含有鼠李糖乳杆菌JL1后生元粉的组合物及制法和应用

含有鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉的组合物及制法和应用
技术领域
1.本发明涉及一种含有鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉的组合物及制法和应用，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉剂与低聚果糖复合配方及其制备方法及在缓解ova和al(oh)3诱导小鼠炎症功能中的应用。属于微生物技术领域。


背景技术：

2.炎症作为机体组织处于不适状况下的最初警报，其严重程度时刻反应着机体内部或部分组织的损伤状态。随着生活环境的复杂性日益增加，导致人体内出现各种炎症的患病率也在不断增加。炎症的患病情况多为局部发生，一旦发生表面大面积炎症或多器官炎症，将导致患者休克甚至是死亡。
3.炎症的发生多伴随着表面红肿现象与机体内免疫因子含量的变化。现有的乳杆菌抗炎作用研究一般基于多种乳杆菌复配，多数依赖于乳杆菌本身的功能特性并进行制备处理，虽然也具有一定的抗炎作用，但效果一般。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉剂与低聚果糖复配的微生物制剂在缓解ova和al(oh)3诱导小鼠炎症中的应用。缓解ova诱导小鼠炎症为提高血清中il-4、il-5、il-13、ige含量，降低干扰素-γ、免疫球蛋白igg2a含量。
5.同时，本发明提供了一种鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉剂与低聚果糖复配的制法。
6.同时，本发明提供一种含有鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉的组合物。
7.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种含有鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉的组合物，包括按照质量比例2:1复配的鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉与低聚果糖。
8.所述鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉中，含有浓度为109cfu/ml鼠李糖乳杆菌jl1的灭活菌体、0.225mg/g的次黄嘌呤和0.0994mg/ml的琥珀酸。
9.一种含有鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉的组合物的制法，包括以下步骤：步骤一，鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉的制备：取活化后的鼠李糖乳杆菌jl1菌株，以5%的接种量接种于200ml脱脂乳粉培养基，37℃扩大培养14h后，以5%的接种量进行4l高密度发酵，发酵14h，得到含有109cfu/ml活菌数和抗炎成分的发酵液，将所得到的发酵液进行喷雾干燥，设置通针频率8hz，蠕动速度5，进风180℃，获得热灭活的鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉；步骤二，将步骤一获得的鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉与低聚果糖按照质量比例2:1进行复配，获得组合物。
10.所述抗炎成分包括0.225mg/g的次黄嘌呤和0.0994mg/ml的琥珀酸。
11.所述组合物用于功能性食品或保健品中的成分。
12.一种含有鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉的组合物在制备抗炎药品中的应用。
13.一种含有鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉的组合物在制备抑制机体中促炎因子水平升高的抗炎产品中的应用。
14.一种含有鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉的组合物在制备促进机体中抗炎因子水平升高的缓解炎症产品中的应用。
15.本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种安全有效的鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉剂与低聚果糖复配的微生物制剂在缓解ova诱导小鼠炎症的应用及一种含有抗炎成分的鼠李糖乳杆菌后生元粉与低聚果糖复配的制法，可降低ova诱导的炎症小鼠的il-4、il-5、il-13含量、升高干扰素-γ、免疫球蛋白igg2a含量，缓解机体出现的炎症。且本发明的制法使得制备的后生元粉末中含有次黄嘌呤、琥珀酸抗炎成分，再通过添加一定比例的具有潜在抗炎作用的低聚果糖与之复配，可显著提升后生元粉的缓解炎症作用；可见本发明的鼠李糖乳杆菌后生元粉与低聚果糖复配的组合物在制备炎症的产品中具有巨大的应用前景。
附图说明
16.图1为不同剂量浓度的鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉剂或产品或复合组对血清中免疫因子的影响，其中，a是il-4含量，b是il-5含量，c是il-13含量，d是ige含量，e是干扰素-γ含量，f是免疫球蛋白igg2a含量；横坐标是组别，纵坐标是含量。
具体实施方式
17.下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
18.本发明中，鼠李糖乳杆菌jl1的拉丁名为lactobacillus rhamnosus jl1，保藏于东北农业大学乳品重点实验室，分离自四月龄婴儿的粪便样本，采集地为哈尔滨医科大学附属第一医院，公众可以从东北农业大学获得。本发明中的鼠李糖乳杆菌jl1的现有技术来源为：protective effects of a novel lactobacillus rhamnosus strain with probiotic characteristics against lipopolysaccharide induced intestinal inflammation in vitro and in vivo[j] .food&function。
[0019]
实施例1一种含有鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉的组合物，所述组合物为微生物粉剂，所述微生物粉剂为鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉与低聚果糖的组合物。
[0020]
鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉可作为功能性食品、药品或保健品成分。
[0021]
鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉的制法中，发酵罐中设置有脱脂乳粉培养基。
[0022]
脱脂乳粉培养基按重量百分比计组分配制而成：0.25%麦芽糖、0.02%氯化钠、0.8%醋酸钠、2～3%蛋白胨、2～3%牛肉膏、2～3%酵母膏、8%葡萄糖、0.35%柠檬酸二铵、0.15%磷酸氢二钾、0.08%硫酸镁、0.03%硫酸锰、0.03%硫酸亚铁、其余为脱脂奶粉和水。
[0023]
鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉的制法中，液体发酵环境为：温度35～37℃，湿度65～70%，ph值《7，通气量0.7～1.5vvm，搅拌机功率1.5～2kwh/m3。
[0024]
一种含有鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉的组合物的制法如下：取活化后的鼠李糖乳杆菌jl1菌株，以5%的接种量接种于200ml脱脂乳粉培养基，37℃扩大培养14h后，以5%的接种量在容积为4l的发酵罐进行高密度发酵。高密度发酵为在液体培养中的细胞密度超过常
规培养10 倍以上的发酵分别发酵10h、12h、14h，得到含有107cfu/ml、108cfu/ml、109cfu/ml活菌数的发酵液，将所得到的发酵液进行喷雾干燥，设置通针频率8hz，蠕动速度5，进风180℃，获得热灭活的鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉末。制备109cfu/ml活菌数的发酵液制备的150mg/kg后生元粉，通过与低聚果糖（纯度≥90%）按照比例2:1进行复配，从而获得鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉与低聚果糖的组合物。
[0025]
鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉含有浓度为109cfu/ml鼠李糖乳杆菌jl1的菌体及具有抗炎作用的代谢产物或成分。
[0026]
鼠李糖乳杆菌jl1在未灭活前，使用紫外分光光度计测定发酵了10h、12h、14h的鼠李糖乳杆菌jl1的菌体密度值（a
600nm
），至少为3.69
±
0.07、4.34
±
0.05、5.16
±
0.02，从而确定组合物所含有的菌体含量，鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉中鼠李糖乳杆菌jl1的含量从低到高至少为107、108、109cfu/ml。
[0027]
鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉中，含有基于hplc法测量的次黄嘌呤、琥珀酸抗炎成分。其测定过程如下：（1）采用hplc法测定鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉中次黄嘌呤的含量。其测定过程如下：精密称取1.0g鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉（浓度为109cfu/ml）放入50ml量瓶中，注入20ml生理盐水，振摇，混匀，密塞，采用功率450w的超声波处理器提取30~50min，并放置常温，加入生理盐水定容至量瓶刻度，充分摇匀后经0.22μm微孔滤膜过滤器过滤，将滤液收集于瓶中，以10μl样品量注入高效液相色谱仪中，与次黄嘌呤标准溶液相比，计算测定次黄嘌呤的含量值为0.225mg/g。hplc法测定条件如下：选用乙腈-0.02%磷酸溶液为流动相进行洗脱，检测波长为254nm，选用1.0ml/min流速，10μl/次进样量，30℃柱温。
[0028]
（2）采用uplc-ms法测定后生元粉中的琥珀酸含量。其测定过程如下：采用上述同种制法，精密称取1.0g鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉（浓度为109cfu/ml）放入50ml量瓶中，注入20ml生理盐水，取样品100μl，加入乙腈 200μl，涡旋混合2min，在15000r/min离心10min后，上清液2μl注入uplc-ms分析，与琥珀酸标准溶液相比，测定琥珀酸的含量值为0.0994mg/ml。uplc-ms法测定条件如下：选用流动相为甲醇-水（v/v，1∶1），流速为0.3ml/min，进样量为2μl，40℃柱温。
[0029]
组合物对于缓解ova诱导炎症的小鼠的作用效果好于抗炎药物与低剂量鼠李糖菌泥。
[0030]
一种低剂量鼠李糖乳杆菌jl1后生元菌泥的制法如下：取活化后的鼠李糖乳杆菌jl1菌株，以5%的接种量接种于200ml脱脂乳粉培养基，37℃扩大培养14h后，以5%的接种量进行4l高密度发酵，发酵10h，得到含有107cfu/ml活菌数的发酵液，经过5000r/min离心20min，获得鼠李糖乳杆菌jl1后生元菌泥。
[0031]
鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉与低聚果糖的组合物在缓解ova诱导小鼠炎症中的应用：（a）在抑制机体中促炎因子水平的升高的抗炎产品的应用；（b）在促进机体中抗炎因子水平的升高的缓解炎症产品的应用。
[0032]
本实施例的组合物在缓解ova诱导小鼠炎症的效果优于具有抗炎效果的抗炎药品。
[0033]
本实施例的组合物为微生物制剂，所述微生物制剂含有鼠李糖乳杆菌jl1的菌体
并保留了具有抗炎作用的代谢产物或成分，以及一定比例的低聚果糖。
[0034]
本实施例的组合物可为功能性食品或保健品的成分。
[0035]
本实施例的组合物中含有基于hplc法和uplc-ms法分析测定的次黄嘌呤、琥珀酸抗炎成分。
[0036]
本实施例的鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉中，鼠李糖乳杆菌jl1的含量从低到高至少为107、108、109cfu/ml。
[0037]
本实施例的鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉可作为功能性食品、药品或保健品成分。
[0038]
实施例2一种含有鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉的组合物的制法：取活化后的鼠李糖乳杆菌jl1菌株，以5%的接种量接种于200ml脱脂乳粉培养基，37℃扩大培养14h后，以5%的接种量进行4l高密度发酵，分别发酵10h、12h、14h，得到含有107cfu/ml、108cfu/ml、109cfu/ml活菌数的发酵液，将所得到的发酵液进行喷雾干燥，设置通针频率8hz，蠕动速度5，进风180℃，获得热灭活后生元粉末。分别制备107cfu/ml、108cfu/ml、109cfu/ml活菌数的发酵液制备的150mg/kg后生元粉，通过与低聚果糖（纯度≥90%）按照比例2:1进行复配，获得鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉与低聚果糖的组合物。
[0039]
实施例3：一种低剂量鼠李糖乳杆菌jl1菌泥的制备：取活化后的鼠李糖乳杆菌jl1菌株，以5%的接种量接种于200ml脱脂乳粉培养基，37℃扩大培养14h后，以5%的接种量进行4l高密度发酵，发酵10h，得到含有107cfu/ml活菌数的发酵液。经过5000r/min，30min离心后，收集鼠李糖乳杆菌jl1下层菌泥，获得低剂量鼠李糖乳杆菌jl1菌泥样品。
[0040]
利用以下实验验证实验效果：一、材料与方法1、实验材料选用40只雌性balb/c小鼠，鼠龄为7周龄左右，体重为20-25g，并以23
±
2℃和55
±
5％的相对湿度饲养，保持12小时的明暗周期，小鼠自由采食饮水和饲料，水应该为纯净水，且每天更换饮用水。ova试剂购自美国sigma公司。al(oh)3试剂购自阿拉丁试剂公司。
[0041]
2、动物分组将40只雌性balb/c小鼠随机分为8组（n=5只/组）：空白组、模型组（ova+ al(oh)3）、低剂量后生元粉组（ova+al(oh)3+107cfu/ml鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉）、中剂量后生元粉组（ova+al(oh)3+108cfu/ml鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉）、高剂量后生元粉组（ova+al(oh)3+109cfu/ml鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉）、低剂量菌体组（ova+al(oh)3+107cfu/ml低剂量鼠李糖乳杆菌jl1菌泥）、高剂量后生元粉复合组（ova+al(oh)3+109cfu/ml鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉+低聚果糖）、抗炎产品组（ova+al(oh)3+阿司匹林片剂粉末）。小鼠购买后，采用正常基础饲料适应环境3天，自由饮水。从第四天开始，空白组灌胃0.2ml无菌pbs溶液，模型组及其余各组除灌胃定量ova和al(oh)3溶剂外，再分别灌胃0.2ml相应剂量的相应鼠李糖乳杆菌jl1后生元制剂，并监测小鼠的体重。
[0042]
3、样本制备第23天后经ova注射后，记录1h内小鼠所表现出的异常行为举止，称重，杀死小鼠，
摘除眼球取血，室温静置30min后，离心1000r/min，10min，收集血清冻存于-80℃备用。脾脏、胸腺，称重后于-80℃冻存。
[0043]
4、胸腺指数的测定胸腺指数=（胸腺重量/小鼠体重）
×
1005、脾脏指数的测定脾脏指数=（脾脏重量/小鼠体重）
×
1006、血清ige、il-4、il-5、il-13、干扰素-γ、免疫球蛋白igg2a测定按照上海鑫乐il-4、il-5、il-13、ige、干扰素-γ、免疫球蛋白igg2a酶联免疫分析试剂盒，检测小鼠血清中il-4、il-5、il-13、ige、干扰素-γ、免疫球蛋白igg2a的含量。
[0044]
7、数据处理及统计学分析所有实验数据均使用spss软件进行单因素方差分析，使用graphpad prism 8.02进行绘图分析。实验结果以平均值
±
标准差（mean
±
sd）表示，p《0.05 代表差异显著。
[0045]
二、实验结果1、鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉剂对胸腺指数的影响：胸腺指数直接反应了小鼠胸腺的组织状态，胸腺指数的增加直接反应了小鼠胸腺出现肥大肿胀状态，其胸腺呈现的肿大状态越明显，则表示所患炎症情况越严重。如表1所示，通过灌胃不同剂量浓度的鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉剂，高剂量后生元粉复合组的胸腺体重比值相较于模型组低，表明高剂量后生元粉复合组可明显缓解小鼠因炎症而导致的胸腺肿大情况。
[0046]
表1 不同组别对小鼠胸腺指数的影响
2、鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉剂对脾脏指数的影响：脾脏指数直接反应了小鼠脾脏的组织状态，脾脏指数的增加直接反应了小鼠脾脏出现肥大肿胀状态，其脾脏呈现的肿大状态越明显，则表示所患炎症情况越严重。如表2所示，通过灌胃不同剂量浓度的鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉剂，高剂量后生元粉复合组小鼠脾脏体重比值相较于模型组低，表明高剂量后生元粉复合组可明显缓解小鼠脾脏肿大情况。
[0047]
表2 不同组别对小鼠脾脏指数的影响3、鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉剂对血清ige、il-4、il-5、il-13、干扰素-γ和免疫球蛋白igg2a的影响：ige、il-4、il-5、il-13作为机体内重要的促炎因子，由图1可以看出，经过灌胃鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉剂，相较于模型组，高剂量后生元粉+低聚果糖组中促炎因子含量下降，起到缓解小鼠炎症的作用。干扰素-γ和免疫球蛋白igg2a作为机体内重要的抗炎因子，由图1可以看出，相较于模型组，高剂量鼠李糖乳杆菌后生元粉+低聚果糖组中抗炎因子含量上升，起到缓解小鼠炎症的作用。
[0048]
上述实验结果表明，本发明制备的鼠李糖乳杆菌jl1后生元粉剂可通过消除胸腺和脾脏的肥大肿胀，降低促炎因子水平，升高抗炎因子水平，从而缓解ova诱导的小鼠炎症，且高剂量鼠李糖乳杆菌jl1粉剂与低聚果糖的复合物具有一定的强化功能。
[0049]
综上所述，本发明公开了一种代谢物中含有多种抗炎成分的鼠李糖乳杆菌后生元粉与低聚果糖复配的组合物的制法，属于微生物技术领域。本发明提供鼠李糖乳杆菌后生元粉与低聚果糖复配的组合物可显著降低ova和al(oh)3诱导小鼠炎症的ige、il-4、il-5以
及il-13水平，升高了干扰素-γ、免疫球蛋白igg2a，起到缓解机体炎症的作用，且本发明的制法使得制备的后生元粉末中含有次黄嘌呤、琥珀酸抗炎成分，再通过添加一定比例的具有潜在抗炎作用的低聚果糖与之复配，可显著提升后生元粉的缓解炎症作用；可见本发明的鼠李糖乳杆菌后生元粉与低聚果糖复配的组合物在制备炎症的产品中具有巨大的应用前景。
[0050]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。