一种两性离子聚合物-胰岛素偶联物及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种两性离子聚合物-胰岛素偶联物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.糖尿病是一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病，可导致严重的并发症，如肾病、心血管疾病、足部损伤等。作为一种全球性的公共卫生流行病，糖尿病影响着全世界4亿多人。胰岛素是治疗1型糖尿病的主要药物，它的发现从根本上改善了糖尿病的治疗和预后，使其从一种不治之症变成一种可控的慢性病。然而，与许多蛋白质药物类似，胰岛素也存在一些问题，如半衰期短，在储存和运输中稳定性差。为了达到降血糖目标，糖尿病患者每天需要多次注射胰岛素，这严重影响了他们的生活质量。此外，胰岛素需要在低温条件下储存和运输，因为高温会引起其聚集和降解，这不仅会损害其生物活性，还可能引起意外的免疫反应。另外，胰岛素需要低温储存，苛刻的运输要求限制了其在冷链设施缺乏地区的使用，如发展中国家的灾区和农村诊所。
3.为了改善胰岛素这两个方面的不足，几十年来，人们投入了大量的精力和资源来开发具有高稳定性的长效胰岛素。基因工程是生产长效胰岛素类似物的一种方法。例如，甘精胰岛素(赛诺菲-安万特)的半衰期延长至约13小时。对部分氨基酸序列和结构的精确操作改变了等电点，导致这种胰岛素类似物在皮下注射部位产生沉淀，从而延迟了溶解和吸收。然而，基因工程诱变程序是非常复杂的。更重要的是，甘精胰岛素在注射部位的降解会降低其生物利用度并诱发意外的免疫反应。除诱变策略外，与水溶性聚合物的偶联已成为改善蛋白质体内循环时间和保质期稳定性的一种普遍方法。到目前为止，用于胰岛素偶联的聚合物相对较少，主要包括聚乙二醇(peg)和含糖聚合物。虽然与这些聚合物偶联可以改善胰岛素的药代动力学和稳定性，但这往往会影响其活性。peg在应用于生物介质时也很容易被氧化降解。此外，尽管peg化通常被宣称可以降低蛋白质的免疫原性，但最近有越来越多的报告显示，在注射peg-蛋白质偶联物后出现了peg抗体。peg抗体不仅损害了peg-蛋白的功效，而且还可能引起严重的过敏反应。这些缺点阻碍了peg的进一步发展。因此需要开发新的胰岛素-聚合物偶联物，既不影响胰岛素活性，又能改善其药代动力学特征和储存稳定性。


技术实现要素：

4.本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种两性离子聚合物-胰岛素偶联物及其制备方法和应用。
5.本发明的第一个目的是提供一种胰岛素偶联物的制备方法。
6.本发明的第二个目的是提供一种胰岛素偶联物。
7.本发明的第三个目的是提供所述胰岛素偶联物在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
8.本发明的第四个目的是提供一种治疗糖尿病的药物。
9.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
10.一种两性离子聚合物-胰岛素偶联物的制备方法，具体步骤如下：
11.s1：2-溴异丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯与胰岛素反应，得到胰岛素大引发剂；
12.s2：混合步骤s1的胰岛素大引发剂、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和催化剂，脱氧，再混合溴化亚铜，充分聚合反应，得到两性离子聚合物-胰岛素偶联物；
13.所述催化剂为1，1，4，7，10，10-六甲基三亚乙基四胺、2，2
’‑
联吡啶或n，n，n’，n”，n
”‑
五甲基二乙烯三胺。
14.优选地，将含有胰岛素的na2co3缓冲液和含有2-溴异丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯的dmso溶液混合，搅拌反应，得到胰岛素大引发剂。
15.优选地，胰岛素和2-溴异丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1：1～1.5。
16.更优选地，胰岛素和2-溴异丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1：1.2。
17.优选地，所述na2co3缓冲液为0.1m，所述含有胰岛素的na2co3缓冲液中胰岛素的浓度为40mg/ml，所述含有2-溴异丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯的dmso溶液中2-溴异丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯的浓度为22mg/ml。
18.优选地，所述催化剂为n，n，n’，n”，n
”‑
五甲基二乙烯三胺。
19.更优选地，胰岛素大引发剂与2-一甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的摩尔比为1：20～1：200。
20.更优选地，胰岛素大引发剂与2-一甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱的摩尔比为1：40。
21.更优选地，胰岛素大引发剂：溴化亚铜：n，n，n’，n”，n
”‑
五甲基二乙烯三胺：的摩尔比为0.25～10：4：4。
22.更优选地，将胰岛素大引发剂、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和n，n，n’，n”，n
”‑
五甲基二乙烯三胺溶于tris缓冲液，其比例为30mg：30mg：1.73mg：4～10ml。
23.优选地，步骤s2中脱氧方式为通氮气，鼓泡脱氧。
24.更优选地，步骤s2中脱氧方式为通氮气，鼓泡脱氧10min。
25.优选地，步骤s2中聚合反应时间为7～14h。
26.优选地，步骤s2中充分聚合反应后，进行纯化；
27.用去离子水透析步骤s2聚合反应后的反应溶液，截留分子量3500，去除铜离子和其他杂质，得ins-pmpc粗品，冷冻干燥，得冷冻干燥的ins-pmpc粗品。
28.优选地，用配备有hitrap sp hp阳离子交换柱的akat蛋白质纯化系统纯化ins-pmpc粗品。
29.更优选地，将冷冻干燥的ins-pmpc粗品溶解在醋酸盐缓冲液中，得ins-pmpc粗品溶液，将ins-pmpc粗品溶液加载到hitrap sp hp阳离子交换柱子上，用含有nacl的醋酸缓冲液作为洗脱液，洗脱时间为100min，在280nm处连续检测洗脱液，收集纯化的ins-pmpc；
30.所述醋酸盐缓冲液浓度为10mm，ph为4.0，
31.所述洗脱液中nacl的梯度浓度为0～0.25m。
32.一种胰岛素偶联物，由所述制备方法制备得到。
33.所述胰岛素偶联物在制备糖尿病治疗药物中的应用。
34.优选地，所述药物为降低糖尿病治疗过程中低血糖发生风险的药物。
35.一种治疗糖尿病的药物，所述药物中含有所述胰岛素偶联物。
36.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
37.本发明公开了一种两性离子聚合物-胰岛素偶联物及其制备方法和应用。2-溴异丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯与胰岛素(ins)反应，通过在ins lys b29位置特异性引入atrp反应位点，得到胰岛素大引发剂(ins-br)；混合ins-br、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(mpc)和催化剂，脱氧，再混合溴化亚铜(cubr)，充分聚合反应，以cubr和pmdeta为催化体系，用ins-br引发两性离子单体mpc聚合，经透析和阳离子层析柱纯化技术，得到两性离子聚合物-胰岛素偶联物(ins-pmpc)。相比于ins和聚乙二醇-胰岛素偶联物(ins-peg)，在相同剂量下，本发明的ins-pmpc具有更长的血糖控制时间，同时显著减少低血糖的发生风险，在室温和机械搅拌下的稳定性高，耐储存，适用于冷链设施缺乏的地区，是一种安全性更高的长效胰岛素药物。
附图说明
38.图1为ins-pmpc的合成路线图。
39.图2为用maldi-tof分析经二硫苏糖醇(dtt)还原的ins-br与ins-peg，和未经处理的ins-br与ins-peg的分子量。其中a为经或不经dtt处理的ins-br的maldi-tof质谱图，b为ins-peg的maldi-tof质谱图，c为经dtt处理的ins-peg的maldi-tof质谱图。
40.图3为ins-br、ins、ins-peg和ins-pmpc的流体力学尺寸和ins-br的二级结构。其中a为ins-br的动态光散射(dls)图，b为ins-br的圆二色谱(cd)图，c为ins、ins-peg和ins-pmpc的dls图。
41.图4为非变性page电泳图。其中a中泳道1为ins，泳道2为ins-br，泳道3为ins-pmpc粗品，泳道4为纯化的ins-pmpc；b中泳道5为ins，泳道6为ins-peg粗品，泳道7为纯化的ins-peg。
42.图5为ins-pmpc和ins的凝胶色谱(gpc)图。
43.图6为ins-pmpc的maldi-tof质谱图。
44.图7为ins、ins-peg和ins-pmpc的血糖控制能力。其中a为皮下注射ins、ins-peg和ins-pmpc后，糖尿病小鼠(链脲霉素诱导)的血糖情况，及五次葡萄糖耐量实验中小鼠的血糖情况，箭头依次代表每次葡萄糖耐量实验进行时间。b为皮下注射ins、ins-peg和ins-pmpc后4h内，糖尿病小鼠中患低血糖症的小鼠数量。c为图7a中第一葡萄糖耐量实验曲线的曲线下面积。结果以平均值
±
sd表示(n＝6)。
45.图8为cy 7荧光染料标记ins、ins-peg和ins-pmpc经静脉注射到后小鼠后，小鼠血液荧光强度与时间的关系，结果以平均值
±
sd表示(n＝5)。
46.图9为小鼠对ins、ins-peg和ins-pmpc的低血糖指数。其中a为注射ins、ins-peg和ins-pmpc的小鼠6h内的血糖变化，结果以平均值
±
sd表示(n＝6)。b为图9a曲线上方和低血糖指示线下方的面积。
47.图10为ins、ins-peg和ins-pmpc的稳定性。其中a为糖尿病小鼠注射储存前后的ins和ins-pmpc的血糖变化情况，结果以平均值
±
sd表示(n＝6)。b为根据图10a计算的曲线下面积(auc)值。c为在ph7.4和37℃震荡下的ins、ins-peg和ins-pmpc的溶液透光率变化情况。d为热聚集实验后ins、ins-peg和ins-pmpc的动态光散射(dls)图。e为ins、ins-peg和
ins-pmpc的圆二色谱(cd)光谱图。f为根据图10e的cd光谱图计算的ins、ins-peg和ins-pmpc的二级结构比例。
具体实施方式
48.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
49.实施例1制备胰岛素-聚(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)偶联物(即两性离子聚合物-胰岛素偶联物，ins-pmpc)和胰岛素-peg偶联物
50.一、实验方法
51.如图1所示，为合成ins-pmpc的合成路线图。用grafting from策略结合原子转移自由基聚合(atrp)技术，合成ins-pmpc。
52.1、合成胰岛素大引发剂(ins-br)
53.根据胰岛素三个残余氨基的pka差异(gly a1氨基、phe b1氨基和lys b29氨基的pka值分别为8.6、6.8和11.2)，通过控制反应时间和溶液的ph值，在胰岛素lys b29位置特异性引入atrp反应位点。所述胰岛素lys b29为胰岛素b链第29位赖氨酸。
54.2-溴异丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯作为atrp引发剂，按照文献(lecolley f,lei t,mantovani g,et al.a new approach to bioconjugates for proteins and peptides(pegylation)utilising living radical polymerisation[j].chimica oggi:international journal of chemistry and biotechnology,2005(1):23.)方法合成。
[0055]
将200mg胰岛素(ins)溶于5ml 0.1m na2co3缓冲液中，得到胰岛素(ins)溶液。将11mg 2-溴异丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯溶于0.5ml dmso缓冲液中，得到2-溴异丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯溶液。
[0056]
混合上述ins溶液和2-溴异丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯溶液，在4℃条件下搅拌1h，得到ins-br粗品，用pd-10脱盐柱对ins-br粗品脱盐，冷冻干燥后于-20℃条件下储存。
[0057]
2、合成ins-pmpc
[0058]
(1)将30mg ins-br、30mg mpc单体(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱)和1.73mg pmdeta(n，n，n’，n”，n
”‑
五甲基二乙烯三胺)溶于4ml tris缓冲液(50mmol，150mmol nacl，ph7.4)，得混合物溶液。
[0059]
(2)将步骤(1)的混合物溶液通氮气，鼓泡脱氧10min，将1.43mg cubr快速加入到脱氧后的混合物溶液中，聚合过夜(7～14h)。ins-br：mpc：pmdeta：cubr的摩尔比为1：40：4：4。
[0060]
以cubr和pmdeta为催化体系，用ins-br引发两性离子单体mpc聚合，得到ins-pmpc。
[0061]
(3)用去离子水透析步骤(2)处理后的反应溶液，截留分子量3500，去除铜离子和其他杂质，得ins-pmpc粗品，冷冻干燥。
[0062]
(4)用配备有hitrap sp hp阳离子交换柱的akat蛋白质纯化系统纯化ins-pmpc。将步骤(3)冷冻干燥的ins-pmpc粗品溶解在醋酸盐缓冲液(10mm，ph4.0)，将其加载到
hitrap sp hp阳离子交换柱子上。用带有nacl梯度(0至0.25m)的醋酸缓冲液在100min内洗脱该柱。在280nm处连续检测洗脱液，收集目标产品ins-pmpc。
[0063]
(5)用去离子水透析步骤(4)纯化的产品ins-pmpc，冷冻干燥。
[0064]
3、制备聚乙二醇-胰岛素偶联物(ins-peg)
[0065]
胰岛素-peg偶联物的制备和纯化是按照以前发表的方法进行的，并做了适度的修改(wang yuanpeng,fu mian,wang zuwei,zhu x x,guan ying,zhang yongjun.a sustained zero-order release carrier for long-acting,peakless basal insulin therapy.[j].journal of materials chemistry.b,2020,8(9).)。
[0066]
(1)将75mg peg-nhs(甲氧基聚乙二醇羧甲基琥珀酰亚胺酯)溶解在dmso溶液中，得到peg-nhs溶液。
[0067]
(2)将58mg胰岛素溶解在含有0.8mg dmso和1.7ml碳酸盐缓冲液(0.1m，ph11)的混合溶剂中，得到胰岛素混合溶液。
[0068]
(3)立即将0.5ml步骤(1)的peg-nhs溶液注入步骤(2)所述胰岛素混合溶液中，在室温(25℃)下搅拌1h，加入12ml的h2o结束反应，得ins-peg粗品，冷冻干燥。
[0069]
(4)与合成ins-pmpc的步骤(4)和(5)相同。
[0070]
实施例2合成ins-pmpc
[0071]
实验组1、实施例1的胰岛素大引发剂(ins-br)为60mg，使ins-br与mpc单体(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱)的摩尔比为1：20，合成ins-pmpc的其他参数与实施例1相同。
[0072]
实验组2、实施例1的mpc单体为15mg，使ins-br与mpc单体的摩尔比为1：20，合成ins-pmpc的其他参数与实施例1相同。
[0073]
实验组2、实施例1的mpc单体为150mg，使ins-br与mpc单体的摩尔比为1：200，合成ins-pmpc的其他参数与实施例1相同。
[0074]
实验组3、实施例1的cubr为0.7mg，使cubr与ins-br的摩尔比为1：1，合成ins-pmpc的其他参数与实施例1相同。
[0075]
实验组4、实施例1的cubr为7mg，使cubr与ins-br的摩尔比为1：10，合成ins-pmpc的其他参数与实施例1相同。
[0076]
实验组5、实施例1的pmdeat(n，n，n’，n”，n
”‑
五甲基二乙烯三胺)为0.8mg，使pmdeat与ins-br的摩尔比为1：1，合成ins-pmpc的其他参数与实施例1相同。
[0077]
实验组6、实施例1的pmdeat为1.7mg，使pmdeat与ins-br的摩尔比为1：10，合成ins-pmpc的其他参数与实施例1相同。
[0078]
实验组7：实施例1的tris缓冲液的体积为6ml，合成ins-pmpc的其他参数与实施例1相同。
[0079]
实验组8：实施例1的tris缓冲液的体积为10ml，合成ins-pmpc的其他参数与实施例1相同。
[0080]
实验组9：将实施例1的pmdeta替换为1，1，4，7，10，10-六甲基三亚乙基四胺(hmtema)，合成ins-pmpc的其他参数与实施例1相同。
[0081]
实验组10：将实施例1的pmdeta替换为2，2
’‑
联吡啶(bpy)，合成ins-pmpc的其他参数与实施例1相同。
[0082]
实施例2分析胰岛素(ins)、胰岛素大引发剂(ins-br)、聚乙二醇-胰岛素偶联物
(ins-peg)和胰岛素-聚(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)偶联物(ins-pmpc)的物理性质与体外细胞活性
[0083]
一、实验方法
[0084]
1、用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof)分析经二硫苏糖醇(dtt)还原的ins-br与ins-peg，和未经处理的ins-br与ins-peg的分子量。
[0085]
2、用动态光散射技术分析ins-br、ins、ins-peg和ins-pmpc的流体力学尺寸。用圆二色光谱仪分析胰岛素和ins-br的二级结构。
[0086]
3、对胰岛素、ins-br、ins-pmpc粗品、纯化后的ins-pmpc、ins-peg粗品、纯化后的ins-peg进行非变性page凝胶电泳。
[0087]
4、用凝胶色谱(gpc)分析胰岛素和ins-pmpc。
[0088]
5、用maldi-tof分析ins-pmpc分子量。
[0089]
二、实验结果
[0090]
1、如图2a所示，除了胰岛素的原始峰m/z＝5808外，中出现了新的峰m/z＝5957，表明ins-br合成成功。仅在胰岛素b链上观察到分子量增加(从3431到3580)。
[0091]
如图2b所示，10949(m/z)的峰表示ins-peg，峰值间差值(44da)与peg链重复单元分子量一致。
[0092]
如图2c所示，为了验证偶联位点，用dtt处理了ins-peg。在maldi-tof质谱中观察到两个峰，一个是2384(m/z)的峰，一个是8525(m/z)的峰。2384(m/z)的峰对应胰岛素的a链，8525(m/z)的峰与胰岛素b链和5000da peg的分子量之和匹配。
[0093]
2、如图3a所示，为ins-br的动态光散射(dls)图，如图3b所示，为胰岛素和ins-br的圆二色光谱(cd)图，表明atrp引发剂偶联并没有明显改变胰岛素的流体力学大小和二级结构。
[0094]
如图3c所示，ins、ins-peg和ins-pmpc的流体力学尺寸分别为2.4
±
0.4、5.8
±
0.5和6.3
±
0.2nm。ins-peg和ins-pmpc流体力学相似，保证了其在后续比较实验中的公平性。
[0095]
小尺寸的胰岛素会通过肾脏过滤迅速从体内清除，因此它的血液半衰期非常短(大约9min)。由于ins-peg粒径较大，降低肾脏的清除率，可以延长其在体内的循环时间。ins-pmpc也比胰岛素粒径大，ins-pmpc在体内的半衰期也得到延长。
[0096]
3、如图4a所示，胰岛素以单个条带迁移，但由于胰岛素和ins-br之间的净电荷变化，ins-br粗品以两个条带迁移。聚合后，ins-br的条带几乎消失，出现一个ins-pmpc共轭物的高分子量的条带。用离子交换柱纯化后，只有ins-pmpc的条带被保留下来。
[0097]
如图4b所示，在偶联反应后，观察到一条ins-peg的新条带和未反应的胰岛素条带。纯化后只保留ins-peg的条带。
[0098]
4、如图5所示，ins-pmpc的保留时间(24.5min)比胰岛素(25.8min)短，表明ins-pmpc具有比胰岛素更大的分子量。
[0099]
5、如图6所示，maldi-tof光谱中的峰值间隔为296(m/z)，正好与mpc单体分子量一致。
[0100]
实施例3ins-peg对体内血糖控制情况
[0101]
一、实验方法
[0102]
用链脲霉素(stz)诱导的1型糖尿病小鼠，评估实施例1制备的胰岛素-聚合物偶联
物的血糖控制能力。
[0103]
分别在1型糖尿病小鼠中单次皮下(s.c.)注射胰岛素、ins-peg、ins-pmpc和pbs缓冲液(阴性对照)后，检测小鼠的血糖水平，每组6只小鼠，注射剂量都为5u/kg。
[0104]
用不同剂量的葡萄糖模仿一个人一天中食物摄入量的变化。在皮下注射药物4.5h、8.5h、11.5h、14.5h和17.5h，对小鼠进行腹腔葡萄糖耐量实验(ipgtt)，共进行了五次，以测试ins-pmpc对葡萄糖的响应能力。其中第一次到最后一次ipgtt实验葡萄糖注射量依次为3、2、1、2和2g/kg。
[0105]
为了量化ins-pmpc、胰岛素和ins-peg的调节血糖的能力，用graphad prism 7.0计算软件，计算第一次ipgtt实验的每组的曲线下面积(auc)。
[0106]
二、实验结果
[0107]
1、如图7a所示，三组小鼠的血糖水平都在30min内迅速下降到正常范围，小鼠的血糖水平《11.1mmol/l。阴性对照组的小鼠血糖水平仍然高。与胰岛素和ins-peg相比，ins-pmpc在调节血糖更温和，降糖速度更缓慢，不容易出现低血糖。
[0108]
2、如图7b所示，在注射葡萄糖的前4h内，胰岛素组和ins-peg组共有5只小鼠出现低血糖(小鼠《3.3mmol/l)，而ins-pmpc组只有1只小鼠出现低血糖。如图7a所示，ins-pmpc组发生低血糖的小鼠的血糖值，如2.9mmol/l和3.2mmol/l，都非常接近离临界值3.3mmol/l。胰岛素组和ins-peg组的小鼠血糖值，如1.1mmol/l、1.5mmol/l和2.0mmol/l，在低血糖状态下，离临界值3.3mmol/l非常遥远。在用胰岛素和ins-peg治疗的小鼠中，观察到了典型的低血糖症状，如体温过低，甚至癫痫发作。腹腔葡萄糖耐量实验表明，在快速的血糖飙升之后，ins-pmpc在1.5h内将血糖恢复到正常水平(《11.1mmol/l)。在葡萄糖注射后后，胰岛素并没有表现出降糖效果。
[0109]
3、如图7c所示，相对于胰岛素和ins-peg，ins-pmpc的auc最小。结合图7a，可以看出，在注射后8.5h进行第二次ipgtt后，ins-pmpc再次将升高的血糖降低至正常血糖，而ins-peg在第二次ipgtt没有表现出降糖效果。在第三次ipgtt实验之后，ins-pmpc仍然显示出将血糖调节回正常水平的能力。ins-pmpc的血糖控制时间达20h，表明ins-pmpc的使用剂量为每天一次，在治疗糖尿病方面有巨大潜力。
[0110]
实施例4ins-pmpc延长半衰期
[0111]
一、实验方法
[0112]
为了证明ins-pmpc对血糖控制的长期疗效，对实施例1的ins-pmpc、ins-peg和未修饰胰岛素(ins)的初步药代动力学进行研究。将0.1mg/kg cy 7荧光染料标记ins-pmpc、ins-peg和ins分别皮下注射(s.c.)于小鼠。在预定的时间间隔内收集小鼠血样，检测荧光强度。
[0113]
二、实验结果
[0114]
如图8所示，注射药物后，ins-pmpc、ins-peg和ins三组的血液样本的荧光强度提高得非常快，在2h或3h内达到最大值。ins-pmpc组的最大血液荧光强度最低，比ins和ins-peg组小1/3。此外，ins和ins-peg组的血液荧光强度迅速下降到与注射前相当的基础值。ins-pmpc组注射24h后的血样中仍可检测到荧光信号，表明ins-pmpc的循环时间延长了。
[0115]
实施例5ins-pmpc完全抑制低血糖的发生
[0116]
一、实验方法
[0117]
为了评估实施例1的ins-pmpc诱发的低血糖风险，健康小鼠分别注射实施例的胰岛素、ins-peg和ins-pmpc，剂量都是5u/kg，在预设定时间点监测小鼠血糖变化。
[0118]
二、实验结果
[0119]
如图9a所示，ins-pmpc在初始阶段显示出较慢的降血糖速度。ins和ins-peg的小鼠分别从0.5h和1h开始出现低血糖，低血糖定义为葡萄糖浓度低于3.3mmol/l，如图9a中的虚线所示，ins-pmpc组的血糖在整个实验中都高于低血糖指示线。
[0120]
如图9b所示，计算图9a中曲线以上和虚线以下的面积，量化降糖效果。ins-pmpc完全阻止了低血糖的发生，而ins组和ins-peg组的低血糖风险没有显著差异。
[0121]
实施例6ins-pmpc的稳定性
[0122]
与其他治疗性的蛋白类似，如果不在适当的储存和运输条件下，胰岛素很容易发生聚集和降解。例如，胰岛素在25℃以上条件下，每升高10℃就增加10倍或更多降解率。胰岛素的不稳定性不仅会导致其生物活性的丧失，甚至会诱发意外的免疫反应。高温是损害胰岛素在储存和运输过程中的稳定性的主要因素，这个问题会因为发展中国家糖尿病发病率的上升而加剧，因为这些国家的冷链设施不能得到保证。除了高温，蛋白质在运输过程中经常受到机械搅拌的影响，从而引发展开和不可逆的聚集。
[0123]
一、实验方法
[0124]
将实施例1的ins、ins-peg和ins-pmpc在37℃条件下储存10天后，按照实施例3的方法，分别单次皮下(s.c.)注射储存前后的ins和ins-pmpc给链脲霉素(stz)诱导的1型糖尿病小鼠，检测其6h内的降血糖功效，评估高温对药物的生物活性影响。
[0125]
在生理ph值和温度(ph7.4和37℃)下，对实施例1的ins、ins-peg和ins-pmpc持续搅拌60h，做聚集实验。检测药物在540nm处的光学透射率，评估药物聚集的动力学特征，聚集时间为透射率的变化大于初始透射率值的10％。用纳米粒度仪量不同胰岛素样品再热稳定性实验前后的尺寸变化。
[0126]
为了了解ins-pmpc良好的稳定性的原因，用圆二色光谱仪分析ins、ins-peg和ins-pmpc的二级结构。
[0127]
二、实验方法
[0128]
如图10a和图10b所示，37℃储存10天的ins-pmpc和储存前的血糖曲线基本一致。37℃下储存10天的ins的降血糖功效比储存前明显下降。
[0129]
如图10c所示，ins在持续搅拌10h后聚集，而ins-peg和ins-pmpc的透射率在整个60h的持续搅拌实验中的变化不超过3％。
[0130]
如图10d所示，ins-peg的尺寸从聚集实验前的5.8
±
0.5nm增加到实验后的52.3
±
5.8nm，而ins-pmpc的尺寸在聚集实验前后处于相似水平(6.3
±
0.2nm与6.1
±
0.2nm)。表明ins-peg在聚集实验中表现出一定的聚集，而ins-pmpc没有。
[0131]
如图10e和图10f所示，ins和ins-peg除了无规线圈结构发生了变化(ins为31％，ins-peg为29％)二级结构参数基本上没有变化。ins-pmpc的α-螺旋结构百分比为47％(明显高于ins的37％和ins-peg的37％)，ins-pmpc的无规线圈结构百分比为22％(低于ins的31％和ins-peg的29％)。这表明pmpc共轭对胰岛素二级结构有很好的稳定作用，这对胰岛素的储存和运输至关重要。
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最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保
护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。