抗血管生成素样蛋白4抗体在制备抑制炎症因子表达的药物中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及抗血管生成素样蛋白4抗体在制备抑制炎症因子表达的药物中的应用。


背景技术：

2.类风湿关节炎(ra)是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病，其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，经常伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性，可以导致关节畸形及功能丧失。ra关节炎的病理主要有滑膜衬里细胞增生、间质大量炎性细胞浸润，以及微血管的新生、血管翳的形成及软骨和骨组织的破坏等。
3.目前，已将靶向肿瘤坏死因子α(tnf-α)、b细胞或t细胞的生物化合物(诸如抗体)用于治疗ra，但仍有许多患者未能对这些疗法响应。如cn104995210a公开一种用于治疗类风湿关节炎的抗gm-csf抗体。cn110585428a公开b细胞疫苗在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用，所述b细胞疫苗由胶原诱导性关节炎小鼠的脾脏细胞经分选后获得的non-b10 b细胞制备而成；所述分选方法是：脾脏细胞先经抗体cd19-fitc、cd5-apc、cd1d-pe进行表面染色，然后进行流式细胞分选，收集除b10细胞(cd19+cd5+cd1dhi)之外的所有b细胞，获得non-b10 b细胞；所述制备方法是：将non-b10 b细胞在有功能抗体anti-cd40、cpg、二型胶原(cii)和baff存在的条件下刺激培养，然后再经钴源照射，获得疫苗。
4.angptl4含有一个n末端卷曲螺旋结构域和一个c末端纤维蛋白原样结构域，在体内有3种活性形式，分别为全长血管生成素样蛋白4(flangptl4)，n端(nangptl4)和c端(cangptl4)片段。能够中和angptl4的至少一种活性形式的抗体被广泛应用于治疗脂质代谢疾病，如cn101128485公开一种针对angptl4的单克隆抗体，还提供了单克隆抗体在制备治疗患者的脂质代谢疾病的药物中的应用。
5.综上所述，开发新型的类风湿关节炎治疗药物，为治疗类风湿关节炎提供新思路、新手段，对于类风湿关节炎治疗领域具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明针对目前临床上多数类风湿关节炎药物作用效果单一的问题，以及对新型的类风湿关节炎治疗药物的需求，提供了抗血管生成素样蛋白4抗体在制备抑制炎症因子表达的药物中的应用，发现抗血管生成素样蛋白4可以通过降低促炎细胞因子白介素-6(il-6)发挥抗炎作用，并兼具抑制骨破坏的作用，可应用于制备抗骨及关节炎症疾病治疗的药物。
7.为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供抗血管生成素样蛋白4抗体在制备抑制炎症因子表达的药物中的应用。
9.本发明中，经过ra研究领域经典的胶原诱导性关节炎(cia)动物模型进行了药物
的药效学验证，在实验过程中，通过测量体重和足爪肿胀评价了抗angptl4抗体对关节肿胀的缓解作用，通过对动物模型的血清检测表明抗angptl4抗体治疗可以明显降低炎症因子的表达。
10.优选地，所述炎症因子包括白介素-6(il-6)。
11.本发明中，所述抗血管生成素样蛋白4抗体指靶向结合全长血管生成素样蛋白4的flangptl4片段、nangptl4片段或cangptl4中任意一种的抗体，现有的抗angptl4抗体临床应用范围主要是治疗脂质代谢疾病的药物。
12.可以理解，本领域内公开抗angptl4抗体均适用于本发明，具体地，所述抗angptl4抗体可选自人源化单克隆抗体，具体氨基酸序列参见us10160803b2。
13.优选地，所述药物还包括辅料。
14.优选地，所述辅料包括药学上可接受的载体、润湿剂、崩解剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、ph调节剂、抗氧化剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
15.第二方面，本发明提供抗血管生成素样蛋白4抗体在制备治疗慢性骨及关节炎症疾病的药物中的应用。
16.本发明利用胶原诱导性关节炎(cia)动物模型对抗angptl4抗体进行药物的药效学验证，micro-ct扫描数据以及组织学染色结果显示，抗angptl4抗体可以有效改善ra的踝关节的骨破坏，并可以缓解关节局部的滑膜增生和炎症细胞的浸润。
17.优选地，所述慢性骨及关节炎症疾病包括类风湿关节炎、骨关节炎、骨质增生、肩周炎、骨膜炎、滑囊炎或滑膜炎中任意一种或至少两种的组合。
18.第三方面，本发明提供抗血管生成素样蛋白4抗体在制备治疗骨破坏疾病的药物中的应用。
19.优选地，所述骨破坏疾病包括股骨头坏死、难愈性骨折或肿瘤骨转移中的任意一种或至少两种的组合。
20.本发明中，通过构建胶原诱导性关节炎(cia)的小鼠动物模型，应用不同剂量的抗angptl4抗体对cia模型进行治疗干预，结果显示抗angptl4抗体可并可缓解疾病的进展，影像学及组织学结果显示抗angptl4抗体治疗后的小鼠踝关节明显改善骨破坏情况，可用于开发治疗股骨头坏死、难愈性骨折、肿瘤骨转移引发的骨破坏等相关性疾病。
21.第四方面，本发明提供一种以非治疗为目的的抗血管生成素样蛋白4抗体在制备炎症因子表达的抑制剂中的应用。
22.本发明中，所述抑制剂指能够抑制炎症因子表达的试剂。
23.本发明中，发现抗血管生成素样蛋白4抗体能够调控体内促炎细胞因子白介素-6(il-6)表达水平，其可作为抑制剂，应用于白介素-6(il-6)相关行为的基础研究中。
24.第五方面，本发明提供一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的抑制炎症因子表达的方法，所述方法包括：
25.利用抗血管生成素样蛋白4抗体制备抑制炎症因子表达，所述炎症因子包括白介素-6。
26.本发明中，可利用抗血管生成素样蛋白4抗体作为抑制剂应用于白介素-6(il-6)相关行为的基础研究中，如构建白介素-6(il-6)低表达动物模型。
rheumatoid arthritis.immunopharmacology and immunotoxicology 40(2018)193-200.)，结果如图2所示，表明抗angptl4抗体治疗可缓解cia动物模型中足爪肿胀的临床症状。
41.实施例2
42.本实施例进行angptl4表达量及炎症因子表达变化的检测。
43.取实施例1造模7周后小鼠，麻醉小鼠后，进行心脏取血，静置分离获取血清，使用elisa检测试剂盒，检测血清中angptl4表达量变化以及细胞因子il-6的含量变化，angptl4表达量变化结果如图3所示，与cia组相比，低剂量治疗组(50mg/kg)、高剂量治疗组(200mg/kg)的小鼠血清angptl4表达量显著降低，表明可有效中和血清中的angptl4。细胞因子il-6的含量变化结果如图4所示，结果表明，与cia模型组相比，经过200mg/kg的抗angptl4抗体治疗后，小鼠血清中炎症因子il-6的表达水平下降。
44.实施例3
45.本实施例进行micro-ct分析。
46.取实施例1造模7周后小鼠，对小鼠进行安乐死，解剖分离脚踝组织，取出胫骨前后肌肉，从胫骨中断截断，保留小鼠完整的足爪及踝关节，用10％福尔马林固定。采用micro-ct(skyscan 1176，bruker，belgium)扫描小鼠踝关节，对扫描数据重建后观察各组关节破损程度，结果如图5所示，con组关节表面光滑且完整；cia组骨表面粗糙且骨破坏现象严重，50mg/kg和200mg/kg抗angptl4抗体治疗后，指端关节骨破坏情况改善，表明抗angptl4抗体有抑制炎性骨破坏的治疗效果，且该治疗效果呈现剂量依赖性。
47.实施例4
48.本实施例进行关节局部的组织学染色分析。
49.将实施例3已完成ct扫描的骨组织依次进行脱钙、脱水及常规的石蜡包埋后，制作组织切片后进行he染色，结果如图6所示，con组动物踝关节软骨表面光滑，关节腔完整，关节间隙明显；cia造模组动物组踝关节处可见大量炎性细胞浸润，关节间隙变窄，软骨表面破坏，滑膜组织增生；而抗angptl4抗体治疗组，关节腔破坏程度和炎性细胞浸润程度缓解，骨破坏程度减轻。
50.综上所述，本发明通过构建胶原诱导性关节炎(cia)的小鼠动物模型，模拟ra的疾病状态，应用不同剂量的抗angptl4抗体对cia模型进行治疗干预，通过测量体重和足爪肿胀评价了抗angptl4抗体对关节肿胀的缓解作用以及该治疗剂量下的毒性作用，通过对动物模型的血清检测表明，抗angptl4抗体治疗可以明显降低细胞因子il-6的表达；micro-ct扫描数据以及组织学染色结果显示，抗angptl4抗体治疗可以有效改善ra的踝关节的骨破坏，并可以缓解关节局部的滑膜增生和炎症细胞的浸润，证明了抗angptl4抗体可应用于制备抗骨及关节炎症疾病治疗的药物。
51.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。