一种三联灭活疫苗与猪伪狂犬活疫苗形成的组合疫苗及其制备方法与流程

1.本发明属于组合疫苗制备技术领域，具体涉及一种三联灭活疫苗与猪伪狂犬活疫苗形成的组合疫苗及其制备方法。


背景技术：

2.pcv2是引起以断奶仔猪多系统衰竭综合征pmws的病原，即呼吸急促或困难、腹泻、贫血、明显的淋巴组织病变和进行性消瘦为主要特征的疾病。现已证实，pcv2主要侵害猪体的免疫系统，导致免疫抑制及机体抵抗力降低，干扰和破坏猪对其他疾病免疫抗体的产生和维持，从而继发其他疾病。因此，在养殖业中，不能孤立看待pcv2，因为它常与猪支原体肺炎、副猪嗜血杆菌病、猪伪狂犬病、猪链球菌、猪细小病毒病、多杀性巴氏杆菌病等一种或多种混合感染。cap蛋白是一种衣壳蛋白，表面有大量抗原表位，是pcv2主要的免疫保护性抗原，也是pcv2热门的疫苗候选之一。
3.猪支原体肺炎(mhp)，又称猪“喘气病”，系由猪肺炎支原体(mhyo)引起的一种顽固性、慢性呼吸系统疾病。猪支原体肺炎临床表现主要为咳嗽、气喘和呼吸困难，可导致猪群生长缓慢和饲料转化率下降。当猪肺炎支原体与其他呼吸道疾病混合感染时，会使病情加剧，甚至引起猪的死亡。
4.副猪嗜血杆菌病，是由副猪嗜血杆菌(hps)引起的多发性纤维素性浆膜炎和关节炎。临床上主要表现为发热、咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行、共济失调和被毛粗乱等。hps血清型众多，且不同菌株的交叉保护能力较弱，按琼扩分型方法至少可分15种血清型，目前我国主要流行的菌株为4型、5型和12型。随着规模化养殖的发展，高密度的饲养环境、免疫抑制和多重应激的因素导致了本病日趋流行，给养猪业带来了严重的经济损失。
5.伪狂犬病(pr)是由伪狂犬病毒引起的多种动物以发热、奇痒(猪例外)及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病。猪是本病的原发感染宿主，又是病毒的长期储存宿主和排毒者，受到的威胁最大。不同阶段猪发生pr后临床表现差异较大。prv感染后，能在发病耐过猪体内形成潜伏感染，潜伏带毒猪受到应激导致抵抗力下降后，体内病毒能重新活化，引起复发性感染，可以向外排毒或导致胎儿感染、发病死亡。这种“潜伏-激活”循环感染和传播机制导致了猪场一旦感染该病毒就很难根除。
6.目前市场上仅有猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体二联灭活疫苗、猪肺炎支原体灭活疫苗、副猪嗜血杆菌灭活疫苗、猪伪狂犬活疫苗，没有能同时预防4种疾病的四联疫苗。同时预防四种疾病需要分别接种上述疫苗，猪只在接种疫苗会产生多次应激，容易影响疫苗的接种效果。
7.因此研制一种能同时预防猪圆环病毒2型、猪支原体肺炎、副猪嗜血杆菌病与猪伪狂犬病的疫苗组合物，达到一针多防、免疫效果良好、减少免疫猪应激反应，具有重要的现实意义。


技术实现要素：

8.针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种三联灭活疫苗与猪伪狂犬活疫苗形成的组合疫苗及其制备方法，本发明旨在提供一种具有一针多防、降低猪应激反应、提升免疫效果的组合疫苗。
9.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
10.一种三联灭活疫苗与猪伪狂犬活疫苗形成的组合疫苗，该三联灭活疫苗包括猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌。
11.进一步地，猪圆环病毒2型cap蛋白的琼扩效价不低于1:32；猪肺炎支原体灭活前抗原含量不低于1～3
×
109ccu/ml，副猪嗜血杆菌4型、5型、12型浓缩后抗原含量不低于1～3
×
10
10
cfu/ml，猪伪狂活疫苗每头份病毒含量不低于1～5.0
×
10
4.5
tcid
50
。
12.进一步地，猪圆环病毒2型cap蛋白的琼扩效价不低于1:32；猪肺炎支原体灭活前抗原含量不低于109ccu/ml，副猪嗜血杆菌4型、5型、12型浓缩后抗原含量不低于1.8
×
10
10
cfu/ml，猪伪狂活疫苗每头份病毒含量不低于5.0
×
10
4.5
tcid
50
。
13.进一步地，组合疫苗中还包括在药学上疫苗可接受的佐剂。
14.一种制备上述组合疫苗的方法，使用一头份的三联灭活疫苗稀释一头份的猪伪狂犬活疫苗即可。
15.进一步地，三联灭活疫苗的制备方法如下：
16.将猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌4型、5型、12型抗原按体积比1:1:1混合后，加入5％的氢氧化铝胶，充分搅拌混匀后，即得猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗。
17.本发明的有益效果：
18.1、本发明通过先灭活后浓缩并多次洗滤重悬获得细菌抗原的方法，可有效的去除甲醛，以避免甲醛对猪伪狂犬活疫苗的影响。
19.2、本发明采用猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗与猪伪狂犬活疫苗，形成一种组合疫苗，且猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗和猪伪狂犬活疫苗具有协同免疫功能，可有效提升组合疫苗的免疫效果。
20.3、组合疫苗可简化接种程序，节省人力、物力，减少接种次数，可降低发生不良反应的几率，提升免疫效果。
附图说明
21.图1为不同组合疫苗免疫仔猪前后体温数据图；
22.图2为不同组合疫苗免疫仔猪前后圆环抗体结果图；
23.图3为不同保存期疫苗组合安全性检验体温数据图；
24.图4为不同保存期疫苗组合免疫仔猪前后圆环抗体结果图。
具体实施方式
25.下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，
只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
26.实施例1组合疫苗的制备
27.1、猪圆环病毒2型cap蛋白的制备
28.(1)制备一级生产种子：将含有圆环病毒cap蛋白表达质粒的冻干菌种bl21-cap株启封后，用lb液体培养基溶解后，划线接种含卡那霉素(50μg/ml)的lb固体培养基上，置37℃培养18～32小时，挑选符合要求的菌落，划线接种含卡那霉素(50μg/ml)的lb固体培养基，37℃培养18～32小时，作为一级生产种子。
29.(2)制备二级生产种子：用lb液体培养基洗下一级生产种子按3％接种含卡那霉素(50μg/ml)的lb液体培养基，置37℃振荡培养8～12小时，取样经纯粹检验合格后作为二级生产种子。
30.(3)工程菌培养：将发酵罐内已灭菌的改良lb液体培养基预热至37
±
0.5℃，按培养基总量的1～3％加入二级生产种子，37
±
0.5℃培养8～12小时。
31.(4)诱导表达：在od
600nm
达到25.0～28.0时，加入1.0
‰
～2.0
‰
的iptg进行诱导表达，同时，按9～10mol/l/小时的速度添加补料培养基，于15～20℃诱导培养12～16小时收获菌液，2～8℃保存备用。
32.(5)菌体裂解离心收集菌体，用pbs
7.2
重悬菌体，使用高压均质机800bar～1100bar均质破碎菌体2次。
33.(6)蛋白纯化压力破碎后12000rpm离心2min，离心后取上清经ni柱纯化后收获猪圆环病毒2型cap蛋白。
34.2、猪肺炎支原体抗原的制备
35.(1)制备一级生产种子：猪肺炎支原体hp-g株，冻干菌种启封后，按10％的接种量接种改良goodwin氏a26液体培养基，37～37.5℃振荡培养3～7日，待ph降至6.8时收获，经纯粹检验合格后，作为一级生产种子
36.(2)制备二级生产种子：取一级生产种子按10％接种量接种改良goodwin氏a26液体培养基，37～37.5℃振荡培养3～7日，待ph降至6.8时收获，经纯粹检验合格后，作为二级生产种子。
37.(3)制苗用菌液培养：按改良goodwin氏a26液体培养基总量的8～10％接种二级生产种子，37℃搅拌培养3～7日，待ph值降至6.8～7.0时收获菌液。
38.(4)灭活浓缩：将步骤(3)所得的菌液在37
±
0.2℃的条件下，在搅拌的同时，加入菌液总量0.3％的bea，灭活处理24小时，得灭活液。
39.3、副猪嗜血杆菌4型、5型、12型抗原的制备
40.(1)制备一级生产种子：将冻干的副猪嗜血杆菌4型ps株、5型pw株和12型pt株菌种分别用tsb液体培养基溶解后，划线接种含nad(16μg/ml)的tsa平皿，置37℃培养24～48小时，挑选大小均一的菌落，划线接种含nad(16μg/ml)的tsa斜面，37℃培养24～48小时，作为一级生产种子。
41.(2)制备二级生产种子：用tsb培养基洗下一级生产种子菌落，接种含nad(16μg/ml)的tsb液体培养基，置37℃振荡培养8～12小时，取样经纯粹检验合格后作为二级生产种子。
42.(3)制苗用菌液培养：将三种菌液分别分开进行培养，采用发酵罐分别培养副猪嗜血杆菌各菌株菌液。按发酵罐容积总量的70％加入tsb培养基，同时按培养基总量的0.01％～0.02％加入消泡剂。经蒸汽高压116℃灭菌20分钟后，待其温度降至37～38℃时，加入终浓度为10％的新生牛血清和16μg/ml的nad，按培养基总量2％～4％的比例加入二级生产种子，混匀，搅拌转速以100～150r/min，置37℃培养8～10小时。
43.(4)灭活浓缩：各菌株培养液根据活菌计数结果，分别进行浓缩至每种血清型菌液所含活菌数约1.8
×
10
10
cfu/ml，按菌液总量的0.3％加入甲醛溶液，当温度升高至37℃开始灭活计时，灭活24小时得灭活液。
44.(5)浓缩去甲醛：将步骤(4)所得的灭活液分别离心，用pbs多次洗滤后浓缩重悬。得副猪嗜血杆菌4型、5型、12型抗原。
45.4、猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗的制备
46.将猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体抗原、副猪嗜血杆菌4型、5型、12型抗原按体积比1:1:1混合后，加入5％的氢氧化铝胶，充分搅拌混匀后，即得猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗。
47.5、组合疫苗的制备
48.用一头份的猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗稀释一头份的猪伪狂活疫苗(bartha-k61株)(华派生物工程集团有限公司生产，批号2021008，每头份病毒含量为10
5.7
tcid
50
)；其中，猪圆环病毒2型cap蛋白琼扩效价不低于1:32，猪肺炎支原体灭活前抗原含量不低于109ccu/ml，副猪嗜血杆菌4型、5型、12型浓缩后抗原含量不低于1.8
×
10
10
cfu/ml，猪伪狂活疫苗每头份病毒含量不低于5.0
×
10
4.5
tcid
50
。
49.实施例2组合疫苗
50.1、制备组合疫苗
51.按照表1所示的比例配制成组合疫苗，分别测定猪伪狂犬病毒的病毒含量，进行安全性检验和有效性检验。
52.表1组合疫苗
[0053][0054]
2、猪伪狂犬病毒含量测定
[0055]
取1头份表1中的不同组合疫苗分别用mem维持液作10倍系列稀释，取稀释度10-3
、10-4
、10-5
、10-6
样品，由最高稀释度开始，分别各接种96孔板鸡胚成纤维细胞4孔，0.1ml/孔。置37℃、5％ co2培养箱培养1～5日，观察并记录cpe，按reed-muench法计算tcid
50
，试验结果统计见表2。结果表明，1头份不同配制比例的组合疫苗中，猪伪狂犬病毒含量均高于5
×
10
4.5
tcid
50
，说明该操作方法不影响猪伪狂犬活疫苗的效力。
[0056]
表2不同组合疫苗中猪伪狂犬病毒含量
[0057][0058]
3、安全性检验
[0059]
用14～21日龄健康易感猪25头，随机分为5组，分别颈部肌肉注射疫苗4头份，分别在接种前2天、接种前1天、接种日当天测3天基础体温，接种后再连续3天测温。标记接种部位，观察接种部位是否红肿、触摸接种部位是否有硬结等局部反应。观察接种猪并记录体温、精神、食欲等，试验结果统计见表3，体温数据统计见图1。
[0060]
试验结果表明：疫苗接种后在注射部位有无硬结、是否肿胀，体温升高不超过1.5℃的比例、食欲减退的比例方面无差异，在和精神沉郁的比例上，3号试验组，即猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗与猪伪狂活疫苗组合比例为2:1时有1头仔猪出现精神沉郁现象，也仅为一过性表现，说明将2种疫苗进行组合后用于仔猪免疫安全性良好。
[0061]
表3不同组合疫苗安全性试验结果
[0062][0063]
4、有效性检验
[0064]
将150头14～21日龄健康易感猪，分为6组，每组25头，5组试验组分别颈部肌肉注射疫苗1头份，接种后14日按相同途径和剂量加强接种1次，相同数量的对照组不接种，相同条件下隔离饲养。
[0065]
(1)猪圆环病毒2型抗体水平测定：二免后21日，每组选取5头试验猪收集血清，收集血清，用间接elisa方法检测pvc2抗体水平(见图2)。试验结果表明：不同组合疫苗免疫仔猪均可获得较好的血清抗体。更具体的，疫苗组合3和组合1的pcv2抗体结果均优于疫苗组合5，即猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，说明疫苗组合具有协同免疫功能。
[0066]
(2)猪肺炎支原体攻毒保护试验：二免疫后21天，连同对照组5头，各气管注射100mid的检验用猪肺炎支原体组织毒(cvcc354株，中国兽医药品监察所)，攻毒后28天后，对试验猪进行剖杀，取出肺脏，采用goodwin氏55分法记分法进行肺部病变评分，试验结果统计见表4。
[0067]
试验数据说明，猪肺炎支原体组织毒cvcc354株攻击后，疫苗组合1、2、3的免疫猪能均达到5/5支原体肺炎减少率不低于60％，疫苗组合5有4/5免疫猪支原体肺炎减少率不
低于60％。说明猪肺炎支原体部分，疫苗组合1、2、3有很好的免疫保护效果，且效果均优于疫苗组合5，即猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗，说明疫苗组合具有协同免疫功能。
[0068]
表4不同组合疫苗对猪肺炎支原体的攻毒保护结果
[0069][0070][0071]
(3)副猪嗜血杆菌攻毒保护试验
[0072]
二免后21天，连同对照组15头，分别腹腔内注射1个最小发病量的副猪嗜血杆菌4型、5型、12型强毒菌液2ml。攻毒后观察试验猪，每日记录其发病或死亡情况，其中死亡猪解剖并记录其脏器病变情况。第14天，对存活的试验猪进行剖检，剖检观察记录各脏器病理变化情况，对各试验猪发病情况进行分析结果见表5。
[0073]
应对副猪嗜血杆菌4型、5型和12型的攻击，疫苗组合1和疫苗组合3均可为试验猪
提供5/5保护，疫苗组合2对副猪嗜血杆菌4型的攻击可提供5/5保护、对5型和12型可提供4/5保护。疫苗组合5，即猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗组对副猪嗜血杆菌4型和12型的攻击可提供5/5保护、对5型的攻击可提供4/5保护。说明疫苗组合1和疫苗组合3效力保护结果更优秀，猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗与猪伪狂犬活疫苗疫苗组合能够提升副猪嗜血杆菌的免疫保护效果。
[0074]
表5不同组合疫苗对副猪嗜血杆菌的攻毒保护结果
[0075][0076][0077]
(4)猪伪狂病毒攻毒保护试验：二免疫后21天，连同对照组5头，各滴鼻接种猪伪狂犬病毒经典强毒(sc株)，观察14日，记录各试验动物发病情况，试验结果统计见表6。
[0078]
对照组及疫苗组合5(猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗)仔猪均5/5发病，而疫苗组合1和疫苗组合2能给免疫猪提高5/5保护，疫苗组合3免疫效果稍弱，可保护4/5免疫仔猪免受强毒攻击。
[0079]
表6不同组合疫苗对猪伪狂犬病毒的攻毒保护结果
[0080][0081]
综合以上各检验结果，疫苗组合1，即猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗与猪伪狂犬病毒活疫苗按照1:1比例配制后免疫仔猪，可以同时为仔猪提供应对圆环病毒2型、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌4型、5型、12型以及猪伪狂犬病毒
4类、6种病原攻击的免疫保护，且免疫保护效果均大于或等于单类疫苗对照，说明该组合疫苗也具有协同免疫功能。
[0082]
实施例3组合疫苗保存期试验
[0083]
由于在规模化养殖场疫苗使用过程中，需要免疫的动物数量多，组合疫苗配制后不能立即免疫仔猪，故需要探究疫苗组合配制完成后的最佳使用时间范围。按照实施例1中的方法配制组合疫苗，用一头份的猪圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗稀释一头份的猪伪狂活疫苗，评价在室温保存0h、2h、4h、8h后，组合疫苗中猪伪狂犬病毒含量，以及不同保存期对组合疫苗的安全性和效力的影响。
[0084]
1.猪伪狂犬病毒含量测定
[0085]
取组合疫苗分别在室温保存0h、2h、4h、8h后，各取1头份用mem维持液作10倍系列稀释，取稀释度10-3
、10-4
、10-5
、10-6
样品，由最高稀释度开始，分别各接种96孔板鸡胚成纤维细胞4孔，0.1ml/孔。置37℃、5％co2培养箱培养1～5日，观察并记录cpe，按reed-muench法计算tcid
50
，试验结果统计见表7。结果表明：组合疫苗在室温下，随着保存时间延长，病毒含量基本不变，在4小时以内，每头份组合疫苗中猪伪狂犬病毒含量均高于5
×
10
4.5
tcid
50
，疫苗的效力可以得到保障。即使到了8小时，每头份组合疫苗中猪伪狂犬病毒含量也有10
4.8
/tcid
50
，仍然高于兽药典规定的10
3.0
/tcid
50
。
[0086]
表7不同保存时间下疫苗组合中猪伪狂犬病毒含量
[0087][0088]
2.安全性检验
[0089]
用14～21日龄健康易感猪20头，随机分为4组，分别颈部肌肉注射疫苗4头份，分别在接种前2天、接种前1天、接种日当天测3天基础体温，接种后再连续3天测温。标记接种部位，观察接种部位是否红肿、触摸接种部位是否有硬结等局部反应。观察接种猪并记录体温、精神、食欲等，试验结果统计见表8，体温数据统计见图3。试验结果表明：在室温保存8小时以内，疫苗接种后在注射部位5/5无硬结、无肿胀，5/5体温升高不超过1.5℃的比例、0/5食欲减退，说明组合疫苗在室温保存8小时以内安全性良好。
[0090]
表8疫苗组合保存期安全性试验结果
[0091][0092]
3.有效性检验
[0093]
将125头14～21日龄健康易感猪，分为5组，每组25头，其中一组作为不接种对照组。试验组分别颈部肌肉注射疫苗1头份，接种后14日按相同途径和剂量加强接种1次，相同条件下隔离饲养。
[0094]
(1)猪圆环病毒2型抗体水平测定：二免后21日，每组选取5头试验猪收集血清，用间接elisa方法检测pvc2抗体水平(图4)。
[0095]
试验结果表明：组合疫苗配制完成后，在室温保存8小时以内，对免疫猪血清中猪圆环病毒2型抗体水平没有影响，不同保存期抗体结果没有显著性差异，不接种对照组抗体结果成立。
[0096]
(2)猪肺炎支原体攻毒保护试验：二免疫后21天，连同对照组5头，各气管注射100mid的检验用猪肺炎支原体组织毒(cvcc354株，中国兽医药品监察所)，攻毒后28天，对试验猪进行剖杀，取出肺脏，采用goodwin氏55分法记分法进行肺部病变评分，试验结果统计见表9。
[0097]
试验数据说明，猪肺炎支原体组织毒cvcc354株攻击后，组合疫苗配制完成后，在室温保存4小时以内，免疫猪能均达到5/5支原体肺炎减少率不低于60％，保存8小时后，免疫猪3/5支原体肺炎减少率不低于60％，对照猪肺部病变评分5/5不低于10分，对照成立。说明组合疫苗在室温保存4小时以内对猪肺炎支原体效力保护水平无影响。
[0098]
表9不同保存期疫苗组合对猪肺炎支原体的攻毒保护结果
[0099][0100]
(3)副猪嗜血杆菌攻毒保护试验：二免后21天，连同对照组15头，分别腹腔内注射1
个最小发病量的副猪嗜血杆菌4型、5型、12型强毒菌液2ml。攻毒后观察试验猪，每日记录其发病或死亡情况，其中死亡猪解剖记录其脏器病变情况。第14天，对存活的试验猪进行剖检，观察记录各脏器病理变化情况，对各试验猪发病情况进行分析结果见表10。
[0101]
应对副猪嗜血杆菌4型、5型和12型的攻击，组合疫苗配制完成后，在室温保存4小时以内，可为试验猪提供5/5保护。在室温保存8小时后，应对副猪嗜血杆菌5型攻击，可为试验猪提供4/5保护，应对副猪嗜血杆菌4型和12型的攻击，可为试验猪提供5/5保护。对照组试验猪均发病，且有不同程度的死亡，对照成立。
[0102]
表10不同保存期疫苗组合对副猪嗜血杆菌的攻毒保护结果
[0103][0104]
(4)猪伪狂病毒攻毒保护试验：二免疫后21天，连同对照组5头，各滴鼻接种猪伪狂犬病毒经典强毒(sc株)，观察14日，记录各试验动物发病情况，试验结果统计见表9。
[0105]
对照组仔猪均5/5发病，而组合疫苗配制完成后，在室温保存2小时以内，可为试验猪提供5/5保护。保存4小时，疫苗组合可为试验猪提供4/5保护。而随着保存时间延长，组合疫苗对试验猪的保护能力逐渐降低，到保存8小时后，仅有2/5保护。说明组合疫苗在室温保存4小时内使用效果最佳。
[0106]
表9不同保存期疫苗组合对猪伪狂犬病毒的攻毒保护结果
[0107][0108][0109]
综合不同保存期猪伪狂犬病毒含量、安全检验和各病原对应的效力检验结果，猪
圆环病毒2型cap蛋白、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗与猪伪狂犬病毒活疫苗按照1:1比例配制后在室温保存4小时以内免疫仔猪，其安全性和效力保护水平均不受影响。