一种包含螺旋藻的复合物及其制备方法和应用

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种包含螺旋藻的复合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.活性因子，例如营养素、益生菌或药物，指能对生命现象具有影响的物质。以多酚为例，多酚类化合物及其代谢物已被证明通过刺激有益菌群的生长和抑制病原菌的增殖来影响肠道健康。虽然多酚类化合物具有促进健康的特性，但在被摄入经胃酸消化后易于酸解，也极易被胃肠道的大量ros氧化失效，使其生物利用度大打折扣。尤其是分子量高、结构复杂的酚类化合物难以被下消化道吸收，于是如何提高此类化合物的生物利用率就成了一个亟待解决的问题。
3.目前已提出了以下三类“包埋”策略以实现活性因子的肠靶向递送：(1)基于胃酸、十二指肠液、结肠液的ph差异构建ph响应型载体，但因载体对ph响应需要过程，因此易出现释放滞后现象；(2)通过载体与肠道中的电解质或黏液成分形成离子键、氢键等非共价键实现肠靶向递送，但易受到温度、ph、外力影响导致稳定性不佳；(3)将含巯基的递送体系与肠黏液中黏蛋白的巯基形成共价的二硫键实现肠靶向递送，但口腔、胃部同样含有黏膜层，递送体系与口腔、胃的黏附依旧不可避免，从而减少活性因子的最终作用浓度。现有载体大都只考虑将活性因子递送至肠道中，而由于肠道大量的ros，释放后多酚的活性及作用效果并不理想。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对胃酸和胃肠道中大量的ros，构建一种生物质基多酚肠靶向递送体系，保护活性因子，例如营养素、益生菌或药物，免受胃酸以及胃肠道中ros的影响。
5.基于上述目的，本技术通过提供一种包含螺旋藻的复合物及其制备方法和应用来解决该领域中的这种需要。
6.一方面，本发明涉及一种包含螺旋藻的复合物，其包含螺旋藻和活性因子；以质量比计，所述螺旋藻和活性因子的配比为1:0.5-5；所述活性因子为营养素、益生菌或药物中的一种。
7.进一步地，本发明提供的复合物中，所述螺旋藻具备以下结构：表面分布14～16nm的孔隙，螺旋结构的外径宽为3～5μm。
8.进一步地，本发明提供的复合物中，所述活性因子为营养素，所述营养素为多酚，所述多酚选自槲皮素、白藜芦醇、槲皮素、花色苷中的一种。
9.进一步地，本发明提供的复合物中，所述多酚为槲皮素，所述槲皮素的浓度为50μg ml-1
，所述螺旋藻对槲皮素的载药量为14.5～37.0％，包封率为41.0％～87.0％。
10.进一步地，本发明提供的复合物中，所述活性因子为药物，所述药物为在肠道发挥药效的药物。
znso4·
7h2o、0.30g na2mo4·
2h2o、0.08g cuso4·
5h2o、0.05g ca(no3)2·
6h2o)用蒸馏水溶解后定容至1l。然后将培养基分装至250ml的锥形瓶中，高压灭菌后进行接种螺旋藻，接种后的螺旋藻置于恒温培养箱中进行培养，培养条件为25℃、8000lux。本实施例使用的螺旋藻为上海光语生物科技有限公司提供的钝顶螺旋藻(s.platensis)。
31.螺旋藻@槲皮素的制备在室温进行。将培养好的螺旋藻清洗三次后离心除去培养基，将获得的2g螺旋藻泥，重新分散至100ml去离子水中，取1ml、1000mg l-1
槲皮素的乙醇溶液与螺旋藻溶液混合均匀，缓慢搅拌12h。结束后低速离心后冷冻干燥获得螺旋藻@槲皮素。采用红外光谱仪记录4000～400cm-1
范围内螺旋藻、槲皮素和螺旋藻@槲皮素的红外光谱。
32.由图1(a)可知，螺旋藻的主要成分是叶绿素，其结构中羧酸羰基的特征振动峰出现在图1(a)的1725-1700cm-1
，其中的-c＝n-和-c＝c-的伸缩振动出现在1690-1620cm-1
处。
33.图1(b)为槲皮素的红外曲线，由图1(b)可知苯环-c-h伸缩振动为3085cm-1
，3303cm-1
为槲皮素酚羟基的特征振动峰，1671cm-1
为α,β-不饱和脂肪酮的酮糖基的特征振动峰，1550cm-1
为苯环-c＝c-双键伸缩振动峰。
34.由图1(c)可知，以上特征信号在图1(c)曲线中均有出现，说明螺旋藻@槲皮素成功制备。
35.采用动态光散射激光粒度zeta电位仪测定螺旋藻@槲皮素的zeta电位。如图2所示，可以发现螺旋藻的zeta电位为-26.82mv，槲皮素的zeta电位为0.1mv。螺旋藻在装载槲皮素后zeta电位的绝对值略有减小，表明螺旋藻@槲皮素成功制备。
36.实施例2
37.本实施例提供了螺旋藻对槲皮素载药量和包封率的测定。
38.首先测定374nm处槲皮素标准溶液的吸光度，将吸光度和标准溶液浓度线性拟合后得到如下的标准曲线：
39.c(mg ml-1
)＝(a-0.0283)/0.065(r2＝0.9991)
40.其中a为标准溶液在374nm处的吸光度，c为槲皮素标准溶液的浓度。
41.据此，根据如下公式计算螺旋藻@槲皮素中槲皮素的载药量和包封率：
42.载药量(％)＝(所负载的槲皮素的质量/螺旋藻@槲皮素的质量)
×
100％
43.包封率(％)＝(所负载的槲皮素的质量/初始加入槲皮素总质量)
×
100％
44.当槲皮素的初始浓度为50μg ml-1
时，实施例1制备的螺旋藻@槲皮素载药量和包封率分别为37.0％和74.0％。
45.实施例3
46.本实施例提供了螺旋藻@槲皮素的微观形貌观察。
47.取500μg微藻分散于50ml水中，取一滴藻液放置于载玻片上盖上盖玻片，置于光学显微镜下观察微藻的形貌(目镜
×
10，物镜
×
40)。另外，采用扫描电子显微镜观察螺旋藻、螺旋藻@槲皮素的微观形貌。
48.如图3所示，在显微镜下，螺旋藻呈外径为3～5μm的螺旋状结构，经光学显微镜观察，螺旋藻表面分布有14～16nm的微孔。由图4(a)可知，当槲皮素负载进内腔后，螺旋藻的螺旋状结构依旧保持且相互缠绕。由图4(b)可知，由于槲皮素是晶体，在光学显微镜下呈针状结构，具有一定的硬度和刚性，所制得的螺旋藻@槲皮素也从螺旋藻的缠绕结构转变为排列规整的板状结构。
49.实施例4
50.本实施例提供了螺旋藻@槲皮素的ph稳定性和温度稳定性试验。
51.(1)ph稳定性试验
52.取50μl、1mg ml-1
槲皮素加入5mlph 1、3、5、7的pbs中。取2mg螺旋藻@槲皮素加入5mlph 1、3、5、7的pbs缓冲液中。定期取上清液用乙醇萃取其中的槲皮素并测定含量，记录样品的在374nm处吸光度变化。
53.由图5(a)和图5(b)可知，槲皮素在4种ph环境下的吸光度在6h内吸光度值整体呈现下降的趋势，说明槲皮素在所测ph条件下都有不同程度的降解，在ph 7的pbs中最为稳定，在ph 1的溶液中槲皮素降解最为严重。这可能是由于槲皮素分子中含有许多个酚羟基，不同ph会对其分子结构产生影响。当ph值过小时，槲皮素分子会以佯盐的形式存在，当ph值过大时槲皮素分子会以烷氧盐的形式存在；而当ph接近中性的时候槲皮素分子会以中性分子的形式存在，因此槲皮素在在接近中性的溶液中可以相对稳定的存在。
54.对于螺旋藻@槲皮素而言，由于微藻的壁对包载其中的槲皮素有保护作用，可确保槲皮素不被不同的ph环境降解。但因微藻的壁有孔隙，随着时间的延长还是会有极少量的槲皮素从螺旋藻中溶出，溶出后的槲皮素会在不同ph条件下以不同的形式存在。总体来讲，螺旋藻对改善槲皮素在不同ph环境下的稳定性有很好的效果。
55.(2)温度稳定性试验
56.将4ml、10mg l-1
槲皮素的乙醇溶液置于37℃、60℃的水浴中避光孵育，取2mg螺旋藻@槲皮素(约含有槲皮素740μg)加入5ml水中于37℃、60℃的水浴池中避光放置，定期取上清液用乙醇萃取其中的槲皮素并测定含量，记录样品的在374nm处吸光度变化。
57.由图6(a)可知，8h内槲皮素和螺旋藻@槲皮素的吸光度值变化均不显著，说明在人体正常体温下，两者的稳定性差异不大。由图6(b)可见，60℃时槲皮素的吸光度下降明显，而螺旋藻@槲皮素在8h内槲皮素的吸光度值从0.08增加至0.15，与槲皮素相比，递送体系在高温下对槲皮素具有保护作用，可以有效地保护槲皮素免遭高温降解。上述结果表明，螺旋藻@槲皮素体系在37、60度均有较好的稳定性，尤其对于改善槲皮素的ph、温度稳定性有着显著效果。
58.实施例5
59.本实施例提供了螺旋藻@槲皮素递送体系的释放试验。
60.首先配制ph 2.2、7.4的缓冲溶液，然后将5mg螺旋藻@槲皮素置于10ml模拟胃液中2h后离心，取上清液200μl用乙醇稀释至2ml后测定其在374nm处的吸光度值。然后将样品转移至模拟肠液中进行释放的研究，总释放时长为10h。定期取上清液用乙醇稀释后测定吸光度值同时加入等量的相对应的pbs缓冲液，代入槲皮素的标准曲线中计算药物的释放量。
61.由图7可知，经过胃中胃蛋白酶的初步消化，螺旋藻@槲皮素在胃部2h的释放量仅为8.8％，槲皮素释放量为2.1％；当进入肠道后，肠道中的胰蛋白酶、胰糜蛋白酶和氨基肽酶、二肽酶等充分消化螺旋藻@槲皮素，导致其中的槲皮素充分暴露至肠道中，总释放量高达80.4％。槲皮素由于没有螺旋藻的保护且不具有靶向性，最终累计释放量仅为35％。上述结果说明所构建的螺旋藻@槲皮素可实现槲皮素的耐胃酸、肠靶向释放。本领域内技术人员易于知晓，营养素、益生菌或药物同属于活性因子，同样可以实现类似螺旋藻@槲皮素的耐胃酸、肠靶向释放。
62.实施例6
63.本实施例提供了螺旋藻@槲皮素的抗氧化活性测定试验。
64.将槲皮素、螺旋藻、螺旋藻@槲皮素均经过模拟胃液37℃处理2h。随后用1m naoh调节模拟胃液的ph值约为7.0，再加入等量胰蛋白酶37℃孵育4h。结束后将所有样品冷冻干燥，得到粉末状样品用于
·
dpph、
·o2-、
·
abts自由基清除实验，样品浓度为2mg
·
ml-1
。
65.螺旋藻中由于含有抗氧化多糖和多酚，因此对dpph
·
、
·o2-、
·
abts的清除率分别为9.22％
±
0.46％、22.18％
±
0.74％、89.10％
±
0.01％。
66.如图8所示，以未经过模拟胃液处理的抗坏血酸(vc)为阳性对照，槲皮素对上述三种自由基清除率依次是33.81％
±
0.71％、3.00％
±
0.16％、91.01％
±
0.097％；当螺旋藻包埋槲皮素后，基于螺旋藻和槲皮素的协同抗氧化作用，同样浓度的螺旋藻@槲皮素对于单一成分的自由基清除效果有极大提升，对
·
dpph、
·o2-、
·
abts三种自由基的清除效果较槲皮素或螺旋藻均有大幅提升，清除率分别高达56.79％
±
0.94％、42.82％
±
0.15％和95.45％
±
0.21％。
67.综上所述，本发明所述螺旋藻@槲皮素不仅在结直肠炎的治疗领域有着巨大的应用价值，更对晚期糖基化终末产物具有抑制作用，即本发明提供的螺旋藻@槲皮素能够作为一种治疗阿尔兹海默症的药物。
68.如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。