4-烯酸、4-(1-氨基-2-甲基-丙基)-七-1,6-二烯-4-醇、4-(1-氨基-乙基)-七-1,6-二烯-4-醇中的一种。
80.第一功能单体和第三功能单体处如前所示的市购途径外，也可通过双键改性制备得到，例如双键化多聚赖氨酸。
81.即，步骤(1)中的第一功能单体和步骤(2m)中第三功能单体各自独立地选自上述可选范围(包括市购和改性制备)，可相同也可不同。
82.本技术的生物材料在引入功能单体前，需先进行常规的预处理，可选的，所述预处理包括常规的清洗操作：获取生物材料，并于4℃低温湿润状态下保存；将新鲜的生物材料采用柔和摩擦和流体压力在4℃、100rpm转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，直至没有可见的粘附的非心包或非胶原组织。
83.预处理后的生物材料与含第一功能单体的溶液接触，可选的，所述接触过程可为静态接触也可为动态接触；采用静态接触时，将生物材料置于含第一功能单体的溶液中浸泡即可；动态接触时可在浸泡的过程中摇床震动。与第一功能单体接触过程中，温度在20～50℃均可，优选的，接触过程终温度无需特别控制，室温环境均可，以不超过人体适应温度为宜，优选在36～37℃进行。
84.步骤(1)中第一功能单体的浓度以及生物材料与含第一功能单体溶液的接触时间以保证更多的第一功能单体渗透进入生物材料中为宜，一般地，第一功能单体的浓度较高、相应的接触时间可较短，第一功能单体的浓度较低、相应的接触时间适应延长。
85.可选的，步骤(1)中所述溶液的溶剂为水、生理盐水或ph中性缓冲液或乙醇的水溶液其中，乙醇的水溶液中，乙醇和水可按任意比例混合，常用为50％左右乙醇；所述溶液中功能单体的浓度为10～100m m。
86.可选的，在第一功能单体浓度为10～100m m条件下，接触时间为2～20h，确保第一
功能单体充分渗透进入生物材料。
87.进一步可选的，步骤(1)中所述溶液中第一功能单体的浓度为10～30m m，浸泡时间为2～5h。
88.第一功能单体渗透后，向反应体系中加入交联剂，可选的，所述交联剂的浓度为10～800m m。
89.共交联过程中，温度在20～50℃均可，优选的，所述共交联过程中温度无需特别控制，室温环境均可，以不超过人体适应温度为宜，可选的，在36～37℃进行；所述共交联的反应时间以交联反应尽量彻底为宜，可选的，在交联剂浓度为10～800mm条件下，共交联时间为10～30h。
90.进一步可选的，步骤(2)中交联剂的浓度为50～500mm；进一步地，步骤(2)中交联剂的浓度为50～150mm，共交联时间为20～30h。
91.可选的，共交联时生物材料与交联剂溶液之间可为静态接触也可为动态接触，动态接触过程可选择在浸泡的同时震荡反应体系，加快交联进程。
92.步骤(2m)中第三功能单体的浓度及浸泡时间以更多的封闭残留醛基为宜，可选的，步骤(2m)中，所述溶液中第三功能单体的浓度为10～100mm；浸泡时间为2～48h。
93.进一步可选的，步骤(2m)中，所述溶液中溶剂为水、生理盐水或ph中性缓冲液或乙醇的水溶液其中，乙醇的水溶液中，乙醇和水可按任意比例混合，常用为50％左右乙醇；所述溶液中第三功能单体的浓度为20～50mm；浸泡时间为3～8h。
94.该步骤(2m)中，将经步骤(2)处理后的生物材料清洗后再浸泡于第三功能单体溶液中；或将经步骤(2)处理后的生物材料直接转移至第三功能单体溶液中。
95.该步骤(2m)中，在20～50℃下进行均可，优选的，浸泡温度无需特别控制，室温环境均可，以不超过人体适应温度为宜，优选在36～37℃进行。
96.步骤(2)或步骤(2m)结束后，通过第二功能单体进一步引入碳碳双键，该引入过程为物理渗透，第二功能单体在该步骤中不与生物材料发生反应，一种方案中，可选的，所述第二功能单体为聚乙二醇二丙烯酸酯、1,4-丁二醇二丙烯酸酯、丙烯酸乙酯、n-甲基-2-丙烯酰胺、n-2,2-丙烯基-2-丙烯酰胺、n-乙基丙烯酰胺、n,n'-乙烯基双丙烯酰胺、(乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基)二丙烯酸酯中的一种。
97.所述第二同能单体除上述市购途径外，也可自行双键改性制备，可选的，所述第二功能单体为双键化透明质酸或双键化多聚赖氨酸。
98.即，所述第一功能单体、第二功能单体和第三功能单体可独立地选择双键化透明质酸或双键化多聚赖氨酸。
99.双键改性透明质酸的一种实施方案，包括：
100.称取2g分子量为10000的透明质酸钠，并使用20ml pbs溶解，再依次加入6-12ml甲基丙烯酸缩水甘油酯以及4-8ml三乙胺。在37℃摇床上放置5-10天。最后使用截留分子量为5000的透析袋透析5-7天，冷冻干燥得到双键化的透明质酸(根据实际需要可以等比例放大制备)；
101.双键改性透明质酸的一种实施方案，包括：
102.将多聚赖氨酸溶解在去离子水中，然后以1:1.5-1:5(甲基丙烯酸缩水甘油酯：氨基)的摩尔比加入甲基丙烯酸缩水甘油酯。将混合物在37℃摇床上放置5-10天。最后使用截
留分子量为1000的透析袋透析5-7天，冷冻干燥得到部分双键化的多聚赖氨酸。
103.本技术在共交联或步骤(2m)完成后再次引入碳碳双键，一种可选的方案中，在所述共交联或步骤(2m)完成后直接引入第二功能单体。该方案俗称一锅法，即在共交联或步骤(2m)完成后直接向共交联或步骤(2m)的反应体系中加入第二功能单体，第二功能单体渗透进入生物材料后，再直接向反应体系中加入引发剂引发双键聚合反应，无需将生物材料取出清洗的过程。
104.另一种可选的方案中，还包括共交联或步骤(2m)完成后清洗生物材料的步骤。该方案中，共交联或步骤(2m)完成后取出生物材料，对生物材料进行清洗操作，去除残余功能单体、交联剂等，再浸泡于含第二功能单体溶液接触，随后加入引发剂引发双键聚合。
105.共交联后的生物材料与含第二功能单体溶液接触，进一步引入碳碳双键，第二功能单体的浓度以及生物材料与含第二功能单体溶液的接触时间以保证更多的第二功能单体渗透进入生物材料中为宜，一般地，第二功能单体的浓度较高、相应的接触时间可较短，第二功能单体的浓度较低、相应的接触时间适应延长。
106.可选的，所述含第二功能单体溶液中溶剂为水、生理盐水或ph中性缓冲液或乙醇的水溶液其中，乙醇的水溶液中，乙醇和水可按任意比例混合，常用为50％左右乙醇；第二功能单体的质量百分浓度为1～10％。
107.可选的，在第二功能单体质量百分浓度为1～10％条件下，接触时间为2～20h。以使第二功能单体充分渗透进入生物材料。
108.进一步可选的，所述含第二功能单体溶液中第二功能单体的质量百分浓度为2～5％；浸泡时间为10～15h。
109.可选的，生物材料与含第二功能单体溶液的接触过程可为静态接触也可为动态接触；接触过程在20～50℃下均可，优选的，温度无需特别控制，室温环境均可，以不超过人体适应温度为宜，优选在36～37℃进行。
110.第二功能单体渗入后，加入引发剂，引发碳碳双键发生自由基聚合，进行二次交联。
111.一种可选的引发方案中，所述引发剂为过硫酸铵和亚硫酸氢钠的混合物；所述溶液中过硫酸铵和亚硫酸氢钠的浓度分别为10～100mm；进一步地，过硫酸铵和亚硫酸氢钠的浓度分别为20～40mm。
112.另一种可选的引发方案中，所述引发剂为过硫酸铵和n,n,n',n'-四甲基乙二胺的混合物；所述溶液中过硫酸铵和n,n,n',n'-四甲基乙二胺的质量百分浓度分别为2％～5％和0.2％～0.5％。
113.可选的，所述含引发剂的溶液中溶剂为水、生理盐水或ph中性缓冲液。
114.如前所述的引发剂的浓度，在一锅法中，该浓度可以理解为硫酸铵和亚硫酸氢钠在步骤(2)反应体系所含溶液中的浓度，在分步法中，该浓度可以理解为含引发剂的溶液中的浓度。
115.可选的，双键聚合过程在20～50℃下进行均可，优选的，温度无需特别控制，室温环境均可，以不超过人体适应温度为宜，优选在36～37℃进行。双键聚合时间以2～48h为宜，优选20～25h。
116.可选的，还包括双键聚合结束后的后处理过程，所述后处理包括常规的清洗、柔
12ml甲基丙烯酸缩水甘油酯以及4-8ml三乙胺。在37℃摇床上放置5-10天。最后使用截留分子量为5000的透析袋透析5-7天，冷冻干燥得到双键化的透明质酸(根据实际需要可以等比例放大制备)；
140.s4、将多聚赖氨酸溶解在去离子水中，然后以1:1.5-1:5(甲基丙烯酸缩水甘油酯：氨基)的摩尔比加入甲基丙烯酸缩水甘油酯。将混合物在37℃摇床上放置5-10天。最后使用截留分子量为1000的透析袋透析5-7天，冷冻干燥得到部分双键化的多聚赖氨酸；
141.s5、将s2中的心包膜浸泡于s4中制备的部分双键化的多聚赖氨酸(摩尔浓度为100mm-500mm)水溶液1-3天，确保其达到接近饱和的物理渗透，从而尽可能多地引入部分双键化的多聚赖氨酸，然后向水溶液中加入戊二醛至其质量浓度为2.5％。
142.s6、将步骤s5处理后的生物材料与s3中制备的双键化透明质酸在过硫酸铵以及/n,n,n',n'-四甲基乙二胺的引发下进行自由基共聚反应，使用的双键化透明质酸浓度为20mg/ml-60mg/ml。置于37℃下反应12-24小时；
143.s7、最后用蒸馏水浸泡清洗，将清除没有接枝上的双键化透明质酸。
144.该实施方案中，透明质酸以及多聚赖氨酸的改性示意图和部分双键化多聚赖氨酸修饰心包膜以及双键化透明质酸自由基聚合原理示意图如图3所示。
145.该优选实施方案与已经报道的类似心包膜多糖亲水处理研究的对比，优点包括：
146.1)采用甲基丙烯酸化的多聚赖氨酸/戊二醛/心包膜共同交联的同时引入可自由基聚合的甲基丙烯基，与其他已经报道的方法(先将心包与戊二醛反应，然后利用残基引入双键)相比，本方法具有更高的引入双键的效率；
147.2)本研究策略是采用双重交联，包括戊二醛交联和自由基聚合交联，材料交联度较高；
148.3)与大部分使用多糖进行表界面亲水改性的研究相比，本方法中透明质酸与心包材料的结合方式为化学共价结合，具有更高的稳定性。
149.综上所述，该方案中利用甲基丙烯酸缩水甘油酯分别对多聚赖氨酸以及透明质酸进行修饰得到部分双键化的多聚赖氨酸和双键化的透明质酸，随后在戊二醛的作用下对心包膜和部分双键化的多聚赖氨酸(同时具备氨基和双键)进行共聚交联以同时实现心包膜的交联和双键化修饰。最后利用双键化的戊二醛瓣膜与双键化的透明质酸自由基共聚得到透明质酸改性的戊二醛心包材料。
150.上述方法制备得到的生物瓣膜材料，可以用于介入生物瓣膜，例如通过微创介入；也可用于外科生物瓣膜，例如通过外科手术植入。
151.作为介入生物瓣膜的一种实现形式，包括支架和瓣膜，瓣膜为上述方法制备得到的生物瓣膜材料。瓣膜可采用缝缀等方式固定于支架，根据功能需要一般可包括用于控制血流的瓣叶以及覆着在支架内壁或外壁的覆膜。
152.一种更具体的实施形式，生物瓣膜可以是心脏瓣膜。心脏瓣膜可以是通过导管介入或外科手术植入。作为介入方式其支架一般为径向可形变的网筒结构。
153.用于微创介入时，介入系统包括心脏瓣膜和输送管，心脏瓣膜经输送管输送。
154.以下以具体的实施例进行说明：
155.实施例1
156.在本实施例中，新鲜采集的猪心包于4℃100rpm转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小
时，然后浸泡在30mm dl-2-氨基-4-戊烯酸水溶液在37℃当中12小时，然后加入戊二醛使其浓度为100mm，在37℃，100rpm转速振荡条件之下浸泡24小时后，采用蒸馏水进行清洗。清洗后浸泡于5％的聚乙二醇二丙烯酸酯的水溶液中，在37℃条件下浸泡12小时，确保聚乙二醇二丙烯酸酯充分的物理渗透，加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠引发剂引发，过硫酸铵和亚硫酸氢钠的摩尔浓度均为40mm，在37℃条件下反应24小时，记为样品1。
157.在处理过程中，设置戊二醛处理组为对照组1，即将心包膜浸泡于0.625％的戊二醛当中24小时。
158.实施例1以及戊二醛对照组1乳酸脱氢酶相对活性的分析结果如表1所示，挂钙量如表2所示。
159.表1
[0160][0161][0162]
表2
[0163]
挂钙量μg/mg戊二醛对照组1168.595
±
9.973实施例43.220
±
10.873
[0164]
样品1和对照组1样品的心包膜(ga)的红外光谱图如图4所示；样品1和对照组1样品的心包膜(ga)大鼠皮下植入后弹性蛋白定量结果示意图人如图5所示；样品1和对照组1样品的心包膜(ga)大鼠皮下植入后挂钙量检测示意图如图6所示。
[0165]
实施例2
[0166]
改性透明质酸的制备：称取2g分子量为10000的透明质酸钠，并使用20ml pbs溶解，再依次加入6.5ml甲基丙烯酸缩水甘油酯以及4.5ml三乙胺。在37℃摇床上放置7天。最后使用截留分子量为5000的透析袋透析7天，冷冻干燥得到双键化的透明质酸；
[0167]
改性多聚赖氨酸的制备：将多聚赖氨酸溶解在去离子水中，然后以(1:1.5)的摩尔比加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(甲基丙烯酸缩水甘油酯：氨基)。将混合物在37℃摇床上放置7天。最后使用截留分子量为1000的透析袋透析7天，冷冻干燥得到部分双键化的多聚赖氨酸；
[0168]
在本实施例中，新鲜采集的猪心包于4℃100rpm转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后浸泡在180mm改性多聚赖氨酸水溶液在室温当中12小时，然后加入戊二醛溶液至质量浓度为2.5％，在37℃摇床上反应24小时，取出心包材料清洗后浸泡在50mg/ml改性透明质酸水溶液在室温当中12小时，然后采用2.5％过硫酸铵和0.25％n,n,n',n'-四甲基乙二胺在37℃下浸泡12小时，最后采用蒸馏水进行清洗，记为样品2。
[0169]
对实施例2制备的样品2与对照组2样品分别进行水接触角测试、乳酸脱氢酶活性测试、溶血率测试以及钙化测试。
[0170]
对照组2：将新鲜采集的猪心包于4℃100rpm转速振荡条件下用蒸馏水清洗2小时，然后浸泡在质量浓度为0.625％戊二醛溶液中24小时，反应完成后取出浸泡在质量分数为
0.2％的戊二醛溶液中保存。
[0171]
(1)水接触角测试
[0172]
将对照组与实施例1材料裁剪成1*1cm的方片，放在两片玻璃片中间压平，真空冷冻干燥后进行水接触角测试。
[0173]
(2)乳酸脱氢酶活性测试：采集新鲜兔血，1500rpm离心15min，获得富血小板血浆。将对照组以及实施例1材料剪成直径为10mm的圆片并用pbs冲洗3次，放入48孔板中，加入100μl富血小板血浆在37℃浸泡1h。选取100μl富血小板血浆作为阳性对照进行定量检测。孵育后，用pbs冲洗3次。用乳酸脱氢酶测定试剂盒测定血小板粘附的相对量。用酶标仪记录各组在490nm处的吸光度，并计算每组乳酸脱氢酶相对活性，血小板相对数量用乳酸脱氢酶相对活性表示。
[0174]
(3)溶血率测试
[0175]
采集新鲜兔血，1500rpm离心15min，弃上清液，取红细胞。将对照组以及实施例1样品放入2ml离心管中，加入pbs稀释红细胞(9/1,pbs/rbc)在37℃孵育1小时。pbs和去离子水稀释10倍的红细胞设阴性对照和阳性对照。在3000rpm转速下离心5min，把上清转移到96孔板。用酶标仪记录545nm处的吸光度值并计算溶血率。
[0176]
(4)钙化测试
[0177]
在45-50g雄性sd大鼠背部做切口，并用钝器分离皮下组织创建空腔，将对照组以及实施例1的样品放入空腔中，然后缝合皮肤，在30天后取出样品，冷冻干燥并称重，使用1ml6m的盐酸在100℃下消解，然后将消解的溶液用去离子水稀释至10ml，进行电感耦合等离子体原子发射光谱测定钙浓度。
[0178]
实施例2以及戊二醛对照组2最终的水接触角结果如表3所示。
[0179]
表3
[0180]
水接触角(
°
)戊二醛对照组284.29实施例255.26
[0181]
实施例以及戊二醛对照组最终的乳酸脱氢酶活性以及溶血率结果如表4所示。
[0182]
表4
[0183]
乳酸脱氢酶活性溶血率(％)戊二醛对照组20.411.54实施例20.240.38
[0184]
实施例以及戊二醛对照组最终的钙离子浓度结果如表5所示。
[0185]
表5
[0186]
钙离子浓度(μg/mg)戊二醛对照组2188.39实施例236.95
[0187]
结合表3、表4和表5可以发现采用实施例2的方法对生物材料进行处理后，生物材料水接触角均下降，乳酸脱氢酶活性均降低，钙离子含量均减少。
[0188]
如图7所示，该实验为水接触角检测，对照组为戊二醛处理组，实验组为亲水处理
组，实验组水接触角降低。
[0189]
如图8所示，该实验为乳酸脱氢酶活性及溶血率检测，对照组为戊二醛处理组，实验组为亲水处理组，实验组乳酸脱氢酶活性及溶血率均减低。
[0190]
如图9所示，该实验为钙离子浓度检测，对照组为戊二醛实验组，实验组为亲水处理组，实验组钙离子含量均减小。
[0191]
该实施例提供的方法能够提升生物材料的亲水性能及血液相容性和抗钙化能力，潜在地延长其使用寿命。
[0192]
对照组3
[0193]
新鲜采集的猪心包于4℃、100rpm转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，然后浸泡在100mm的戊二醛溶液中，室温下，100rpm转速振荡条件之下交联24小时为对照组。
[0194]
实施例3
[0195]
新鲜采集的猪心包于4℃、100rpm转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时；
[0196]
然后在37℃下浸泡在20mm的2-甲基烯丙胺水溶液中2小时；
[0197]
然后加入戊二醛使其终浓度为100mm，在37℃，100rpm转速振荡条件之下浸泡24小时。
[0198]
取出猪心包，采用蒸馏水进行清洗；
[0199]
将猪心包浸泡在20mm的2-甲基烯丙胺水溶液中2小时；
[0200]
清洗后浸泡于5wt％的n,n'-乙烯基双丙烯酰胺的水溶液中，在37℃条件下浸泡12小时，确保n,n'-乙烯基双丙烯酰胺充分地物理渗透。
[0201]
加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠引发剂引发，过硫酸铵和亚硫酸氢钠的摩尔浓度均为30mm，在37℃条件下反应24小时。为方便区分各实施例制备的样品，本实施例所得样品记为样品3。
[0202]
实施例4
[0203]
新鲜采集的猪心包于4℃、100rpm转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时；
[0204]
然后在37℃下浸泡在20mm的2-甲基烯丙胺水溶液中2小时；
[0205]
然后加入戊二醛使其终浓度为100mm，在37℃，100rpm转速振荡条件之下浸泡24小时；
[0206]
取出猪心包，采用蒸馏水进行清洗；
[0207]
清洗后浸泡于5wt％的1,4-丁二醇二丙烯酸酯的水溶液中，在37℃条件下浸泡12小时，确保1,4-丁二醇二丙烯酸酯充分地物理渗透；
[0208]
加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠引发剂引发，过硫酸铵和亚硫酸氢钠的摩尔浓度均为30mm，在37℃条件下反应24小时。为方便区分各实施例制备的样品，本实施例所得样品记为样品4。
[0209]
实施例5
[0210]
新鲜采集的猪心包于4℃、100rpm转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时；
[0211]
然后在37℃下浸泡在20mm的2-氨基戊-4-烯酸水溶液中2小时；
[0212]
然后加入戊二醛使其终浓度为100mm，在37℃，100rpm转速振荡条件之下浸泡24小时；
[0213]
取出猪心包，采用蒸馏水进行清洗；
[0214]
清洗后浸泡于2wt％的(乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基)二丙烯酸酯的水溶液中，在37℃条件下浸泡12小时，确保(乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基)二丙烯酸酯充分地物理渗透。
[0215]
加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠引发剂引发，过硫酸铵和亚硫酸氢钠的摩尔浓度均为30mm，在37℃条件下反应24小时；
[0216]
用蒸馏水洗涤，浸泡于甘油中，脱水得干膜。为方便区分各实施例制备的样品，本实施例所得样品记为样品5。
[0217]
实施例6
[0218]
新鲜采集的猪心包于4℃、100rpm转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时，
[0219]
然后在37℃下浸泡在20mm的甲基丙烯酸2-氨基乙酯水溶液中2小时，
[0220]
然后加入戊二醛使其终浓度为100mm，在37℃，100rpm转速振荡条件之下浸泡24小时。
[0221]
加入n,n'-乙烯基双丙烯酰胺使其终浓度为5％，在37℃条件下浸泡12小时，确保n,n'-乙烯基双丙烯酰胺充分地物理渗透。
[0222]
加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠引发剂引发，过硫酸铵和亚硫酸氢钠的摩尔浓度均为30mm，在37℃条件下反应24小时。为方便区分各实施例制备的样品，本实施例所得样品记为样品6。
[0223]
实施例7
[0224]
新鲜采集的猪心包于4℃、100rpm转速振荡条件之下蒸馏水清洗2小时；
[0225]
然后在37℃下浸泡在20mm的2-氨基戊-4-烯酸水溶液中2小时；
[0226]
然后加入戊二醛使其终浓度为100mm，在37℃，100rpm转速振荡条件之下浸泡24小时；
[0227]
取出猪心包，采用蒸馏水进行清洗；
[0228]
将心包膜浸泡在50mm的2-氨基戊-4-烯酸水溶液中4小时；
[0229]
清洗后浸泡于2wt％的(乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基)二丙烯酸酯的水溶液中，在37℃条件下浸泡12小时，确保(乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基)二丙烯酸酯充分地物理渗透。
[0230]
加入过硫酸铵和亚硫酸氢钠引发剂引发，过硫酸铵和亚硫酸氢钠的摩尔浓度均为30mm，在37℃条件下反应24小时。为方便区分各实施例制备的样品，本实施例所得样品记为样品7。
[0231]
实施例8
[0232]
改性透明质酸的制备：称取2g分子量为10000的透明质酸钠，并使用20ml pbs溶解，再依次加入6.5ml甲基丙烯酸缩水甘油酯以及4.5ml三乙胺。在37℃摇床上放置7天。最后使用截留分子量为5000的透析袋透析7天，冷冻干燥得到双键化的透明质酸；
[0233]
改性多聚赖氨酸的制备：将多聚赖氨酸溶解在去离子水中，然后以(1：1.5)的摩尔比加入甲基丙烯酸缩水甘油酯(甲基丙烯酸缩水甘油酯：氨基)。将混合物在37℃摇床上放置7天。最后使用截留分子量为1000的透析袋透析7天，冷冻干燥得到部分双键化的多聚赖氨酸；
[0234]
在本实施例中，新鲜采集的猪心包于4℃、100rpm转速振荡条件之下蒸馏水清洗2
小时，然后浸泡在60mm(按赖氨酸算)改性多聚赖氨酸水溶液在室温当中12小时，然后加入戊二醛溶液至质量浓度为250mm，在37℃摇床上反应24小时，取出心包材料清洗后浸泡在50mg/ml改性透明质酸水溶液在室温当中12小时，然后采用2.5％过硫酸铵和0.25％n,n,n',n'-四甲基乙二胺在37℃下浸泡12小时，最后采用蒸馏水进行清洗，记为样品8。相对于对照样2，样品8的水接触角下降，乳酸脱氢酶活性降低，钙离子含量减少，可提升生物材料的亲水性能及血液相容性和抗钙化能力，潜在地延长其使用寿命。
[0235]
对对照例3及实施例3～6所得样品进行胶原酶降解失重率测定。
[0236]
酶降解实验：
[0237]
将样品3、样品4、样品5、样品6、样品7和对照组3裁剪成直径为1cm的圆形片材，每组设置6个平行样。将这些圆形片材样本放置于48孔板，负80℃冷冻过夜然后转移到真空冻干机中冻干48小时。在十万分之一天平上称取每片样品的重量记为初始重量(w0)放回48孔板。用移液枪向48孔板中各孔加入0.5ml胶原酶ⅰ的pbs溶液并保证生物瓣膜样品完全浸没于胶原酶的pbs溶液中(100u/ml)，将48孔板转移到37℃恒温孵育箱中孵育24小时。孵育结束后弃去孔板中的溶液，用胶头滴管吸取去离子水反复吹打孔板中的生物瓣膜样品。经过反复吹洗3次后在负80℃下冷冻过夜然后转移到真空冻干机中冻干48小时。在十万分之一天平上称取每片样品经过胶原酶溶液降解后的重量记为最终重量(wt)。酶降解失重率计算公式如下：
[0238][0239]
结果如表6所示，由表6的结果可知，本技术的制备方法能够显著提高生物材料的交联度。
[0240]
表6胶原酶降解失重率。
[0241][0242][0243]
对样品3、样品4、样品5、样品6、样品7和对照组3进行酶降解实验以表征各组样品的交联度，利用胶原酶ⅰ处理样品3、样品4、样品5、样品6、样品7和对照组3后计算各组样品的酶降解失重率，结果如表6。样品3、样品4、样品5、样品6、样品7的酶降解失重率均低于对照组3，表明样样品3、样品4、样品5、样品6的酶降解稳定性均高于对照组3，即样品3、样品4、样品5、样品6的交联度更高。酶降解实验结果表明本技术共交联后双键交联生物瓣膜材料的制备方法能够提高生物瓣膜材料的交联度。
[0244]
茜素红染色实验：
[0245]
将在鼠皮下植入30天后取出的材料样品(样品3、样品4、样品5、样品6、样品7和对照组3)用pbs清洗。清洗结束后用4％(w/v)的多聚甲醛pbs组织固定液室温固定24小时。固定结束后取出用手术刀进行修理平整后转移到脱水盒中。用50％、75％、85％、95％(v/v)和无水乙醇对材料样品进行梯度脱水。脱水结束后将材料样品转移至包埋机用融化的石蜡进行包埋，然后转移到-20℃冰箱冷却、修整形状。在切片机上从修整好的蜡块切取3-5μm厚的切片，从摊片机转移至载玻片上并进行脱蜡和复水。用茜素红染液对切片进行染色3分钟，经水洗、烘干后用二甲苯通透5分钟。切片用中性树胶封片后在病理切片扫描仪上采集染色结果图像。
[0246]
通过茜素红染色实验对植入到大鼠皮下30天后的样品3、样品4、样品5、样品6、样品7和对照组3进行染色以表征各组样品的钙化程度。植入到大鼠皮下30天后样品切片的茜素红染色结果图像如图11-16所示，其中茜素红染色后样品的颜色越深表明钙化程度越高。相比于对照样3切片的茜素红染色结果(图11)，样品3、样品4、样品5、样品6、样品7的茜素红染色结果图颜色明显较淡，这表明样品3、样品4、样品5、样品6、样品7的钙化程度低于对照样3，即样品3、样品4、样品5、样品6、样品7相比于对照组3具有一定的抗钙化效果。对植入到大鼠皮下30天后的样品3、样品4、样品5、样品6、样品7和对照组3的茜素红染色结果表明本技术共交联后双键交联生物瓣膜材料的制备方法能够提升生物瓣膜的抗钙化性能。
[0247]
以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。