一种山东灵芝提取物的制备方法及其在制备降血糖药物中的应用

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种山东灵芝提取物的制备方法及其在制备降血糖药物中的应用。


背景技术：

2.山东灵芝ganderma shangdongense 担子果一年生，有柄，木栓质或木质，无气味、味苦，干燥后质量轻。菌盖形状多变，匙形或圆形。糖尿病（diabetes mellitus）是一种常见的代谢性疾病，其发病率在世界范围内逐年上升。据统计，目前全世界约有1.2亿糖尿病患者，已成为继心血管病、肿瘤之后严重威胁人类健康的第三大疾病。α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）是一种存在小肠绒毛粘膜细胞刷状缘的酶类，可以从淀粉和其它有关多糖的非还原端水解葡萄糖。人体对摄入的淀粉、蔗糖等碳水化合物的吸收利用，依赖于小肠内该酶的活性。α-葡萄糖苷酶抑制剂是上世纪 70 年代开发研制的一类新型口服降血糖药物，能竞争性抑制小肠内 α-葡萄糖苷酶的活性，延缓或抑制葡萄糖在肠道吸收，有效降低餐后高血糖。目前，临床常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等。目前，α-葡萄糖苷酶抑制剂主要来源于两个方向：从动植物及微生物中提取，以及人工半合成。α-葡萄糖苷酶抑制剂成分随来源物不同而不同，主要有多糖、生物碱、苷类、多肽、糖苷类、黄酮类、皂苷和酚类等。
3.天然抗氧化剂能有效调节氧化应激，减轻糖尿病、心脏、肝脏或神经系统性疾病和抑制癌转移。因此从植物中寻找天然的抗氧化剂，作为预防性干预活性氧介导的疾病，已经成为很有吸引力的研究领域之一。研究发现赤芝多糖、灵芝孢子粉粗多糖、紫芝、南方灵芝、无柄紫灵芝等具有抗氧化活性并呈浓度依赖性。kan 等验证灵芝是天然抗氧化剂和食品工业防腐剂的良好来源。


技术实现要素：

4.本发明提供一种山东灵芝提取物的制备方法及其在制备降血糖药物中的应用，测定山东灵芝四种提取物体外抗氧化和降血糖活性，为山东灵芝作为天然药剂的研发提供新的方向，同时为开发山东灵芝种质资源开发提供一定的理论基础。
5.本发明是通过以下技术方案实现的：一种山东灵芝提取物的制备方法，包括以下步骤：（1）将平板活化6-7d的山东灵芝菌种转接到液体菌种培养基中，25-29℃、110-150rpm摇床中震荡培养6-7d后，作为液体菌种，以5-10%的接种量转接到液体发酵培养基中扩大培养8-10d。培养结束后，用200目纱网进行过滤，得到发酵液和菌丝；其中所述山东灵芝（ganderma shangdongense）的保藏编号为cgmcc no.40284；（2）菌丝于50-60℃烘干，烘干磨成粉末。按照1:10-1:20的比例，用70-95%乙醇以60-100hz频率进行超声醇提，每次1h，重复3-4次，合并提取液用旋转蒸发仪进行乙醇回收
后剩余液体经冷冻干燥后，即得胞内醇提样品；（3）经醇提后的菌丝残渣，以1:5-1:10的比例，用90-100℃热水提取3-4次，每次1h，合并提取液后浓缩至原体积的1/10，后加入1-4倍70-95%乙醇进行醇沉，醇沉24-48h后，置5000r/min离心机中离心10min，所得沉淀经冷冻干燥后，即得胞内醇沉样品；（4）将过滤的发酵液加热并浓缩至原始体积的1/10，后加入1-4倍70-95%乙醇进行醇沉，醇沉24-48h后，置5000r/min离心机中离心10min，所得沉淀经冷冻干燥后，即为胞外醇沉样品；（5）取离心后的上清醇溶液用旋转蒸发仪进行乙醇回收后剩余液体经冷冻干燥后，即得胞外醇溶样品。
6.优选地，所述的山东灵芝液体菌种活化的过程为：接种量为每瓶10块0.5cm2平板菌种块，培养的前1-3天，温度设定25-27℃，转速110r/min，避光振荡培养；培养的第3-7天，温度设定27-29℃，转速130-150r/min，避光振荡培养。液体菌种培养的不同阶段，设定不同的温度和转速，以保证前期尽快定植，中后期快速增长。
7.优选地，所述的山东灵芝液体发酵扩大培养的过程为：液体菌种接种量5-10%，培养的第1-5天，温度设定27-29℃，转速130-150r/min，避光振荡培养；培养的第5-8天，温度设定25-27℃，转速110-130r/min，避光振荡培养。液体发酵扩大培养的不同阶段，设定不同的温度和转速，以保证前期尽快进入快速增长期，后期减缓衰老且促进次生代谢产物的积累。
8.优选地，液体菌种培养基为：马铃薯20%，合欢木屑1%，葡萄糖2%。
9.优选地，液体发酵扩大培养基为：玉米面1%，麸皮1%，蔗糖2%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.3%，kh2po
4 0.1%，mgso4·
7h20 0.05%。
10.上述制备方法制备的山东灵芝提取物在制备降血糖药物中的应用。山东灵芝提取物与医学上可接受载体制备成片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微球剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬剂、溶液剂、气雾剂、注射剂、注射乳剂、冻干粉针、缓释或控释制剂。
11.有益效果本发明通过将山东灵芝提取物的四组有效成分进行试验，发现具有明显的降低血糖的作用。
12.山东灵芝的胞外醇沉样品当浓度为1mg/ml时，对α-葡萄糖苷酶抑制效果最佳，抑制率可以达到90%以上，明显与阿卡波糖的抑制效果相近，表明其具有良好的体外降糖活性，通过lineweaver-burk双倒数作图法也可以看出胞外醇沉样品对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为竞争性抑制剂。这一研究对开发和可持续利用我国丰富的自然资源具有重要的科学和现实意义。
13.菌种保藏信息保藏时间：2022.8.24；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：cgmcc no.40284；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；分类命名：山东灵芝ganderma shangdongense。
附图说明
14.图1 山东灵芝发酵提取物对dpph的清除作用；图2山东灵芝发酵提取物对abts
+
清除作用；图3山东灵芝发酵提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用；图4山东灵芝胞外醇沉样品双倒数动力学曲线。
具体实施方式
15.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
16.实施例11材料与方法1.1材料1.1.1 供试菌株供试菌种为从合欢树上采集新鲜子实体后通过组织分离和菌种纯化而得到，该菌株分类命名为山东灵芝ganderma shangdongense，已于2022.8.24保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.40284。
17.子实体形态特征：菌盖匙形至圆形。菌盖直径6-6.5cm，厚1.2-2.8cm。菌盖表面有中度漆状光泽，浅黄褐色至黄褐色。菌盖表面有细微的同心环痕和沟纹。菌盖边缘锐或钝，幼时浅黄褐色至乳白色，成熟时变为黄褐色，与菌盖同色。菌柄呈扁平状或近圆柱形，侧生或背侧生，黄褐色至红褐色，长3-5cm，直径1-1.5cm。孔口表面幼时为白色，被触摸后变为褐色或深褐色，干燥时为淡黄色，多角形或近圆形。每毫米3-4个，管壁薄。菌肉为乳白色，无同心环纹，厚可达2.5cm，未见黑色壳质线。菌管浅黄褐色，硬木栓质,不分层，厚0.3-0.5cm。
18.显微结构特征：菌丝三体系；骨架菌丝占绝大多数，棕黄色，厚壁至亚实心，多二分枝；生殖菌丝有锁状联合，无色，薄壁，不常见；缠绕菌丝浅棕色，厚壁且内腔窄，至亚实心；以上３种类型菌丝ki-，cb+；在koh试剂中组织颜色变黑。菌肉菌丝：骨架菌丝1.7-4.5μm；生殖菌丝1.5-3μm；缠绕菌丝1-2.5μm。菌管菌丝：骨架菌丝2.2-5μm；生殖菌丝2-3.5μm；缠绕菌丝1.6-2.3μm。担子17-30
×
7-13μm；拟担子17-30
×
7-13μm。
19.菌种分子鉴定：子实体及菌丝体经试剂盒提取dna，并以its5/its4引物扩增和测序，子实体和菌丝体共同的rdna-its序列如下：tctgttgcgactgcggacgacattatcgagtttttgactgggttgtagctggccttcagaggcatgtgcacgccctgctcaatccactctacacctgtgcatttactgtgggtttcagatcgtgaagcgggctcttttacgggcccgtgaagcgcttctgtgcctgcgtttattacaaaccctgtaaagtatcagaatgtgtattgcgatgtaacgcatgtatatacaactttcagcaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccttggtattccgaggagcatgcctgtttgagtgtcatgaaatcttcaacctataagcctttgcggtttgtaggcttggacttggaggcttgtcggccctcgtcggtcggctcctcttaaatgcattagcttgattccttgcggatcggctgtcggtgtgataatgtctacgccgcgaccgtgaagcgtttggcgagcttctaatcgtcttgtatggagacaacgttatgacctctgacctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaagcatataaa
1.1.2 试剂药品pnpg（4-硝基酚-α-d-吡喃葡萄糖苷）；α-葡萄糖苷酶；阿卡波糖；dpph；abts；无水乙醇；过硫酸钾、na2co31.1.3 仪器紫外可见分光光度计（tu1810 北京普析通用仪器有限责任公司）；电子天平（cp214 奥豪斯仪器有限公司）；超灵敏多功能微孔板检测仪（cytation1 biotek公司）；恒温摇床（qyc 2112 上海福玛实验设备有限公司）；旋转蒸发仪（re-52aa型 上海亚荣生化仪器厂）；冷冻干燥机（fd-1a-50 北京博医康实验仪器有限公司）1.1.4供试培养基液体菌种培养基：马铃薯20%，合欢木屑1%，葡萄糖2%。
20.液体发酵培养基：玉米面1%，麸皮1%，蔗糖2%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.3%，kh2po
4 0.1%，mgso4·
7h20 0.05%。
21.1.2方法1.2.1四种粗提物的制备将平板活化6d的山东灵芝菌种转接到液体菌种培养基中，27℃、110-130rpm摇床中震荡培养6d后即得液体菌种。液体菌种以10%的接种量转接到液体发酵培养基中扩大培养8d后培养结束。发酵全液经200目纱网过滤，得到发酵液和菌丝。
22.菌丝于经50℃烘干后粉粹成粉末。按照1:10的比例，用95%乙醇以80hz频率进行超声醇提，每次1h，重复3次，合并提取液用旋转蒸发仪进行乙醇回收，剩余液体经冷冻干燥后即得胞内醇提样品；经醇提后的菌丝残渣，以1:10的比例，用100℃沸水提取3次，每次1h，合并提取液后浓缩至原体积的1/10，后加入4倍95%乙醇进行醇沉，醇沉24后，置5000r/min离心机中离心10min，所得沉淀经冷冻干燥后，即得胞内醇沉样品；将过滤的发酵液加热并浓缩至原始体积的1/10，后加入4倍95%乙醇进行醇沉，醇沉24h后，置5000r/min离心机中离心10min，所得沉淀经冷冻干燥后，即为胞外醇沉样品；取离心后的上清醇溶液用旋转蒸发仪进行乙醇回收后剩余液体经冷冻干燥后，即得胞外醇溶样品。
23.1.2.2 dpph自由基清除率测定方法参考聂少平等人的方法，并根据具体实验情况稍加改动进行实验。使用2
×
10-4
mol/l的dpph溶液，吸取样液和dpph溶液于试管, 避光摇匀，以蒸馏水为空白对照，于517nm波长处测定吸光度值编号ai。按照上述方法，用无水乙醇溶液代替dpph溶液，用蒸馏水代替样品所得到的吸光度值分别标号为aj和ac，均需设置3个重复。
24.计算清除率公式：清除率=[1-(ai-aj)/ac]*100%1.2.3 abts+自由基清除能力测定方法参考韩光亮等人的方法，并根据具体实验情况稍加改动进行实验。配制7.0mmol/labts溶液、2.45mmol/l过硫酸钾水溶液两者混匀需要在室温避光条件下进行，静置12-16h后，得到abts
+
母液。用ph=7.4的磷酸盐缓冲液(pbs)将abts
+
母液进行稀释，使其在734nm处吸光度值在0.70-0.023的范围，得到abts
+
工作液。取0.2ml样品溶液和abts
+
工作液于试管中，混匀在37℃下避光充分反应6min，以蒸馏水做空白对照，于734nm波长处测定吸光度编号a1，用磷酸盐缓冲液代替abts
+
工作液；蒸馏水代替样品的吸光度值分别为a2和a0, 均需设置3个重复。
[0025]
计算清除率公式：清除率(%)=[1-(a
1-a2/a0)]100%1.2.4 粗提物对 α-葡萄糖苷酶抑制活性采用体外抑制α-d-葡萄糖苷酶（α-葡萄糖苷酶）活性试验测定各发酵产物的降血糖活性。调整样品溶液浓度为1 mg/ml，采用磷酸钾缓冲液稀释，称取适量α-葡萄糖苷酶，溶于pbs溶液(0.1 mol/l，ph=6.8) 中，配成0.2 u/ml酶液。取适量样品，配置成1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml mg/ml浓度梯度的样品溶液。对照组: pbs 70μl，15 mmol pnpg 20μl，混匀，37 ℃反应10 min，加入α-葡萄糖苷酶20μl，混匀，37℃反应20 min后，150 μl na2co3终止反应。样品组: pbs 50 μl,样品20μl，15 mmol pnpg 20μl，混匀，37℃反应10 min，加入α-葡萄糖苷酶20μl,混匀，37℃反应20 min，150 μl na2co3终止反应。样品背景组:pbs 70 μl，样品20 μl，15 m mo/l pnpg 20μl，混匀，37℃反应30 min，150 μl na2co3终止反应。样品组为有浓度梯度的样本溶液及阳性对照品阿卡波糖。加样反应后，立即于405nm处测量吸收值。
[0026]
抑制率：a对照组-（a样品组-a样品背景）/a对照组
×
100%1.2.5 α-葡萄糖苷酶抑制类型研究利用lineweaver-burk 双倒数作图法判断其竞争反应类型。酶浓度不变(0.2u/ml)，设置5个底物pnpg浓度(0.125mmol/l、0.250mmol/l、0.5mmol/l、1mmol/l、2mmol/l)，根据样品的α-葡萄糖苷酶抑制活性，设定两个样品测定浓度(25μg/ml、50μg/ml)，分别向96孔板中加入60μl pbs溶液(ph6.8)、20μl样品和20μl的α-葡萄糖苷酶溶液(0.2 u/ml)，并吹打混合均匀，在 37℃的恒温水浴锅中孵育10 min。反应结束后加入20μl不同浓度的pnpg溶液，充分混合，在37℃的恒温水浴锅中继续孵育30 min，最后用排枪快速加入50μl的碳酸钠缓冲液(2mmol/l)终止反应，使用酶标仪每隔5min测定一次在405nm处的吸光度值，每个待测样品溶液均做3次平行重复，求得其平均值。以底物浓度的倒数(1/s)为横坐标，以反应速率的倒数(1/v)为纵坐标，绘制lineweaver-burk双倒数曲线，确定对α-葡萄糖苷酶的抑制类型。
[0027]
2结果与分析2.1 山东灵芝发酵提取物对dpph自由基的清除作用由图1可知，随样品浓度降低，山东灵芝四种发酵提取物对dpph自由基的清除能力不断降低。胞内水提和胞内醇提样品的清除率明显高于另外两种胞外提取物。在浓度为1mg/ml时，其中胞内水提清除率最高，清除率达到93.46%，胞内醇提在浓度为2mg/ml时，清除率为92.97%。胞内水提在浓度为0.8mg/ml及以上时清除率略低于vc，分别达到92.06%、93.46%和92.97%。而胞外醇沉和胞外醇溶在浓度为2mg/ml时清除率分别只有43.17%和28.57%。四种提取物对dpph清除能力大小为：胞内水提》胞内醇提》胞外醇沉》胞内醇溶。ic50值越小说明其清除能力越强，通过表1可以看出，胞内提取物对dpph自由基的清除效果明显优于胞外提取物。
[0028]
表1山东灵芝发酵提取物对dpph自由基清除活性的ic50值样品ic50(mg/ml)胞内水提0.20胞内醇提0.73胞外醇溶3.88
胞外醇沉2.352.2山东灵芝发酵提取物对abts+自由基的清除作用如图2可见，山东灵芝四种发酵提取物随样品浓度降低，对abts
+
自由基的清除能力不断降低，其中胞内水提和胞内醇提样品的清除率整体高于两种胞外提取物。山东灵芝的胞内醇提清除率最高，胞内水提清除率次之。胞内醇提粗提物在浓度为2mg/ml时，清除率达到100%，与vc的清除率相同，并且在浓度为1mg/ml时清除率略低于vc，为99.26%。胞内水提粗提物在浓度为2mg/ml时，清除率达到98.71%，略低于与同浓度的vc。通过表2得，胞内粗提物对abts
+
的清除作用优于胞外粗提物的清除能力，四种提取物对abts
+
清除能力大小依次为：胞内醇提》胞内水提》胞外醇沉》胞内醇溶。
[0029]
表2山东灵芝发酵提取物对abts
+
清除活性的ic50值样品ic50(mg/ml)胞内水提0.03胞内醇提0.02胞外醇沉0.06胞外醇溶0.072.3 山东灵芝发酵提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用山东灵芝四种发酵提取物各5个浓度对α-葡萄糖苷酶的抑制率结果见图3，结果显示：在浓度为1mg/ml时，胞外醇沉样品和阿卡波糖抑制率均在80%以上，两者抑制率无明显差别（p《0.01）。随样品浓度的降低，对α-葡萄糖苷酶的抑制率随之降低，呈现出明显的量-效关系。当浓度降低到0.001mg/ml时，四个样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率不再降低，基本维持在50%左右，但胞外醇沉样品对α-葡萄糖苷酶抑制效果显著优于其他3种提取物。4种样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性顺序为：胞外醇沉》胞内水提》胞外醇溶》胞内醇提。
[0030]
2.4山东灵芝发酵提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制类型研究山东灵芝胞外醇沉样品对α-葡萄糖苷酶活性抑制的反应类型通过 lineweaver-burk双倒数图（图4）可知：山东灵芝胞外醇沉样品对α-葡萄糖苷酶的抑制程度与其浓度成正比，酶反应过程中的最大反应速率 vmax（纵截距）不随着抑制剂的浓度改变而改变，最大反应速率 vmax始终保持不变，而米氏常数 km 值（横截距为-1/km）随着浓度增大而增大，由此说明，胞外醇沉样品对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用为竞争性抑制。
[0031]
3讨论据统计，糖尿病病例正以每年6%的速度上涨，而高血糖是造成糖尿病的主要原因之一。近几年来，许多国内外学者从天然产物中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂，例如：从sargassum fusiforme 提取的sfp的，lactuca serriola中乙酸乙酯部分等对α-葡萄糖苷酶的都有着明显的体外降血糖能力。山东灵芝的胞外醇沉样品当浓度为1mg/ml时，对α-葡萄糖苷酶抑制效果最佳，抑制率可以达到90%以上，阿卡波糖的抑制效果相近，表明其具有良好的体外降糖活性，通过lineweaver-burk双倒数作图法也可以看出胞外醇沉样品对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为竞争性抑制剂。这一研究结果对我国降血糖药用真菌资源开发利用具有重要的科学和现实意义。
[0032]
自由基对生物体具有双重作用。适量的自由基对维持生物体正常的生理代谢活动是必需的，例如氧自由基能在神经、内分泌、循环、免疫等生理活动中作为信号传导分子发
挥重要作用，能激发某些化学反应，提高酶的活性，能参与前列腺素、凝血酶原和胶原蛋白的合成，能杀菌、杀病毒，防止感染，从而保护人体的细胞和组织。但是，过量的自由基会导致细胞组织受到氧化胁迫，直接损伤细胞和间质成分，使脂质、糖类、蛋白质、dna 等生物大分子发生氧化损伤，从而导致细胞结构和功能的破坏以及机体组织的损伤。同时也是癌症、糖尿病以及衰老等多种疾病的主要原因。大量的食用菌也被证明有较强的抗氧化能力，例如灰树花、真姬菇、双孢蘑菇等真菌都证明有较好的抗氧化能力。本实验发现山东灵芝的四种发酵提取物中，胞内醇提样品清除abts
＋
自由基有较好的活性，其在浓度为2mg/ml时清除率与vc的清除率相同都达到100%，其ic50值为0.0238mg/ml，胞内水提样品在浓度为1mg/ml时对dpph自由基清除率达到93.46%，略低于vc对dpph自由基100%的清除率，其ic50值为0.209mg/ml，并且山东灵芝的胞内提取物对abts
＋
自由基和dpph自由基的清除活性均高于胞外提取物。
[0033]
综上所述，山东灵芝四种发酵提取物在体外降血糖和体外抗氧化等方面均有良好的表现，有作为相关疾病治疗的辅助药物的潜力，具有较大的开发价值。