数字PCR中微滴体积变异的影响分析方法与流程

数字pcr中微滴体积变异的影响分析方法
技术领域
1.本发明涉及pcr检测技术领域，尤其是涉及一种数字pcr中微滴体积变异的影响分析方法。


背景技术：

2.数字pcr(polymerase chain reaction，聚合酶链反应)属于第三代pcr技术，原理是将一个pcr反应体系分配到大量微小的反应单元(即微反应器)中，在每个微反应器中不含、或含有1个或多个拷贝的目标核酸分子模板，进行“单分子模板”pcr扩增，扩增结束后，通过终点荧光信号判断阳性单元，通过统计方法计算原始样本中目标基因的拷贝数。数字pcr无需依赖于对照样品、标准曲线就可进行精确的绝对定量检测，具有比荧光定量pcr更加出色的灵敏度、特异性和精确性，已经受到越来越多的关注。
3.微滴式数字pcr系统即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，待扩增反应结束后，采用拍照方式，通过微滴的亮暗来判断微滴的阴阳性，然后根据亮暗微滴的数量进行统计分析，获得目标基因的拷贝数目。显然亮暗微滴的数量直接影响到最终的分析结果，但在对照片进行图像处理时，常会发现因大小导致的异常微滴，如果这种异常微滴的大小远超出或远小于平均值，且数量很少，此时可将其舍弃，即不计入统计。因为微滴数量通常数以万计，一般认为去掉少量的异常微滴不会影响最终的计算结果。但当大部分面积的微滴大小不一、或某局部(比如1/10总微滴数)微滴因某流道较大而导致产生微滴偏大时，全部舍弃显然不可取，如果按照正常的步骤进行计算，显然会带来误差。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种数字pcr中微滴体积变异的影响分析方法，以分析微滴体积变异对评价指标的定量影响。
5.本发明实施例提供了一种数字pcr中微滴体积变异的影响分析方法，包括：
6.获取一批微滴图像对应的预设评价指标下的影响分析数据，所述影响分析数据包括目标体积变异参数和目标理论拷贝数浓度；
7.基于蒙特卡罗法，确定与所述影响分析数据对应的目标评价指标值。
8.进一步地，所述获取一批微滴图像对应的预设评价指标下的影响分析数据，包括：
9.获取一批微滴图像及其对应的基因拷贝数和理论微滴数；
10.对各个所述微滴图像进行微滴尺寸识别，得到尺寸识别结果；
11.根据所述尺寸识别结果，确定目标体积变异参数；其中，所述目标体积变异参数包括体积变异类型和变异程度，所述体积变异类型包括整体随机变异或局部确定性变异；
12.根据所述基因拷贝数和所述理论微滴数，计算得到目标理论拷贝数浓度。
13.进一步地，所述对各个所述微滴图像进行微滴尺寸识别，得到尺寸识别结果，包括：
14.对各个所述微滴图像依次进行滤波、图像增强和分割处理，得到包括每个微滴尺
寸的尺寸识别结果。
15.进一步地，所述根据所述尺寸识别结果，确定目标体积变异参数，包括：
16.从所述尺寸识别结果对应的初始微滴集合中，去除大于预设尺寸上限的微滴以及小于预设尺寸下限的异常微滴，得到剩余微滴集合；
17.当所述剩余微滴集合的微滴数量满足最少微滴数量要求时，判断所述剩余微滴集合的微滴尺寸是否满足正态分布；
18.当满足时，确定体积变异类型为整体随机变异，变异程度为所述剩余微滴集合的微滴尺寸对应的均值和标准差；
19.当不满足时，通过对所述剩余微滴集合的微滴尺寸进行聚类分析，确定体积变异类型为局部确定性变异及变异程度。
20.进一步地，所述通过对所述剩余微滴集合的微滴尺寸进行聚类分析，确定体积变异类型为局部确定性变异及变异程度，包括：
21.对所述剩余微滴集合的微滴尺寸进行聚类分析，得到聚类结果和聚类评价指标值；
22.当所述聚类评价指标值满足预设指标要求时，确定体积变异类型为局部确定性变异，并根据所述聚类结果，计算得到包括变异微滴占比及其尺寸偏差量的变异程度。
23.进一步地，所述基于蒙特卡罗法，确定与所述影响分析数据对应的目标评价指标值，包括：
24.在所述目标体积变异参数和所述目标理论拷贝数浓度下，采用蒙特卡罗法，进行阳性微滴数目的多次仿真统计，得到阳性微滴数目集合；
25.通过数字pcr泊松分布统计算法，对所述阳性微滴数目集合中的每个阳性微滴数目进行拷贝数浓度计算，得到仿真拷贝数浓度集合；
26.对所述仿真拷贝数浓度集合进行所述预设评价指标的计算，得到目标评价指标值。
27.进一步地，所述预设评价指标包括精度；所述对所述仿真拷贝数浓度集合进行所述预设评价指标的计算，得到目标评价指标值，包括：
28.通过如下公式计算得到目标精度值p：
29.p＝max(abs(y-x))/x；
30.其中，y为所述仿真拷贝数浓度集合，x为目标理论拷贝数浓度。
31.进一步地，所述数字pcr中微滴体积变异的影响分析方法还包括：
32.基于蒙特卡罗法，确定不同体积变异参数和不同理论拷贝数浓度下的评价指标值。
33.进一步地，所述数字pcr中微滴体积变异的影响分析方法还包括：
34.根据不同体积变异参数和不同理论拷贝数浓度下的评价指标值，绘制得到体积变异图表。
35.进一步地，所述数字pcr中微滴体积变异的影响分析方法还包括：
36.根据给定指标值，在所述体积变异图表中查找得到不同拷贝数浓度下的微滴体积的允许变异程度。
37.本发明实施例提供的数字pcr中微滴体积变异的影响分析方法包括：获取一批微
滴图像对应的预设评价指标下的影响分析数据，影响分析数据包括目标体积变异参数和目标理论拷贝数浓度；基于蒙特卡罗法，确定与影响分析数据对应的目标评价指标值。如此实现了微滴体积变异对预设评价指标的定量影响分析，缓解了目前仅从原理上要求尽量控制微滴体积均一性的问题，有利于指导数字pcr微滴产生流程的设计优化，易于理解，容易实现。
附图说明
38.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
39.图1为本发明实施例提供的一种数字pcr中微滴体积变异的影响分析方法的流程示意图；
40.图2为本发明实施例提供的另一种数字pcr中微滴体积变异的影响分析方法的流程示意图；
41.图3为本发明实施例提供的一种整体随机变异下，不同体积变异参数、不同理论拷贝数浓度下的精度曲线图；
42.图4为本发明实施例提供的一种局部确定性变异下，不同体积变异参数、不同理论拷贝数浓度下的精度曲线图。
具体实施方式
43.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
44.当微滴图像中大部分面积的微滴大小不一、或某局部(比如1/10总微滴数)微滴因某流道较大而导致产生微滴偏大时，全部舍弃显然不可取，如果按照正常的步骤进行计算，显然会带来误差，因为利用泊松分布对数字pcr进行计算的前提是，需要保证每个微滴体积大小一致，即目标核酸分子能以相同的概率分布于体积高度一致的微滴中。而如果知道了体积变异对误差的定量影响，一方面可根据设定的精度阈值对数字pcr检测结果进行评价；另一方面，也可对微滴产生工艺流程的设计进行优化。基于此，本发明实施例提供的一种数字pcr中微滴体积变异的影响分析方法，可以获得体积变异对误差的定量影响结果(利用蒙特卡罗法，分析了数字pcr微滴体积变异对精度的定量影响)。
45.为便于对本实施例进行理解，下面对本发明实施例所公开的一种数字pcr中微滴体积变异的影响分析方法进行详细介绍。
46.本发明实施例提供了一种数字pcr中微滴体积变异的影响分析方法，该方法可以由具有数据处理能力的电子设备执行。参见图1所示的一种数字pcr中微滴体积变异的影响分析方法的流程示意图，该方法主要包括如下步骤s102～步骤s104：
47.步骤s102，获取一批微滴图像对应的预设评价指标下的影响分析数据，影响分析
数据包括目标体积变异参数和目标理论拷贝数浓度。
48.其中，预设评价指标可以根据需求设置，例如预设评价指标为精度、平均值、最大误差或特定误差大小所占比例等。
49.在一些可能的实施例中，步骤s102可以通过如下子步骤实现：
50.子步骤1，获取一批微滴图像及其对应的基因拷贝数和理论微滴数。
51.子步骤2，对各个微滴图像进行微滴尺寸识别，得到尺寸识别结果。
52.可以对各个微滴图像依次进行滤波、图像增强和分割处理，得到包括每个微滴尺寸的尺寸识别结果。
53.子步骤3，根据尺寸识别结果，确定目标体积变异参数；其中，目标体积变异参数包括体积变异类型和变异程度，体积变异类型包括整体随机变异或局部确定性变异。
54.具体实现时，可以从尺寸识别结果对应的初始微滴集合中，去除大于预设尺寸上限的微滴以及小于预设尺寸下限的异常微滴，得到剩余微滴集合；当剩余微滴集合的微滴数量满足最少微滴数量要求时，判断剩余微滴集合的微滴尺寸是否满足正态分布；当满足时，确定体积变异类型为整体随机变异，变异程度为剩余微滴集合的微滴尺寸对应的均值和标准差；当不满足时，通过对剩余微滴集合的微滴尺寸进行聚类分析，确定体积变异类型为局部确定性变异及变异程度。
55.其中，预设尺寸上限和预设尺寸下限均可以根据实际情况设置，这里不做限定，例如，预设尺寸上限为微滴理论尺寸的3倍，预设尺寸下限为微滴理论尺寸/3。当剩余微滴集合的微滴数量不满足最少微滴数量要求时，说明此时有效微滴数量过少，没必要进行微滴体积变异的影响分析。
56.可选地，上述步骤通过对剩余微滴集合的微滴尺寸进行聚类分析，确定体积变异类型为局部确定性变异及变异程度，可以通过如下过程实现：对剩余微滴集合的微滴尺寸进行聚类分析，得到聚类结果和聚类评价指标值；当聚类评价指标值满足预设指标要求时，确定体积变异类型为局部确定性变异，并根据聚类结果，计算得到包括变异微滴占比及其尺寸偏差量的变异程度。需要说明的是，只有在聚类评价指标比如轮廓系数满足预设指标要求的情况下，才能确定体积变异类型为局部确定性变异，以确保微滴体积变异分析结果的准确度。
57.子步骤4，根据基因拷贝数和理论微滴数，计算得到目标理论拷贝数浓度。
58.目标理论拷贝数浓度＝基因拷贝数/理论微滴数。
59.需要说明的是，上述子步骤4与子步骤2、子步骤3之间无先后执行顺序。
60.步骤s104，基于蒙特卡罗法，确定与影响分析数据对应的目标评价指标值。
61.在一些可能的实施例中，上述步骤s104可以通过如下子步骤实现：
62.子步骤1，在目标体积变异参数和目标理论拷贝数浓度下，采用蒙特卡罗法，进行阳性微滴数目的多次仿真统计，得到阳性微滴数目集合。
63.子步骤2，通过数字pcr泊松分布统计算法，对阳性微滴数目集合中的每个阳性微滴数目进行拷贝数浓度计算，得到仿真拷贝数浓度集合。
64.子步骤3，对仿真拷贝数浓度集合进行预设评价指标的计算，得到目标评价指标值。
65.上述预设评价指标可以为精度；基于此，可以通过如下公式计算得到目标精度值
p：
66.p＝max(abs(y-x))/x；
67.其中，y为仿真拷贝数浓度集合，x为目标理论拷贝数浓度，max指取最大值，abs指求绝对值。
68.本发明实施例提供的数字pcr中微滴体积变异的影响分析方法，先获取一批微滴图像对应的预设评价指标下的影响分析数据，影响分析数据包括目标体积变异参数和目标理论拷贝数浓度；然后基于蒙特卡罗法，确定与影响分析数据对应的目标评价指标值。如此实现了微滴体积变异对预设评价指标的定量影响分析，缓解了目前仅从原理上要求尽量控制微滴体积均一性的问题，有利于指导数字pcr微滴产生流程的设计优化，易于理解，容易实现。
69.进一步地，上述方法还包括：基于蒙特卡罗法，确定不同体积变异参数和不同理论拷贝数浓度下的评价指标值。
70.进一步地，上述方法还包括：根据不同体积变异参数和不同理论拷贝数浓度下的评价指标值，绘制得到体积变异图表。体积变异图表可以包括与整体随机变异对应的第一变异图表和与局部确定性变异对应的第二变异图表。
71.进一步地，上述方法还包括：根据给定指标值，在体积变异图表中查找得到不同拷贝数浓度下的微滴体积的允许变异程度。通过体积变异图表，可以方便地查找到给定指标值、不同拷贝数浓度下的微滴体积的允许变异程度。
72.为了便于理解，以预设评价指标为精度为例，本发明实施例还提供了数字pcr中微滴体积变异的影响分析方法的详细过程，如图2所示，具体如下：
73.a)分类，即对数字pcr微滴体积变异进行分类。
74.步骤a1：获取实验微滴大小集合；
75.可以利用图像处理方法获取实验微滴大小。通过对多幅微滴图像进行滤波、图像增强、分割，可获得各微滴尺寸，舍弃大于预先给定微滴理论尺寸3倍或小于预先给定微滴理论尺寸/3的异常微滴(注：3、1/3经由实验经验确定，可根据具体实验情况进行调整)，如果剩余微滴数量满足最少微滴数量要求(注：可参考专利《一种确定微滴式数字pcr最少微滴数量的方法》)，获得剩余微滴集合。
76.步骤a2：确定体积变异类型。
77.可以通过分析实验微滴形态，确定体积变异类型。具体可以从两个方面进行分析，其一：如果剩余微滴集合的微滴尺寸满足正态分布，能够通过正态检验，则体积变异类型为整体随机变异；其二：如果剩余微滴集合的微滴尺寸不能通过正态检验，则进行二分类聚类分析(注：也可进行多分类聚类分析)，如果聚类评价指标比如轮廓系数满足要求(注：比如大于设定的阈值0.98)，则体积变异类型为局部确定性变异。
78.b)仿真，即基于蒙特卡罗法，计算不同体积变异参数、不同理论拷贝数浓度下的精度。
79.步骤b1：设计仿真流程；
80.首先，根据体积变异类型产生n＝20000个微滴(注：20000个为通常数字pcr需满足的微滴数量，也可改变该参数进行考察)：对于整体随机变异，以正态分布随机产生，其中均值μ为微滴总容积/n，标准差σ为均值μ的倍数，以一种参数设置为例，比如σ＝0.2μ(注：0.2
可变)；对于局部确定性变异，以局部所占比例产生，比如0.1，即其中有10％的微滴相比整体有确定性的体积变异，以一种参数设置为例，可设定变异程度+0.2，即相比正常的微滴，该部分微滴体积偏大20％。
81.其次，给定基因拷贝数，以一种参数设置为例，比如m＝1000个，即m个拷贝要进入n个微滴反应单元中，因微滴大小不一，有理由假定反应单元中实际含有目标拷贝的概率与该微滴单元的体积成正比，即体积越大，进入的概率越大，而理论拷贝数浓度x＝m/n；
82.最后，在特定的参数设置下，采用常规蒙特卡罗中的轮盘算法，统计m个拷贝进入的微滴数目，当两个或两个以上的拷贝进入同一个微滴时，该微滴只统计一次，有拷贝进入的微滴即为发亮阳性微滴，根据经典的数字pcr泊松分布统计算法，可计算得出该次仿真拷贝数浓度，循环进行10000次仿真实验(注：次数越多，结果越准确)，可得到每次实验对应的仿真拷贝数浓度yi，这些浓度的集合设为y；
83.步骤b2：计算不同体积变异参数、不同理论拷贝数浓度下的精度。
84.由仿真获得的该参数下各次仿真拷贝数浓度集合y，可得精度p：
85.p＝max(abs(y-x))/x。
86.其中，abs指求绝对值，理论的拷贝数浓度x＝m/n，n为理论微滴数，m为基因拷贝数。
87.更进一步，对于不同的体积变异参数、不同拷贝数目，可同样进行多次仿真实验，获得这些参数下的精度。
88.c)优化，即根据给定精度阈值确定不同理论拷贝数浓度下的允许变异程度，对微滴产生流程进行设计优化。
89.步骤c1：给定精度阈值；
90.这里精度阈值可根据具体情况确定，比如5％。
91.步骤c2：根据精度阈值确定不同理论拷贝数浓度下的允许变异程度，以对微滴产生流程进行设计优化。
92.基于步骤b可获得相关图表，由此可直接得出不同理论拷贝数浓度下的微滴体积的允许变异程度。
93.本发明实施例提出了一种数字pcr微滴体积变异对精度的影响分析方法，首先对数字pcr微滴体积变异进行分类，然后基于蒙特卡罗法，计算不同体积变异参数、不同理论拷贝数浓度下的精度，从而获得了体积变异对误差的定量影响结果(利用蒙特卡罗法，分析了数字pcr微滴体积变异对精度的定量影响)，缓解了目前仅从原理上要求尽量控制微滴体积均一性的问题，有利于指导数字pcr微滴产生流程的设计优化，易于理解，容易实现。
94.本实施例中，还分别计算了整体随机变异和局部确定性变异下的不同变异程度下的精度值，图3为整体随机变异下，不同体积变异参数、不同理论拷贝数浓度下的精度曲线图，图4为30％局部确定性变异下，不同体积变异参数、不同理论拷贝数浓度下的精度曲线图。由图3、图4可见，在理论拷贝数浓度较小的情况下，精度随着理论拷贝数浓度的变大而变大，即样本浓度越高，体积变异对精度的破坏越强。因此，在进行数字pcr实验时，对于高浓度样本定量，应尽量控制微滴体积的均一性。另外，由图3，对于整体随机变异，标准差越大，即变异程度越大时，定量的整体精度越差。由图4，对于局部确定性变异，变异程度对精度的影响则不明显。
95.在这里示出和描述的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
96.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。