环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸类似物在制备免疫增强剂或疫苗增效剂中的应用

1.本发明属于兽用疫苗领域，具体涉及一种环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸类似物在制备免疫增强剂或疫苗增效剂中的应用。


背景技术：

2.口蹄疫(foot and mouth disease，fmd)是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus， fmdv)引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病。危害猪、牛、羊等偶蹄类动物，引起的经济损失和社会影响巨大，世界动物卫生组织(world organizationfor animal health，oie)将其列为法定报告疫病，我国将其列为一类动物疫病。其病原口蹄疫病毒血清型多(7个)，基因变异快，宿主范围广，且免疫原性较弱，且疫苗免疫实验动物后的抗体应答水平及持续期短。提高疫苗的免疫抗体水平及免疫持续期显得迫在眉睫。
3.免疫增强剂能够增加机体对抗原的免疫应答，提高免疫效果。其通过模式识别受体等作用于免疫系统，刺激相关免疫细胞(吞噬细胞，nk细胞等)的增殖和分化，调节或增强tfh 细胞作用，诱导抗体c区基因同型转换，最终分化为分泌高亲和力igg的长效细胞和记忆性 b细胞。同时浆细胞进入外周血持续分泌抗体，而记忆b细胞再次接触抗原可迅速活化发挥局部效应。
4.本发明通过大量的实验室动物试验筛选及优化意外发现了一种稳定的环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸(cgamp)类似物按照一定比例添加至口蹄疫抗原中，通过等量配比佐剂乳化后免疫抗体阴性实验动物，能够显著提高口蹄疫疫苗免疫抗体水平，且能够延长免疫持续期，可作为口蹄疫疫苗优良的免疫增强剂或疫苗增效剂，具有广阔的应用前景。


技术实现要素：

5.针对上述口蹄疫疫苗免疫原性较弱，且疫苗免疫实验动物后的抗体应答水平及持续期短的问题，本发明筛选获得一种优良、应用前景广阔的口蹄疫疫苗的免疫增强剂，所述口蹄疫疫苗的免疫增强剂为一种稳定的环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸(cgamp)类似物，将其按照一定比例添加至口蹄疫抗原中后，通过等量配比佐剂乳化后免疫实验动物，和对照组未添加免疫增强剂，以及其他cgamp类似物(sting agonist-20和tak-676)相比，具有提高口蹄疫疫苗免疫抗体水平，且能延长免疫持续期的效果。
6.具体包括以下内容：
7.第一方面，本发明提供了一种环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸类似物或其药学上可接受的盐在制备免疫增强剂或兽用疫苗增效剂中的应用，所述环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸类似物的化学结构如下式(i)所示：
[0008][0009]
优选地，所述免疫增强剂协同兽用疫苗起到免疫增强的作用。
[0010]
优选地，所述兽用疫苗为口蹄疫疫苗。
[0011]
优选地，所述环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸类似物或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的任一辅料制成药学上可接受的任一剂型。
[0012]
第二方面，本发明提供了一种环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸类似物或其药学上可接受的盐在制备疫苗/疫苗组合物中的应用，所述环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸类似物的化学结构如下式(i) 所示：
[0013][0014]
优选地，所述环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸类似物或其药学上可接受的盐添加至兽用疫苗抗原中，乳化配制成兽用疫苗/疫苗组合物。
[0015]
优选地，所述兽用疫苗为口蹄疫疫苗。
[0016]
第三方面，本发明提供了一种兽用疫苗或疫苗组合物，所述兽用疫苗或疫苗组合物包括疫苗抗原、环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸类似物或其药学上可接受的盐；所述环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸类似物的化学结构如下式(i)所示：
[0017]
[0018]
优选地，所述兽用疫苗或疫苗组合物还包括兽用疫苗佐剂。
[0019]
优选地，所述兽用疫苗佐剂选自化学类免疫佐剂、生物有机分子佐剂中的人一种或几种组合。
[0020]
优选地，所述化学类免疫佐剂包括矿物油佐剂、水溶性佐剂、有机盐佐剂和脂类佐剂等。
[0021]
优选地，所述矿物油佐剂包括isa 206vg、isa 201vg和isa 61vg；所述水溶性佐剂包括ims1313vg、gel02；所述有机盐佐剂包括氢氧化铝和碳酸钙佐剂；所述脂类佐剂包括含季铵盐的阳离子脂质dda。
[0022]
优选地，所述佐剂为矿物油佐剂isa 201vg。
[0023]
第四方面，本发明提供了一种口蹄疫疫苗，所述口蹄疫疫苗包括口蹄疫疫苗抗原、环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸类似物或其药学上可接受的盐；所述环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸类似物的化学结构如下式(i)所示：
[0024][0025]
优选地，所述口蹄疫疫苗还包括疫苗佐剂。
[0026]
优选地，所述疫苗佐剂选自化学类免疫佐剂、生物有机分子佐剂中的人一种或几种组合。
[0027]
优选地，所述化学类免疫佐剂包括矿物油佐剂、水溶性佐剂、有机盐佐剂和脂类佐剂等。
[0028]
优选地，所述矿物油佐剂包括isa 206vg、isa 201vg和isa 61vg；所述水溶性佐剂包括ims 1313vg、gel 02；所述有机盐佐剂包括氢氧化铝和碳酸钙佐剂；所述脂类佐剂包括含季铵盐的阳离子脂质dda。
[0029]
优选地，所述佐剂为矿物油佐剂isa 201vg。
[0030]
第五方面，本发明提供了上述第四方面所述口蹄疫疫苗的制备方法，所述方法为：将环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸类似物或其药学上可接受添加至口蹄疫抗原中，乳化配制成口蹄疫疫苗。
[0031]
本发明的有益效果是：(1)首先，本发明通过大量的实验室动物试验筛选及优化意外发现了一种稳定的环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸(cgamp)类似物，可用于口蹄疫疫苗中的免疫增强剂，能够提高口蹄疫疫苗免疫抗体水平及延长免疫持续期；(2)将所述的环鸟苷单磷酸腺苷单磷酸(cgamp)类似物添加到口蹄疫疫苗抗原中，经过乳化制备成口蹄疫疫苗，能够显著增强疫苗免疫效果，具有极高的应用前景和经济效益。
附图说明
[0032]
图1为实施例3中口蹄疫有效抗原146s含量测定，应用蔗糖密度梯度结合液相色谱仪定量测定的峰图；
[0033]
图2为抗原中分别添加不同免疫增强剂的化学分子式；其中a为本技术所述的cgamp 类似物，b为sting agonist-20，c为tak-676；
[0034]
图3为实施例5中免疫a组和d组第28d采实验猪前腔静脉血清血，用elisa试剂盒定量检测血清中的细胞因子。
具体实施方式
[0035]
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行进一步的详细描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
[0036]
本发明中相关术语的说明及解释：
[0037]
以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和口蹄疫实验室活动许可：
[0038]
中国农业科学院兰州兽医研究所根据国家口蹄疫参考实验室(bsl-3)和口蹄疫相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性fmdv病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
[0039]
下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(第五版)(奥斯伯主编，金由辛译，北京：科学出版社，2008)中所述的方法进行。
[0040]
实施例1口蹄疫病毒抗原的制备
[0041]
在透气的三角摇瓶(优选corning 250ml)中培养悬浮bhk-21细胞，培养条件：温度为 37℃、ph为7.0、悬浮摇床转速为100rpm、co2浓度为5％，培养摇床为瑞士阿道夫可耐箱式温控摇床(型号：isf1-x)，待悬浮bhk-21细胞密度生长至3.0～6.0
×
106cell/ml后，用 nahco3溶液调节细胞液的ph＝7.8，接种fmdv种子批re-o/mya98/jscz/2013-f3，从接毒后定时在无菌条件下取样，进行台盼蓝染色细胞计数及活力检查，待细胞活率低于20％后，收获病毒。
[0042]
实施例2口蹄疫病毒抗原的灭活及安检
[0043]
将收获的病毒-80℃反复冻融3次后，将除菌过滤的0.1mol/l的bei溶液加入病毒液中，使其终浓度为0.002mol/l，当摇床温度降至30℃下时开始计时，在30℃下维持28小时。将灭活病毒液按8％～10％的量接种于5瓶生长良好的bhk-21细胞单层100ml的细胞培育瓶，每瓶加入2ml，吸附30分钟，加入细胞维持液8ml，同时设空白细胞对照2瓶，置37℃培养 72小时，应不出现细胞病变，收获培养物冻融后再取样接种bhk-21细胞盲传两代，均不出现细胞病变则安检合格。
[0044]
实施例3口蹄疫有效抗原146s含量测定
[0045]
取6支12ml离心管，每支离心管分别加入蔗糖溶液，其中15％蔗糖溶液2ml、25％的蔗糖溶液2.5ml、35％的蔗糖溶液2.5ml、45％的蔗糖溶液2.5ml，观察不同浓度之间界限清
晰可见，然后置于4℃过夜(10～20h)以形成连续梯度，或用梯度制备仪制备连续梯度，样品 10000r/min离心5min，取1.5ml样品加入装有蔗糖梯度的离心管，以10℃，35000rpm离心 3h。将安捷伦1260液相色谱仪流速调为1ml/min，在259nm波长下测定紫外吸光光度值，电脑自动记录检测曲线，根据检测曲线，对146s抗原峰手动积分，结合1μg口蹄疫146s抗原的峰面积计算所得每毫升抗原的146s含量。结果如图1所示，结果显示制备抗原 146s＝8.5μg/ml。
[0046]
实施例4口蹄疫病毒疫苗的乳化配制及免疫
[0047]
在无口蹄疫疫区筛选体重约30kg口蹄疫阴性猪12头，并经国家口蹄疫参考实验室生产的口蹄疫液相阻断elisa(lpb-elisa)检测o型抗体≤1:8。
[0048]
将制备的fmd抗原分成4等份，其中3份抗原中分别添加不同免疫增强剂作为实验组 a-c(分别为：a为本技术所述的cgamp类似物、b为sting agonist-20、c为tak-676)，分子式详见图2，添加剂量均为1mm/头份；1份不添加作为对照组d。将上述抗原与isa 201vg 佐剂以1:1重量比混合后，按照sop乳化即得水包油剂型乳液，并按照检验程序测定疫苗粒径、黏度、离心检测等指标，待检测合格后，免疫口蹄疫非结构蛋白3abc-elisa抗体检测为阴性的动物，每组各免疫3头，每周采血清血检测抗体水平。
[0049]
结果如表1所示，显示各组在免疫了同等剂量口蹄疫疫苗抗原的情况下，只有添加了本技术所述的cgamp类似物(实验组a)的疫苗免疫猪后抗体水平显著升高；表明本技术所述的cgamp类似物具有免疫增强效果，可作为疫苗免疫增强剂或疫苗增效剂，提高口蹄疫疫苗的免疫效果，具有广阔的应用前景。
[0050]
表1相同146s含量口蹄疫疫苗免疫抗体情况
[0051][0052]
实施例5免疫后细胞因子水平的检测
[0053]
第28d采实施例4中实验组a和对照组d的免疫实验猪的血清血，用elisa试剂盒(公司：solarbio，货号：sekp-0002、0003、004)定量检测il-2、il-4和il-6细胞因子水平。结果如图3所示，表明，添加本技术所述cgamp类似物的实验组，明显促进il-2、il-4和 il-6细胞因子的分泌水平，这与抗体水平相呼应，进一步说明本技术所述的cgamp类似物应答更高抗体水平，且同时分泌更多可以活化外周血t淋巴细胞、b淋巴细胞增值、分化为产生抗体的浆细胞的细胞因子。
[0054]
上述实施例仅示例性说明本发明的优选实施例，而非用于限制本发明。任何熟悉相关技术的人员皆可在不违背本发明的范畴下，对上述实施例进行修改。因此，所属技术领域中具有通常知识技术人员在未脱离本发明所揭示的技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。