一种用于长节段骨缺损的骨修复支架及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及骨修复技术领域，特别是涉及一种用于长节段骨缺损的骨修复支架及其制备方法和应用。


背景技术：

2.长节段骨缺损是骨科的疑难杂症，常用的治疗方法包括骨移植术，骨移植术包括自体骨移植，比如常用的取髂骨、腓骨进行植骨治疗。由于自体骨有限，并且长节段骨缺损骨需求量大，自体骨移植需要多次手术，会增加病人手术痛苦；因此，急需一种可以替代自体骨用于临床需求的长节段骨缺损修复的替代品。
3.然而，长节段骨缺损对于骨修复材料要求高，既需要有足够的力学强度进行支撑，还需要有良好生物相容性和成骨性能，采用现有方法制得的骨修复材料成份结构单一，很难实现难以满足需求；所以，急需一种可以用于临床需求的长节段骨修复支架，代替自体骨，进行长节段骨缺损修复。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的一个或者多个技术问题，本发明提供了一种用于长节段骨缺损的骨修复支架及其制备方法和应用，该制备方法工艺简单，制得的骨修复支架同时具备优异的力学性能、生物相容性和骨修复能力，可以根据实际骨缺损的情况进行个性化定制，满足不同需求，解决了现阶段临床长节段骨缺损修复采用自体骨需要进行多次移植的难题，可以作为自体骨替代品，用于临床长节段骨缺损的修复。
5.本发明在第一方面提供了一种用于长节段骨缺损的骨修复支架，所述骨修复支架包括支架主体、填充在所述支架主体内部的支架主体填充物和贴合所述支架主体表面的骨诱导再生膜；所述支架主体为三维网状框架结构；所述骨诱导再生膜包括疏松层和致密层；所述疏松层贴合在所述支架主体表面；
6.所述支架主体由生物可降解纤维和聚乳酸的混合物成型得到；所述支架填充物包含双相磷酸钙多孔骨粉和生物胶粘剂；所述生物胶黏剂包含生物活性材料和溶剂。
7.优选地，所述三维网状框架结构包括外部框架和连接在所述外部框架内部的网状结构；所述网状结构由多根所述支撑柱连接形成；所述支撑柱沿所述支架主体的长度方向设置；所述支撑柱的直径为1～3mm，相邻两根所述支撑柱的间隔为2～5mm。
8.优选地，所述支架主体上设置有螺孔，所述支架主体的抗压强度为80～100mpa。
9.优选地，所述致密层由矿化胶原骨粉和胶原溶液按用量比为(5～8)g:100ml制得；所述致密层的厚度为0.5～1.5mm。
10.优选地，所述疏松层由矿化胶原骨粉和所述胶原溶液按用量比为(10～20)g:100ml制得；所述疏松层的厚度为0.2～1mm。
11.优选地，所述骨修复支架还包括骨钉；所述骨钉与所述螺孔连接，用于固定所述支架主体。
12.本发明在第二方面提供了一种第一方面所述的骨修复支架的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
13.s1.以生物可降解纤维和聚乳酸的混合物为原料进行3d打印，得到支架主体；
14.s2.将双相磷酸钙多孔骨粉和生物胶粘剂混合，得到支架填充物；所述生物胶粘剂包含生物活性材料和溶剂；
15.s3.将矿化胶原骨粉和胶原溶液的混合物进行冻干成型、交联、冷冻干燥、辊压，得到致密层；
16.s4.将矿化胶原骨粉和胶原溶液的混合物涂刷在所述致密层表面，经冷冻干燥，形成疏松层，得到骨诱导再生膜。
17.优选地，在步骤s4后，还包括以生物可降解纤维和聚乳酸的混合物为原料通过热熔模压或注塑成型制备骨钉的步骤。
18.优选地，在所述生物可降解纤维和聚乳酸的混合物中，所述生物可降解纤维占3～10wt％；优选的是，所述聚乳酸的分子量为10～20万，所述生物可降解纤维为聚乙醇酸纤维。
19.优选地，在步骤s1中，所述3d打印的温度为200～240℃，打印速度为0.1～0.2mm/min。
20.优选地，在步骤s2中，所述双相磷酸钙多孔骨粉和所述生物胶粘剂的质量比为(20～50):100；所述生物活性材料和所述溶剂的用量比为(5～8)g:100ml；优选的是，所述生物活性材料为医用胶原、壳聚糖、透明质酸中的至少一种，所述溶剂为自体血液，生理盐水、注射用水中的一种。
21.优选地，所述生物胶粘剂还包含生长因子和/或抗生素；优选的是，所述生长因子为浓缩生长因子、骨形态发生蛋白、转化生长因子-β中的一种；所述抗生素为万古霉素、庆大霉素、妥布霉素中的一种；更优选的是，所述生长因子占所述生物胶粘剂总质量的0.01～5％；所述抗生素占所述生物胶粘剂总质量的0.01～5％。
22.优选地，所述胶原溶液由胶原和纯化水按用量比为(3～5)g:100ml混合得到。
23.优选地，在步骤s3中，所述交联为采用质量分数为0.01％的戊二醛的乙醇溶液浸泡24～28h。
24.本发明在第三方面提供了一种第一方面所述的骨修复支架在长节段骨缺损修复领域的应用。
25.本发明与现有技术相比至少具有如下有益效果：
26.(1)本发明的骨修复支架中支架主体由生物可降解纤维和聚乳酸的混合物成型得到，为可降解材料；支架主体为三维网状框架结构，支撑柱可以提高支架主体的力学性能，三维网状框架结构中填充的支架主体填充物，具有优异的生物相容性和成骨能力；此外，支架主体的三维网状结构还有具有一定塑型性，确保新的组织能沿着支架主体长度方向生长。
27.(2)本发明骨修复支架中的骨诱导再生膜包括致密层和疏松层，疏松层具有自身骨成分相似，与支架表面贴合，可以诱导新骨生成；致密层表面致密光滑，能够很好地利用膜的物理屏障功能将病损区与外界环境隔离，避免感染，使待修复组织的再生功能得到最大程度的发挥。
28.(3)本发明的骨修复支架同时具备优异的力学性能、生物相容性和骨修复能力，可以根据实际骨缺损的情况进行个性化定制，满足不同需求，解决了现阶段临床长节段骨缺损修复采用自体骨需要进行多次移植的难题，可以作为自体骨替代品，用于临床长节段骨缺损的修复。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1是本发明提供的一种用于长节段骨缺损的骨修复支架的结构示意图；
31.图2是本发明提供的一种用于长节段骨缺损的骨修复支架的中骨诱导再生膜的结构示意图；
32.图3是本发明提供的骨修复支架采用嵌入式植入骨缺损部位的结构示意图；
33.图4是本发明提供的骨修复支架采用外套式植入骨缺损部位的结构示意图；
34.图5是进行动物实验(植入实施例1提供的骨修复支架用于兔桡骨缺损的修复)12周后肝脏病理图；
35.图6是进行动物实验(植入实施例1提供的骨修复支架用于兔桡骨缺损的修复)12周后肾脏病理图；
36.图7是进行动物实验(植入实施例1提供的骨修复支架用于兔桡骨缺损的修复)12周后肺部病理图；
37.图8是进行动物实验(植入实施例1提供的骨修复支架用于兔桡骨缺损的修复)12周后脾脏病理图；
38.图9是进行动物实验(植入实施例2提供的骨修复支架用于兔桡骨缺损的修复)24周后的x光片；
39.图10是进行动物实验(植入对比例12提供的骨修复支架用于兔桡骨缺损的修复)24周后的x光片；
40.图中：1-支架主体；11-支撑柱；2-支架填充物；3-骨诱导再生膜；31-疏松层；32-致密层；4-骨钉。
具体实施方式
41.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
42.如图1-4，本发明在第一方面提供了一种用于长节段骨缺损的骨修复支架，所述骨修复支架包括支架主体、填充在所述支架主体内部的支架主体填充物和贴合所述支架主体表面的骨诱导再生膜；所述支架主体为三维网状框架结构；所述骨诱导再生膜包括疏松层和致密层；所述疏松层贴合在所述支架主体表面；
43.所述支架主体由生物可降解纤维和聚乳酸的混合物成型得到；所述支架填充物包含双相磷酸钙多孔骨粉和生物胶粘剂；所述生物胶黏剂包含生物活性材料和溶剂。
44.本发明的骨修复支架中支架主体由生物可降解纤维和聚乳酸的混合物成型得到，为可降解材料；支架主体为三维网状框架结构，支撑柱可以提高支架主体的力学性能，三维网状结构可以使材料在横向和纵向都保持良好的力学性能，三维网状框架结构中填充的支架主体填充物(双相磷酸钙多孔骨粉和生物胶粘剂混合而成)，具有优异的生物相容性和成骨能力；此外，支架主体的三维网状结构还有具有一定塑型性，确保新的组织能沿着支架主体的长度方向生长，可以避免修复后的损伤部位与自身骨发生偏移。
45.本发明的骨修复支架的骨诱导再生膜包括致密层和疏松层，疏松层具有自身骨成分相似，与支架表面贴合，可以诱导新骨生成；致密层表面致密光滑，能够很好地利用膜的物理屏障功能将病损区与外界环境隔离，避免感染，使待修复组织的再生功能得到最大程度的发挥。
46.本发明的骨修复支架同时具备优异的力学性能、生物相容性和骨修复能力，可以根据实际骨缺损的情况进行个性化定制，满足不同需求，解决了现阶段临床长节段骨缺损修复采用自体骨需要进行多次移植的难题，可以作为自体骨替代品，用于临床长节段骨缺损的修复。
47.根据一些优选的实施方式，所述三维网状框架结构包括外部框架和连接在所述外部框架内部的网状结构；所述网状结构由多根所述支撑柱连接形成；所述支撑柱沿所述支架主体的长度方向设置；所述支撑柱的直径为1～3mm(例如，可以为1mm、1.2mm、1.4mm、1.6mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm或3mm)，相邻两根所述支撑柱的间隔为2～5mm(例如，可以为2mm、2.2mm、2.4mm、2.6mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.4mm、3.6mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.4mm、4.6mm、4.8mm或5mm)。
48.本发明支撑柱的直径和间隔控制在上述范围，既可保证支架主体的抗压强度，又可以给新组织的生长提供足够的空间；若直径太大，间隔太小，那么支架主体中的间隙小，无法为新组织的生长提供足够的空间；且支架主体的降解速度慢，不能与新组织细胞的生长相匹配，不利于骨缺损的修复；若直径太小，间隔太大，支架主体的抗压强度低，无法满足较长节段的骨缺损的修复；可以根据实际情况在上述范围内进行设计和选择，如有的缺损比较小，支撑柱的直径及间隔则不能太大，如果缺损本身尺寸比较大，如成年男子的腿部，就可以选择大一点支撑柱的直径及间隔。
49.根据一些优选的实施方式，所述支架主体上设置有螺孔，所述支架主体的抗压强度为80～100mpa；本发明在支架主体上设置有螺孔用于与骨钉连接，起到固定支架主体的作用；支架主体的强度为80～100mpa(例如，可以为80mpa、82mpa、84mpa、86mpa、88mpa、90mpa、92mpa、94mpa、96mpa、98mpa或100mpa)，可满足长节段骨缺损修复的需求。
50.本发明在一些具体的实施例中，所述支架主体的两端均设置有螺孔，所述螺孔沿所述支架主体中心线对称设置。
51.根据一些优选的实施方式，所述致密层由矿化胶原骨粉和胶原溶液按用量比为(5～8)g:100ml(例如，可以为5g:100ml、6g:100ml、7g:100ml或8g:100ml)制得；所述致密层的厚度为0.5～1.5mm(例如，可以为0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm或1.5mm)。
52.根据一些优选的实施方式，所述疏松层由矿化胶原骨粉和所述胶原溶液按用量比为(10～20)g:100ml例如，可以为10g:100ml、11g:100ml、12g:100ml、13g:100ml、14g:100ml、15g:100ml、16g:100ml、17g:100ml、18g:100ml、19g:100ml或20g:100ml)制得；所述疏松层的厚度为0.2～1mm(例如，可以为0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm或1mm)。
53.本发明致密层和疏松层中矿化胶原骨粉和胶原溶液的用量比控制在上述范围，可得到与自体骨成分相近的疏松层和表面光滑致密的致密层，可以确保骨诱导再生膜既具有优异的诱导成骨能力，又能保证骨缺损部分新组织生长之前，能够更好地与外界环境隔离，避免感染，以使待修复组织的再生功能得到最大程度的发挥。致密层的厚度控制在上述范围，可以确保与外界环境具有更好的隔离效果；疏松层的厚度控制在上述范围，可以确保具有优异的诱导成骨能力。
54.根据一些优选的实施方式，所述骨修复支架还包括骨钉；所述骨钉与所述螺孔连接，用于固定所述支架主体；本发明骨钉用于固定支架，能够有效防止支架出现滑移，解决骨缺损修复支架在植入骨缺损断端表面后容易出现滑移的问题。
55.本发明在第二方面提供了一种第一方面所述的骨修复支架的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
56.s1.以生物可降解纤维和聚乳酸的混合物为原料进行3d打印，得到支架主体；
57.s2.将双相磷酸钙多孔骨粉和生物胶粘剂混合，得到支架填充物；所述生物胶粘剂包含生物活性材料和溶剂；
58.s3.将矿化胶原骨粉和胶原溶液的混合物进行冻干成型、交联、冷冻干燥、辊压，得到致密层；
59.s4.将矿化胶原骨粉和胶原溶液的混合物涂刷在所述致密层表面，经冷冻干燥，形成疏松层，得到骨诱导再生膜。
60.需要说明的是，本发明采用的双相磷酸钙多孔骨粉参照中国专利cn108553691a的制备方法制备得到；具体为：双相磷酸钙多孔骨粉的制备组分包含第一钙盐、聚乙烯醇和pmma微球，质量比为(0.1～0.5):3:2，所述第一钙盐由羟基磷灰石和β-磷酸钙按照5:1～1:3的质量比组成，制备方法包括：(a)配制浓度为0.2～0.5g/ml的聚乙烯醇溶液；(b)配制双相磷酸盐悬浊液；将羟基磷灰石和β-磷酸钙加入到pbs溶液中，形成悬浊液；(c)将所述聚乙烯醇溶液加到所述双相磷酸盐悬浊液中，搅拌0.5～1小时后，再加入pmma微球，搅拌0.5～1小时后，得到烧结基液；(d)将所述烧结基液置于烧结设备中进行烧结，得到烧结材料；所述烧结包括如下阶段：第一阶段：升温速率为5～10℃/min，目标温度为400～800℃，恒温时间为300～350min；第二阶段：升温速率为5～10℃/min，目标温度为1000～1200℃，恒温时间为180～200min；第三阶段：将烧结设备停止加热，自然冷却至室温；(e)将所述烧结材料粉碎；(f)筛分，得到颗粒粒径为1-2mm颗粒即可。
61.需要说明的是，本发明采用的矿化胶原骨粉参照中国专利cn108421088a的制备方法制备得到；具体为：s1、将胶原溶于醋酸中配制成胶原的酸溶液，其中胶原浓度为1mg/ml；s2、持续搅拌步骤s1所得溶液，缓慢滴加含钙离子的溶液，钙离子的加入量为每克胶原对应加入钙离子0.05mol；s3、持续搅拌s2所得溶液，缓慢滴加含磷酸根离子的溶液，磷酸根离子的加入量与s2中钙离子加入量的摩尔比为ca/p＝1.65～1.82；s4、持续搅拌s3所得溶液，缓
慢滴加naoh溶液至混合体系ph＝6～8，当ph＝5～6时，混合体系开始出现沉淀，当ph＝7时，混合体系出现白色悬浊液；s5、将步骤1.4所得混合体系静置24～48小时，分离出沉淀并洗去杂质离子，随后进行冷冻干燥，研磨后获得矿化胶原骨粉。
62.本发明对支架主体的尺寸不做具体限制，可根据实际骨缺损情况设计和选择打印参数，得到不同尺寸的支架主体，可实现个性化定制，满足不同需求。
63.本发明首先采用生物可降解纤维和聚乳酸的混合物通过3d打印支架主体，然后将双相磷酸钙多孔骨粉和生物胶粘剂混合，并填充入支架主体内部，再以矿化胶原骨粉和胶原溶液为原料制备得到具有致密层和疏松层的骨诱导再生膜，将骨诱导再生膜疏松层一面贴合在支架主体表面得到可用于长节段骨缺损的骨修复支架。
64.本发明骨修复支架的制备方法工艺简单，制得的骨修复支架同时具备优异的力学性能、生物相容性和骨修复能力，可以根据实际骨缺损的情况进行个性化定制，满足不同需求，解决了现阶段临床长节段骨缺损修复采用自体骨需要进行多次移植的难题，可以作为自体骨替代品，用于临床长节段骨缺损的修复。
65.本发明制得的骨修复支架中支架主体为采用生物可降解纤维和聚乳酸的混合物通过3d打印得到，为可降解材料；在支架主体内部填充的双相磷酸钙多孔骨粉和生物胶粘剂混合物，具有优异的生物相容性和成骨能力。
66.在一些具体的实施方式中，所述骨修复支架的制备方法包括：s1.以生物可降解纤维和聚乳酸的混合物为原料(生物可降解纤维占3～10wt％)，在打印的温度为200～240℃，打印速度为0.1～0.2mm/min条件下，通过3d打印熔融沉降技术得到支架主体；s2.双相磷酸钙多孔骨粉和生物胶粘剂按质量比为(20～50):100混合，得到支架填充物；s3.将所述矿化胶原骨粉和所述胶原溶液按用量比(5～8)g:100ml混合，并于100～150r/min转速下，搅拌4～6h，并冻干成型，然后用交联剂浸泡交联24～28h，再用纯化水冲洗24～48h后冷冻干燥，最后置于辊压机上辊压，得到所述致密层；所述交联剂为质量分数为0.01％的戊二醛的乙醇溶液；所述辊压的压力为10～15mpa，辊压的速度为5～10mm/min；s4.将矿化胶原骨粉和胶原溶液按用量比(10～20)g:100ml混合，并于100～150r/min转速下，搅拌4～6h，然后涂刷在致密层表面，经冷冻干燥，形成疏松层，得到骨诱导再生膜。
67.本发明在一些具体的实施例中，冷冻干燥和冻干成型包括预冻阶段、第一阶段、第二阶段，各个阶段的工艺条件如下：
68.预冻阶段：于-20℃，恒温120～160min，然后于-10℃，恒温240～280min(抽真空，掺气100
±
10pa)，
69.第一阶段(保持0℃)：于0℃，恒温时间为480～500min(抽真空，掺气100
±
10pa)；
70.第二阶段(升华)：首先，于10℃，恒温时间为120～150min；然后，于20℃，恒温时间为120～150min；最后，于30℃，恒温时间为120～150min。
71.本发明在制备致密层的过程中，在冻干成型后，采用质量分数为0.01％的戊二醛的乙醇溶液浸泡进行交联可以使分子之间形成更稳定的三维网状结构，可以提高致密层的强度等性能；采用纯化水冲洗以除去残留的戊二醛的乙醇溶液；将辊压的压力和速度控制在上述范围，可以确保致密层表面光滑、致密，更好地将病损区与外界环境隔离，避免感染，使特定组织的再生功能得到最大程度的发挥，同时也能进一步提升致密层的力学性能；如无辊压的步骤，得到致密层的致密度不够，不能有效将病损区与外界环境隔离。
72.根据一些优选的实施方式，在步骤s4后，还包括以生物可降解纤维和聚乳酸的混合物为原料通过热熔模压或注塑成型制备骨钉的步骤。
73.需要说明的是，本发明支架主体和骨钉均采用生物可降解纤维和聚乳酸的混合物为原料制得，为可降解材料。
74.根据一些优选的实施方式，在所述生物可降解纤维和聚乳酸的混合物中，所述生物可降解纤维占3～10wt％(例如，可以为3wt％、3.5wt％、4wt％、4.5wt％、5wt％、5.5wt％、6wt％、6.5wt％、7wt％、7.5wt％、8wt％、8.5wt％、9wt％、9.5wt％或10wt％)；优选的是，所述聚乳酸的分子量为10～20万(例如，可以为10万、11万、12万、13万、14万、15万、16万、17万、18万、19万或20万)，所述生物可降解纤维为聚乙醇酸纤维。
75.本发明支架主体由生物可降解纤维和聚乳酸的混合物通过3d打印得到，为可降解材料；发明人发现，当生物可降解纤维的质量占比在上述范围时，可以确保支架主体的抗压强度为80～100mpa，可用于长节段骨缺损的修复；生物可降解纤维含量太少无法满足用于长节段骨缺损修复所需要的抗压强度。
76.根据一些优选的实施方式，在步骤s1中，所述3d打印的温度为200～240℃(例如，可以为200℃、205℃、210℃、215℃、220℃、225℃、230℃、235℃或240℃)，打印速度为0.1～0.2mm/min(例如，可以为0.1mm/min、0.12mm/min、0.14mm/min、0.16mm/min、0.18mm/min或0.2mm/min)。
77.本发明3d打印的温度控制在上述范围可以确保生物可降解纤维和聚乳酸的混合物在3d打印过程中的流动性，便于打印；温度太低，生物可降解纤维和聚乳酸的混合物流动性差，易出现结块现象；本发明将3d打印的温度和打印速度控制在上述范围，以便得到性能均一稳定的支架主体。
78.根据一些优选的实施方式，在步骤s2中，所述双相磷酸钙多孔骨粉和所述生物胶粘剂的质量比为(20～50):100(例如，可以为20:100、25:100、30:100、35:100、40:100、45:100或50:100)；本发明双相磷酸钙多孔骨粉和生物胶粘剂控制在上述范围，可以保证混合后的支架填充物为面团状(膏状)，充分填充至支架主体的内部，确保在骨修复的过程中，支架填充物的降解速度能更好地与新组织的生长速度相匹配；若双相磷酸钙多孔骨粉含量太高，造成与生物胶粘剂混合不充分，填充物发干发散，填充效果差，填充物降解速度太慢，无法与新组织的生长速度相匹配，不利于骨修复；若双相磷酸钙多孔骨粉含量太低，造成与生物胶粘剂混合后不成团，容易溢出，填充效果差，且填充物降解速度太快，新组织来不及生长，也不利于骨修复。
79.根据一些优选的实施方式，所述生物活性材料和所述溶剂的用量比为(5～8)g:100ml(例如，可以为5g:100ml、6g:100ml、7g:100ml或8g:100ml)；优选的是，所述生物活性材料为医用胶原、壳聚糖、透明质酸中的至少一种，所述溶剂为自体血液，生理盐水、注射用水中的一种；本发明活性材料和溶剂的用量控制在上述范围，可保证活性材料分散均匀，混合物流动性好，可塑性好，便于和双相磷酸钙多孔骨粉混合后填充在主体支架网状结构的网孔中。
80.根据一些优选的实施方式，所述生物胶粘剂还包含生长因子和/或抗生素；优选的是，所述生长因子为浓缩生长因子、骨形态发生蛋白、转化生长因子-β中的一种；所述抗生素为万古霉素、庆大霉素、妥布霉素中的一种；更优选的是，所述生长因子占所述生物胶粘
剂总质量的0.01～5％例如，可以为0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％)；所述抗生素占所述生物胶粘剂总质量的0.01～5％例如，可以为0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％)。
81.本发明生物胶粘剂还可以包含生长因子和/或抗生素；根据骨缺损的具体情况进行选择；当骨缺损患者本身成骨能力比较差，可以根据实际情况加入生长因子促进新组织的生成；当患者存在骨肿瘤或炎症的情况，可以根据实际情况加入适量的抗生素，以避免发生感染，阻碍骨修复过程；当患者既存在本身成骨能力差又存在骨肿瘤或炎症，则可根据实际情况同时适量的加入生长因子和抗生素。
82.根据一些优选的实施方式，在步骤s3中，所述交联为采用质量分数为0.01％的戊二醛的乙醇溶液浸泡24～28h(例如，可以为24h、25h、26h、27h、或28h)。
83.根据一些优选的实施方式，所述胶原溶液由胶原和纯化水按用量比为(3～5)g:100ml(例如，可以为3g:100ml、3.5g:100ml、4g:100ml、4.5g:100ml或5g:100ml)混合得到；本发明胶原为i型胶原，其与骨组织中的胶原成分近似，与骨组织具有更好的生物相容性。
84.在一些具体的实施例中，胶原溶液的制备方法为：按i型胶原与纯化水的用量比为3-5g:100ml，将胶原溶于纯化水中，并在通冷却水的条件下(保证温度低于50℃)，于150～200r/min转速下，搅拌24～36h，得胶原溶液。
85.本发明在第三方面提供了第一方面所述的骨修复支架在长节段骨缺损修复领域的应用。
86.本发明骨修复支架应用于长节段骨修复时，当支架植入骨缺损部位后，通过骨钉与设置在支架主体上的螺孔将支架固定，再用骨诱导再生膜将骨缺损部位包住，使骨诱导再生膜贴合在支架表面，骨诱导再生膜的长度要比骨缺损两个断端的距离大5～10mm，以确保骨诱导再生膜更够更好的包裹待修复部位，使待修复部位与外界环境隔离，避免感染，使待修复组织的再生功能得到最大程度的发挥。
87.本发明支架植入骨缺损部位时可采用嵌入式(如图3)和外套式(如图4)；当采用嵌入式时，将支架插入骨缺损位置的两个断端的髓腔内即可；当采用外套入式时，支架的两端需留有深度为5～10mm孔，孔的大小根据实际缺损部分的尺寸情况进行设置和选择，可满足将自体骨恰好嵌入其中即可。
88.为了更加清楚地说明本发明的技术方案及优点，下面结合实施例对本发明作进一步说明。
89.需要说明的是，本发明中的材料和试剂均可以是在市面上直接购买得到或自行合成得到，对具体型号不做限制。
90.本发明实施例和对比例制得的骨修复支架的性能测试方法参照如下方法：
91.抗压强度测试：参考标准为gb23101.1-20084.4中规定的方法进行测量使用圆柱形样品(实施例和对比例制备得到的骨修复支架)轴向加载，样品的高度h和直径应符合尺寸比1.5≤h/d≤2.0，将样品(实施例和对比例制备得到的骨修复支架)置入材料力学试验机中进行压缩试验，压缩速率为0.5mm/min，通过测量应力开始下降瞬间记录的加载力的平均值计算。
92.细胞毒性测试：将实施例和对比例的骨修复支架进行辐照灭菌，以含有10％小牛血清的细胞培养基为浸提介质，按照0.2g/ml的比例浸提实施例和对比例骨修复支架，细胞
计数后接种于96孔培养板，置co2培养箱37℃培养24h后，弃去培养液；空白对照组中加入新鲜细胞培养液，实验组中分别加入实施例和对比例的骨修复支架的浸提液，置于co2培养箱中继续培养24h，用显微镜观察细胞形态，每孔加入20μl质量浓度为5g/l的mtt溶液，继续培养4h后弃去孔内液体，加入200μldmso，在酶标仪570nm和650nm波长下测定吸光度，计算相对增值率，相对增值率＝(实验组吸光度均值/空白对照组吸光度均值)
×
100％。需要说明的是，相对增值率的级别参考标准见下表，级别越低，生物毒性越小。
[0093][0094]
骨修复愈合的半定量分析评分标准参见下表；
[0095]
分值骨修复情况描述0未见骨修复1《10％的缺损部分形成骨组织或类骨组织210％～25％的缺损部分形成骨组织或类骨组织325％～50％的缺损部分形成骨组织或类骨组织450％～75％的缺损部分形成骨组织或类骨组织5》75％的缺损部分形成骨组织或类骨组织
[0096]
实施例1：
[0097]
s1.采用聚乙醇酸纤维和聚乳酸的混合物(聚乙醇酸纤维占6％)进行3d打印(打印温度为220℃，打印速度为0.15mm/min)得到支架主体；支架主体上设置有螺孔；支架主体为内部设置有多根支撑柱(直径为2mm；相邻支撑柱的间隔为4mm)的三维网状框架结构；
[0098]
s2.将质量比为40:100的双相磷酸钙多孔骨粉和生物胶粘剂混合均匀，并填充入支架主体的内部；生物胶粘剂包含用量比为6g:100ml的生物活性材料(医用胶原)和溶剂(自体血液)；
[0099]
s3.将矿化胶原骨粉加入胶原溶液中(矿化胶原骨粉和胶原溶液的用量比为7g:100ml)，在转速为120r/min条件下，搅拌6h，混合均匀后，经冻干成型、采用质量分数为0.01％的戊二醛的乙醇溶液浸泡交联28h、用纯化水冲洗36h除去残留交联剂、冷冻干燥、辊压(辊压的压力为12mpa，辊压的速度为8mm/min)，得到致密层；
[0100]
s4.将矿化胶原骨粉加入胶原溶液中(矿化胶原骨粉和胶原溶液的用量比为15g:100ml)，在转速为150r/min条件下，搅拌5h，混合均匀后，涂刷在致密层的表面，经冷冻干燥，在致密层的表面形成疏松层，得到骨诱导再生膜；
[0101]
s5.采用生物可降解纤维和聚乳酸的混合物(聚乙醇酸纤维占3％)通过于220℃热
熔模压得到骨钉，并与支架主体上的螺孔连接。
[0102]
s6.将骨诱导再生膜的疏松层贴合在支架主体表面，得到骨修复支架。
[0103]
实施例2：
[0104]
s1.采用聚乙醇酸纤维和聚乳酸的混合物(聚乙醇酸纤维占3％)进行3d打印(打印温度为200℃，打印速度为0.1mm/min)得到支架主体；支架主体上设置有螺孔；支架主体为内部设置有多根支撑柱(直径为1mm；相邻支撑柱的间隔为2mm)的三维网状框架结构；
[0105]
s2.将质量比为20:100的双相磷酸钙多孔骨粉和生物胶粘剂混合均匀，并填充入支架主体的内部；生物胶粘剂包含用量比为5g:100ml的生物活性材料(壳聚糖)和溶剂(生理盐水)；
[0106]
s3.将矿化胶原骨粉加入胶原溶液中(矿化胶原骨粉和胶原溶液的用量比为5g:100ml)，在转速为150r/min条件下，搅拌4h，混合均匀后，经冻干成型、采用质量分数为0.01％的戊二醛的乙醇溶液浸泡交联28h、用纯化水冲洗24h除去残留交联剂、冷冻干燥、辊压(辊压的压力为10mpa，辊压的速度为5mm/min)，得到致密层；
[0107]
s4.将矿化胶原骨粉加入胶原溶液中(矿化胶原骨粉和胶原溶液的用量比为10g:100ml)，在转速为100r/min条件下，搅拌6h，混合均匀后，涂刷在致密层的表面，经冷冻干燥，在致密层的表面形成疏松层，得到骨诱导再生膜；
[0108]
s5.采用生物可降解纤维和聚乳酸的混合物(聚乙醇酸纤维占3％)通过于200℃热熔模压型制备骨钉，并与支架主体上的螺孔连接。
[0109]
s6.将骨诱导再生膜的疏松层贴合在支架主体表面，得到骨修复支架。
[0110]
实施例3：
[0111]
s1.采用聚乙醇酸纤维和聚乳酸的混合物(聚乙醇酸纤维占10％)进行3d打印(打印温度为240℃，打印速度为0.2mm/min)得到支架主体；支架主体上设置有螺孔；支架主体为内部设置有多根支撑柱(直径为3mm；相邻支撑柱的间隔为5mm)的三维网状框架结构；
[0112]
s2.将质量比为50:100的双相磷酸钙多孔骨粉和生物胶粘剂混合均匀，并填充入支架主体的内部；生物胶粘剂包含用量比为8g:100ml的生物活性材料(透明质酸)和溶剂(注射用水)；
[0113]
s3.将矿化胶原骨粉加入胶原溶液中(矿化胶原骨粉和胶原溶液的用量比为8g:100ml)，在转速为100r/min条件下，搅拌6h，混合均匀后，经冻干成型、采用质量分数为0.01％的戊二醛的乙醇溶液浸泡交联28h、用纯化水冲洗48h除去残留交联剂、冷冻干燥、辊压(辊压的压力为15mpa，辊压的速度为10mm/min)，得到致密层；
[0114]
s4.将矿化胶原骨粉加入胶原溶液中(矿化胶原骨粉和胶原溶液的用量比为20g:100ml)，在转速为150r/min条件下，搅拌6h，混合均匀后，涂刷在致密层的表面，经冷冻干燥，在致密层的表面形成疏松层，得到骨诱导再生膜；
[0115]
s5.采用生物可降解纤维和聚乳酸的混合物(聚乙醇酸纤维占3％)通过于240℃注塑成型制备骨钉，并与支架主体上的螺孔连接。
[0116]
s6.将骨诱导再生膜的疏松层贴合在支架主体表面，得到骨修复支架。
[0117]
实施例4：
[0118]
实施例4与实施例1基本相同，区别在于：生物胶粘剂还包含生长因子(骨形态发生蛋白)，生长因子的用量为生物胶粘剂总量的1％。
[0119]
实施例5：
[0120]
实施例5与实施例1基本相同，区别在于：生物胶粘剂还包含抗生素，抗生素的用量为生物胶粘剂总量的0.01％。
[0121]
实施例6：
[0122]
实施例6与实施例1基本相同，区别在于：生物胶粘剂还包含生长因子和抗生素，生长因子的用量为生物胶粘剂总量的1％，抗生素的用量为生物胶粘剂总量的0.01％。
[0123]
对比例1：
[0124]
对比例1与实施例1基本相同，区别在于：在步骤s1中，支架主体未设置支撑柱。
[0125]
对比例2：
[0126]
对比例2与实施例1基本相同，区别在于：在步骤s2中，双相磷酸钙多孔骨粉和生物胶粘剂的质量比为5:100。
[0127]
对比例3：
[0128]
对比例3与实施例1基本相同，区别在于：在步骤s2中，双相磷酸钙多孔骨粉和生物胶粘剂的质量比为70:100。
[0129]
对比例4：
[0130]
对比例4与实施例1基本相同，区别在于：生物胶粘剂包含用量比为2g:100ml的生物活性材料(医用胶原)和溶剂(自体血液)。
[0131]
对比例5：
[0132]
对比例5与实施例1基本相同，区别在于：生物胶粘剂包含用量比为10g:100ml的生物活性材料(医用胶原)和溶剂(自体血液)。
[0133]
对比例6：
[0134]
对比例6与实施例1基本相同，区别在于：在步骤s3中，矿化胶原骨粉和胶原溶液的用量比为2g:100ml。
[0135]
对比例7：
[0136]
对比例7与实施例1基本相同，区别在于：在步骤s3中，矿化胶原骨粉和胶原溶液的用量比为15g:100ml。
[0137]
对比例8：
[0138]
对比例8与实施例1基本相同，区别在于：在步骤s3中，不包括采用质量分数为0.01％的戊二醛的乙醇溶液浸泡交联28h的步骤。
[0139]
对比例9：
[0140]
对比例9与实施例1基本相同，区别在于：在步骤s4中，矿化胶原骨粉和胶原溶液的用量比为2g:100ml。
[0141]
对比例10：
[0142]
对比例10与实施例1基本相同，区别在于：在步骤s4中，矿化胶原骨粉和胶原溶液的用量比为30g:100ml。
[0143]
对比例11：
[0144]
对比例11与实施例1基本相同，区别在于：无步骤s3和s4。
[0145]
对比例12：
[0146]
对比例12与实施例2基本相同，区别在于：无步骤s2。
[0147]
对比例13：
[0148]
对比例13与实施例1基本相同，区别在于：无步骤s4，步骤s5中直接将致密层贴合在支架主体表面。
[0149]
对比例14：
[0150]
对比例14与实施例1基本相同，区别在于：无步骤s3，步骤s5中直接将疏松层贴合在支架主体表面。
[0151]
对比例15：
[0152]
对比例15与实施例1基本相同，区别在于：在步骤s3中，不包括辊压的步骤。
[0153]
本发明实施例和对比例提供的骨修复支架的性能数据见表1。
[0154]
表1
[0155]
[0156][0157]
由表1可知，对比例1支架主体为未设置支架主体的网状框架结构，骨修复支架的抗压强度明显降低，不能满足长节段骨缺损适应症所需的力学支撑；对比例2因双相磷酸钙多孔骨粉含量太低，生物胶粘剂含量太高，造成混合后不成团，容易流动，有溢出风险，填充效果差，且填充物降解快，与成骨速率不匹配；对比例3由于双相磷酸钙多孔骨粉含量太高，生物胶粘剂含量太低，出现双相磷酸钙多孔骨粉浸润不充分，混合不均匀，发干发散，不能形成面团状形态，造成填充时容易散落的情况，填充效果差，且填充物降解速率降低，与成骨速率不匹配；对比例4生物活性材料含量太低，溶剂含量太高，生物胶粘剂粘性不够，与双相磷酸钙多孔骨粉混合后材料发散，不便于填充，填充效果差，导致骨诱导性能差，成骨能力下降；对比例5生物活性材料(医用胶原)含量太高，溶剂含量太低，造成生物活性材料(医用胶原)不能充分地分散，出现结块或者絮状物现象，分散不均匀，填充效果差，骨诱导性能差，成骨能力下降；对比例6致密层中胶原含量太高，降解速率快，成骨性能稍微下降，且易出现溶解性吸收和早期膜裂缝等问题，影响骨愈合情况；对比例7致密层中胶原含量太低，韧性不够，容易出现裂缝，造成支架主体填充物外溢，使得骨诱导性能和成骨能力下降，不利于骨修复；对比例8未进行交联处理，致密层强度低，在包裹过程中易出现断裂，且降解速率快，与成骨速率不匹配，不利于骨修复；对比例9疏松层中矿化胶原骨粉含量太低，成骨性能降低，降解速率变快，与成骨速率不匹配，膜出现早期降解，不利于骨愈合；对比例10疏松层中矿化胶原骨粉含量太高，与胶原溶液混合时不能完全浸润，无法顺利完成涂刷形成疏松层；对比例11不包括骨诱导再生膜，成骨性能下降，同时不能充分起到物理屏障的作用，后期容易造成感染，影响骨愈合；对比例12缺少具有骨诱导性能的支架主体填充物，造成内部空洞，骨组织不能很好的长入到内部，成骨能力下降；对比例13骨修复支架不含疏松层，诱导性能有所下降；对比例14骨修复支架不含致密层，再生诱导膜的强度不够，容易早期断裂，不能充分起到物理屏障的作用，后期容易造成感染，影响骨愈合；对比例15制备致密层过程中不进行辊压处理，再生诱导膜的强度降低，容易断裂，致密层的孔隙率大，不能起到物理屏障作用，后期容易造成感染，影响骨愈合。
[0158]
植入实施例1的骨修复支架用于兔桡骨缺损的修复12周后，对实验兔肝脏、肾脏、肺、脾脏组织病理分析；由图5肝组织切片显示，肝细胞和肝斑块正常，排列整齐，中央静脉无异常；未发现因炎症反应引起的肝组织出现囊肿、纤维化、肝细胞丢失、坏死或淋巴细胞聚集等病理变化，在形态学上无明显差异；由图6肾脏组织切片显示，组织学分析显示肾组
织无集合管细胞丢失、肾小球丢失、囊肿、纤维化、坏死或淋巴细胞聚集和结节等病理变化。此外，肾小球没有炎症细胞浸润、炎症或水肿；由图7肺部组织切片显示，植入材料均无诱发肺部炎症，未导致肺泡结构破坏，无纤维组织增生和形成小脓肿等现象；由图8脾脏组织切片显示，组织学分析显示脾组织无脾组织形态改变、淋巴细胞丢失、囊肿、纤维化、上皮细胞和放射状细胞丢失、坏死或大淋巴细胞聚集等病理变化，无炎症变化。综上，肾、肝、肺和脾脏在第12周用h&e染色，未发现器官损伤、结构畸形或坏死；此外，在任何器官中均未观察到异常炎症细胞浸润和巨噬细胞异常增加。
[0159]
由图9-10植入骨修复支架24周后x光片可以看出，植入本发明实施例2的骨修复支架后骨愈合情况明显好于对比例12，本发明的骨修复支架具有优异的骨修复性能。
[0160]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。