一种具有改善睡眠作用的组合物的制作方法

1.本发明具体涉及一种具有改善睡眠作用的组合物。


背景技术：

2.睡眠是生存的基本要素，睡眠不足可导致各种功能障碍。据世界卫生组织统计，全世界有27％的人正遭受失眠的困扰，且这一数值正在不断攀升。目前，睡眠问题已成为医学界普遍关心的问题之一。尽管治疗失眠的化学药物在过去的几年里迅速发展，但由于其毒副作用和可能产生的依赖作用，使得其治疗效果不佳，比如褪黑素，长期服用不仅会导致治疗失眠效果变差，反而会导致睡眠节律紊乱加重，长此以往可导致神经衰弱。因此，开发一种纯天然、无毒副作用的具有改善睡眠质量的药物显得尤为重要。
3.植物精油是以芳香植物的花、根、茎、叶、枝、干、皮、果实或分泌物为原料，经过蒸馏、干馏、萃取、压榨、吸附或吸收等工艺提取的具有香气和(或)香味的挥发性油状液体物质的总称。天然植物精油共有696种，如薄荷精油、山苍子精油、薰衣草精油、广藿香精油等。植物精油分子量较小，具有一定生物活性，在缓解睡眠障碍方面，芳香植物精油也可谓是有所贡献。研究证实，薰衣草精油、柠檬精油、茉莉花精油、牡丹籽油和元宝枫油等都具有很好的镇静效果，对神经系统具有一定的调节能力，可以缓解身体的紧张和不安症状，使机体保持松弛状态，改善睡眠，但效果都差强人意。
4.目前，还没有将牡丹籽油、元宝枫油和维生素组合用于改善睡眠质量的报道。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，本发明提供了一种具有改善睡眠作用的组合物，它是含有如下重量配比的原料制备而成：
6.牡丹籽油1～5份、元宝枫油1～5份、维生素e 0.5～2.5份。
7.进一步地，它是含有如下重量配比的原料制备而成：
8.牡丹籽油1份、元宝枫油1份、维生素e 0.5份。
9.进一步地，所述牡丹籽油中亚油酸相对含量大于17％，α-亚麻酸相对含量大于58％。
10.进一步地，所述元宝枫油中亚油酸相对含量大于30％，花生四烯酸相对含量大于12％，神经酸相对含量大于4％。
11.进一步地，它是以牡丹籽油、元宝枫油和维生素e为活性成分，加上药品上可接受的辅料制备而成的制剂。
12.进一步地，所述制剂为外用制剂。
13.进一步地，所述外用制剂为溶液剂、乳剂、凝胶剂、气雾剂、涂膜剂、贴膏剂。
14.本发明还提供了一种前述的组合物的制备方法，它包括如下步骤：
15.1)按配比称取原料；
16.2)原料混匀，加入药品上可接受的辅料，即得。
17.本发明最后提供了一种前述的组合物在制备改善睡眠的药物中的用途。
18.本发明改善睡眠的组合物，将含高纯度α-亚麻酸和亚油酸的牡丹籽油、高纯度的花生四烯酸和神经酸的元宝枫油，与维生素e以特定的比例混合，经动物试验证明具有显著的改善睡眠功效，具体表现为觉醒活动量和觉醒总时间均减少，上调mtnr1aa和gabra1基因相对表达量。本发明组合物在改善睡眠方面，相较单独的牡丹籽油、元宝枫油和ve具有更佳的功效，具备实际推广应用价值。
19.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
20.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
21.图1样品处理后斑马鱼运动轨迹典型图
22.图2样品处理后斑马鱼觉醒活动量
23.图3样品处理后斑马鱼觉醒总时间
24.图4mtnr1aa基因相对表达量
25.图5gabra1基因相对表达量
具体实施方式
26.本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得，其中牡丹籽油和元宝枫油是由牡丹籽和元宝枫种仁经物理压榨或超临界流体萃取法或亚临界流体萃取法获得牡丹籽油和元宝枫油粗品，然后经过柱层析、低温结晶、分子蒸馏等一种或多种组合提纯分离方法分别获得高纯度的α-亚麻酸和亚油酸的牡丹籽油、高含量的花生四烯酸和神经酸的元宝枫油。具体的制备方法如下：
27.牡丹籽油的制备：
28.(1)将新鲜、洁净、无霉变、无虫害的牡丹籽50-60℃烘干、粉碎、过筛(40-100目筛)、碾压(20-40min)、再烘干(50-60℃)4-5h，得到的牡丹籽粉与萃取剂正丁烷按1：5的料溶质量体积比(g/ml)进行亚临界流体萃取，得到牡丹籽皮萃取物；
29.(2)利用减压升温方法(分离压力0.5-1.5mpa、分离温度60-70℃)对萃取物进行分离，得到油状萃取液，将其室温静置50-60min后即得牡丹籽油；
30.(3)牡丹籽油经皂化反应后进行初步纯化，得到皂化反应物(其中皂化反应温度35-55℃、时间45-120min)；
31.(4)皂化反应物中的乙醇经减压蒸馏而被除去，随即将去醇后的皂化反应物按体积比1：2～5加入硫酸水溶液(4％-8％的质量百分比浓度)进行混合搅拌、分离油相，水洗至中性，用无水硫酸钠干燥后得到混合脂肪酸；
32.(5)将上述混合脂肪酸溶液进行熔融结晶获取高纯度的α-亚麻酸，其中需控制带双层夹套的熔融层结晶器中的内外层温度、降温时间和维持时间、便于熔融层结晶：控制外层夹套的温度在100-150min内降至-10～-35℃，内层夹套的温度在100-150min内降至-12
℃～-35℃，并维持3-6h；收集熔融层结晶的母液，即得到含高纯度α-亚麻酸和亚油酸的牡丹籽油。
33.元宝枫油的制备：
34.(1)将新鲜、洁净、无霉变、无虫害的元宝枫种仁50-60℃烘干、粉碎、过筛(40-100目筛)、碾压(30-40min)、再烘干(55-60℃)3-4h，得到的元宝枫种仁粉与萃取剂正丁烷按1：6的料溶质量体积比(g/ml)进行亚临界流体萃取，得到元宝枫种仁萃取物；
35.(2)利用减压升温方法(分离压力0.5-1.5mpa、分离温度60-75℃)对萃取物进行分离，得到油状萃取液，将其室温静置55-60min后即得元宝枫油；
36.(3)将元宝枫油按照1：2(g/ml)比例加入2m氢氧化钾乙醇溶液，混合均匀后，在80℃下水浴反应90min，随后向产物中依次加入1倍产物体积的纯水和1倍产物体积的正己烷，轻轻摇晃后静置分层，去除上层有机相，分离得到下层；下层溶液加入3m盐酸溶液调节ph至1-2，加入2倍下层溶液体积的正己烷萃取2次。合并有机相并用少量纯水洗涤至中性，无水硫酸钠干燥过滤后，45℃旋转蒸发除去正己烷得到混合脂肪酸；
37.(4)上述混合脂肪酸溶液与乙醇按质量体积比1：3(g/ml)混合后在-40℃条件下低温结晶4-5h，经抽滤后得到结晶，再与经旋转蒸发除去乙醇溶剂的滤液混合，即得高含量的花生四烯酸和神经酸的元宝枫油。
38.上述工艺制备得到的牡丹籽油和元宝枫油的脂肪酸gc-ms分析结果如下：
[0039][0040]
注：脂肪酸相对含量是gc-ms图谱中脂肪酸的峰面积与全部成分峰面积和的比值。
[0041]
实施例1本发明组合物
[0042]
取牡丹籽油1份、元宝枫油1份、维生素e 0.5份，混匀，即得。
[0043]
实施例2本发明组合物
[0044]
取牡丹籽油2份、元宝枫油2份、维生素e 2份，混匀，即得。
[0045]
实施例3本发明组合物
[0046]
取牡丹籽油5份、元宝枫油5份、维生素e1.5份，混匀，即得。
[0047]
以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果
[0048]
试验例1改善睡眠功效评价
[0049]
(一)本发明改善睡眠功效评价
[0050]
前期的动物预试验发现，体积比2：2：1的牡丹籽油、元宝枫油和维生素e组成的复方在觉醒活动量和觉醒总时间减少程度方面均显著高于其他用量配比的复方(p《0.05)，故现用牡丹籽油1份、元宝枫油1份、维生素e0.5份的组合物进行改善睡眠功效评价。
[0051]
1、检测材料
[0052]
1.1.样品配制信息
[0053]
peony oil(按实施例1制备)加热后用10％dmso配制成100μl/ml母液，现配现用。
[0054]
阳性对照：褪黑素，白色粉末，批号f1804064，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，阴凉避光储存。用dmso配制成12.5mg/ml母液，-20℃储存。
[0055]
1.2.实验动物
[0056]
斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1l反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μs/cm；ph为6.5～8.5；硬度为50～100mg/lcaco3)，由本公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：syxk(浙)2022-0004，饲养管理符合国际aaalac认证(认证编号：001458)的要求。
[0057]
野生型ab品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后5天(5dpf)的斑马鱼用于改善睡眠功效最大检测浓度(mtc)测定及其功效评价。
[0058]
1.3.仪器、耗材与试剂
[0059]
解剖显微镜(szx7，olympus，japan)；ccd相机(verta1，上海土森视觉科技有限公司，china)；精密电子天平(cp214，ohaus，usa)；斑马鱼行为分析系统(zebra lab 3.22.3.31，viewpoint，france)；普通pcr扩增仪(t100，bio-rad，singapore)；荧光定量pcr仪(cfx connect，bio-rad，singapore)；紫外-可见光分光光度计(nanodrop2000，thermo，usa)；微孔板迷你离心机(be-6100，海门市其林贝尔仪器制造有限公司，china)；低位裙边96孔板(透明)(hsp9601，bio-rad，usa)；6孔板(nest biotech，china)；光学粘性封膜b(msb1001，bio-rad，usa)。
[0060]
戊四唑(ptz，批号a27o8l46880，上海源叶生物科技有限公司，china)；二甲基亚砜(dmso，批号bccd8942，sigma，switzerland)；无水乙醇(批号20210107，国药集团化学试剂有限公司，china)；powerup
tm
sybr
tm
greenmastermix(批号01145665，赛默飞世尔科技(中国)有限公司，lithuania)；fastking cdna第一链合成试剂盒(去基因组)(批号w0008，天根生化科技(北京)有限公司，china)；rna-quick purification kit(rna快速提取试剂盒)(批号20220101，yishan biotech，china)。
[0061]
2、检测方法
[0062]
2.1.mtc测定
[0063]
随机选取5dpf野生型ab品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾。水溶给予peony oil(浓度见表1)，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3ml。28℃处理24h后，除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予ptz建立斑马鱼失眠模型。28℃继续处理1h后，确定peony oil对模型斑马鱼的mtc。
[0064]
2.2.改善睡眠功效评价(表型评价)
[0065]
随机选取5dpf野生型ab品系斑马鱼于6孔板中，每孔30尾。水溶给予peony oil(浓
度见表2)，阳性对照褪黑素125μg/ml浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3ml。28℃处理24h后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼转移至96孔板中，1尾/200μl/孔。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予ptz建立斑马鱼失眠模型。利用行为分析仪测定1h内斑马鱼的觉醒活动量和觉醒总时间，以上述指标的统计学分析结果评价peony oil的改善睡眠功效；其中，觉醒活动量是指1h内斑马鱼快速运动距离总和(低速小于4mm/s，中速4-20mm/s，快速大于20mm/s)，觉醒活动时间则是指1h内斑马鱼快速运动的时间总和。统计学处理结果采用mean
±
se表示。用spss26.0软件进行统计学分析，p《0.05表明差异具有统计学意义。牡丹籽油、元宝枫油和ve分别给药浓度与牡丹籽油组合物(peony oil)一样，下同。
[0066]
2.3.改善睡眠功效评价(基因)
[0067]
随机选取5dpf野生型ab品系斑马鱼于6孔板中，每孔30尾。水溶给予peony oil(浓度见表3)，阳性对照褪黑素125μg/ml浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3ml。28℃处理24h后，除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予ptz建立斑马鱼失眠模型。28℃继续处理1h后，使用rna快速提取试剂盒提取各组斑马鱼总rna，利用紫外-可见光分光光度计对总rna浓度和纯度进行测定。取2.00μg斑马鱼样品总rna，按照cdna第一链合成试剂盒说明操作，合成20.0μl cdna，通过q-pcr检测β-actin、mtnr1aa和gabra1基因的表达。用β-actin作为基因表达的内参，计算mtnr1aa和gabra1基因的rna相对表达量。统计学处理结果采用mean
±
se表示。用spss26.0软件进行统计学分析，p《0.05表明差异具有统计学意义。
[0068]
3、检测结果
[0069]
3.1.mtc
[0070]
在本实验条件下，peony oil对模型斑马鱼的mtc为0.078μl/ml。详见表1。
[0071]
表1样品改善睡眠功效浓度摸索实验结果(n＝30)
[0072][0073]
3.2.改善睡眠功效评价(表型评价)
[0074]
在本实验条件下，peony oil具有改善睡眠功效，具体表现为觉醒活动量和觉醒总时间均减少。详见表2、图1、图2和图3。
[0075]
表2.样品改善睡眠功效评价实验结果(n＝10)
[0076][0077]
与模型对照组比较，**p《0.01，***p《0.001
[0078]
3.3.rna提取结果及引物序列信息
[0079]
在实验终点，提取斑马鱼总rna，用紫外-可见光分光光度计测定rna的浓度及a260/a280比值(表3)，a260/a280比值均在1.8-2.2之间，表明提取得到斑马鱼总rna质量较好，可用于后续q-pcr实验。引物序列见表4。
[0080]
表3.总rna的浓度及a260/a280比值(n＝30)
[0081][0082]
表4.引物序列信息
[0083][0084]
3.4.改善睡眠功效评价(基因)
[0085]
在本实验条件下，peony oil具有改善睡眠的功效，具体表现为上调mtnr1aa和gabra1基因相对表达量。详见表5、图4和图5。
[0086]
表5.样品改善睡眠功效评价实验结果(n＝3)
[0087][0088]
与模型对照组比较，*p《0.05，**p《0.01
[0089]
(二)牡丹籽油、元宝枫油和ve单独应用改善睡眠功效评价
[0090]
1、检测材料
[0091]
1.1.样品配制信息
[0092]
牡丹籽油、元宝枫油和ve分别加热后用10％dmso配制成100μl/ml母液，现配现用。
[0093]
阳性对照：褪黑素，白色粉末，批号f1804064，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，阴凉避光储存。用dmso配制成12.5mg/ml母液，-20℃储存。
[0094]
1.2试验动物
[0095]
同“(一)项下1.2.实验动物”[0096]
1.3仪器、耗材与试剂
[0097]
同“(一)项下1.3仪器、耗材与试剂”[0098]
2、检测方法
[0099]
2.1.mtc测定
[0100]
具体测定方法同“(一)项下2.1.mtc测定”。在本实验条件下，牡丹籽油、元宝枫油和ve分别给药的mtc均为0.078μl/ml。详见表6。
[0101]
表6.样品改善睡眠功效浓度摸索实验结果(n＝30)
[0102][0103]
2.2.改善睡眠功效评价(表型评价)
[0104]
具体测定方法同“(一)项下2.2.改善睡眠功效评价(表型评价)”。在本实验条件下，牡丹籽油、元宝枫油和ve均具有一定的改善睡眠功效，具体表现为觉醒活动量和觉醒总时间均减少；但在相同浓度下，他们改善睡眠的效果均低于牡丹籽油组合物(peony oil)。详见表7。
[0105]
表7.样品改善睡眠功效评价实验结果(n＝10)
[0106][0107][0108]
与模型对照组比较，**p《0.01，***p《0.001
[0109]
2.3.改善睡眠功效评价(基因)
[0110]
具体测定方法同“(一)项下2.3.改善睡眠功效评价(基因)”。在实验终点，提取斑马鱼总rna，用紫外-可见光分光光度计测定rna a260/a280比值均在1.8-2.2之间，表明提取得到斑马鱼总rna质量较好，可用于后续q-pcr实验。
[0111]
在本实验条件下，牡丹籽油、元宝枫油和ve均具有一定的改善睡眠功效，具体表现为上调mtnr1aa基因相对表达量；但在相同浓度下，他们改善睡眠的效果均低于牡丹籽油组合物(peony oil)，且对gabra1基因相对表达量无显著性影响。详见表8。
[0112]
表8.样品改善睡眠功效评价实验结果(n＝3)
[0113][0114]
与模型对照组比较，*p《0.05，**p《0.01
[0115]
综上，在改善睡眠功效方面，单独分别给药牡丹籽油、元宝枫油和ve的效果均低于同等剂量下的牡丹籽油组合物(peony oil)。
[0116]
本发明经动物试验证明：牡丹籽油组合物(peony oil)具有改善睡眠功效，具体表现为觉醒活动量和觉醒总时间均减少，上调mtnr1aa和gabra1基因相对表达量，在改善睡眠方面，相较单独的牡丹籽油、元宝枫油和ve具有更佳的功效，具备实际推广应用价值。