具有改进结构的68Ga标记的Exendin4放射性探针及其制备方法

本发明涉及一种具有改进结构的68ga标记的exendin 4放射性探针及其制备方法，特别涉及一种68ga标记的靶向胰高血糖素样肽-1受体(glucagon-like peptide-1，glp-1r)的exendin-4放射性探针及其制备方法，属于放射性药物化学。

背景技术：

1、国际糖尿病联盟(the international diabetes federation，idf)于2021年12月6日正式发布了第十版《全球糖尿病地图》，报告显示：2021年全球20-79岁成年人中就有5.37亿(10.5％)糖尿病患者，约600万成年人死于糖尿病或其并发症，糖尿病患病总人数，预计到2030年，增至6.43亿(11.3％)，到2045年，增至7.87亿(12.2％)。2021年，中国糖尿病患病人数约为1.4亿，占全球患病总人数的1/4，此外，预估7300万糖尿病患者未被确诊，这意味着几乎每两个成年糖尿病患者中就有一个不知道自己患有糖尿病。糖尿病及其合并症给全世界人民带来沉重的社会负担和经济负担，糖尿病的早期诊断可控制病程发展，提高患者生活质量，缓解病情带来的经济和社会负担。

2、糖尿病根据发病机制的不同主要被分为i型糖尿病(type 1diabetes mellitus，t1dm)和ⅱ型糖尿病(type 2diabetes mellitus，t2dm)。t1dm和t2dm的病理特征主要表现为胰岛β细胞质量(β-cell mass，bcm)的减少和β细胞功能的丧失。t1dm的发病机制为自身免疫或其它原因导致分泌胰岛素的β细胞被破坏，胰岛素分泌缺乏，从而引起血糖升高。患者一旦确诊为t1dm，就必须终身依赖胰岛素治疗；t2dm发病受到遗传、生活方式和年龄等多方面因素的影响，患者可在患病初期通过控制饮食、适量运动及药物治疗等方法遏制病情发展。大约90％的糖尿病患者为t2dm，且t2dm患者往往起病隐匿，早期没有明显症状，但此时胰岛β细胞质量的减少或者β细胞功能丧失已经发生且不可逆转。随着病情进展，糖尿病患者，除了血糖升高，伴随而来的严重并发症，如糖尿病肾病、心血管疾病、视网膜病变、神经系统病变、肝脏纤维化等甚至会危及患者生命，所以，早期诊断糖尿病并进行及时的干预和治疗，至关重要。

3、胰岛β细胞是产生和分泌调节血糖稳态激素——胰岛素(insulin)的内分泌细胞，与其它胰岛内分泌细胞(α细胞、δ细胞、pp细胞和ε细胞等)组成胰岛，胰岛随机分布在胰腺组织内部。胰岛β细胞质量减少和功能障碍在糖尿病的早期就已发生，并且在病情发展中起着核心作用，所以，检测β细胞质量和功能是糖尿病早期诊断的关键。胰岛β细胞数量占胰岛内分泌细胞数量的60％-80％，只占整个胰腺细胞数量的2％，这对胰岛β细胞的检测提出巨大挑战。现阶段常用于临床的功能性检测如血糖检测、胰岛素检测、胰岛c肽检测等方法，无法在单个胰岛水平或β细胞水平上准确地测定β细胞的功能；虽然活检和尸检是现阶段测量β细胞质量的“金标准”，但检测方法具有入侵性和取样不确定性的缺点，患者不仅要承受活检带来的痛苦，而且胰腺切片和固定，会影响胰岛β细胞的活性，进而影响胰岛β细胞检测的准确性。

4、核医学正电子发射计算机断层显像(positron emission computed tomography，pet)是一种无创的活体显像技术，具有高灵敏度、高分辨率等优点，已被广泛用于各种重大疾病的早期诊断、病情监测、疗效评估和新药开发等。核医学显像技术在β细胞质量检测方面具有巨大的临床应用前景，开发性质优良的β细胞特异性放射性探针，能够从根本上弥补临床β细胞检测的不足，实现bcm的无创精准监测，为糖尿病的早期诊断、病情监测和疗效评估，提供可靠的分子探针和技术。

5、已有多种基于不同靶点的β细胞放射性探针被研究用于bcm监测，其中，胰高血糖素样肽1受体(glucagon-like peptide 1 receptor，glp-1r)是研究最为清楚的用于bcm监测的特异性受体。glp-1r属于b类g蛋白偶联受体家族，特异性高度表达于胰岛β细胞，是目前治疗t2dm的理想靶点。艾塞那肽(exenatide，exendin-4)是美国食品药品监督管理局(food and drug administration，fda)批准的第一个glp-1r激动剂，用于t2dm患者的血糖控制。exendin-4与glp-1r的结合亲和力高，能抵抗dpp-4的降解，体内稳定性好，血液半衰期为2.4h，细胞结合和内化高，是开发监测bcm的放射性探针的最佳候选化合物。

6、放射性标记的exendin-4对β细胞质量的监测能力，使其不仅可以用于糖尿病的早期诊断，还可以用于胰岛素瘤(insulinoma)的显像定位。胰岛素瘤为胰岛β细胞肿瘤，亦称内源性高胰岛素血症(endogenous hyperinsulinemichypoglycemia，ehh)，是一种较为罕见的神经内分泌肿瘤(每年每一百万人发病人数为4人)，是胰腺中最常见的功能性胰岛细胞肿瘤，其特征是胰岛β细胞过度增殖，胰岛素分泌不受控，患者出现低血糖等临床症状。胰岛素瘤大多为良性肿瘤，手术切除是主要的治疗手段，但由于肿瘤体积小，传统的成像技术如腹部超声、计算机断层扫描等很难定位病变，而且不完全切除病变，可能会导致症状持续，因此，胰岛素瘤的成功治疗取决于术前的精确定位。利用β细胞特异性探针能够精准定位胰岛素瘤，指导胰岛素瘤的手术切除，实现胰岛素瘤的精准诊疗。

7、目前，已有数种对β细胞或胰岛素瘤具有成像能力的exendin4类pet放射性探针报道，例如ram k.selvaraju等人将68ga-do3a-exendin-4用于胰腺中glp-1r受体定量，并通过剂量递增探究其在啮齿动物、非人类灵长动物和人类显像最佳用量。2022年olof eriksson等人报道了68ga-do3a-exendin-4人体研究结果，在注射68ga-do3a-exendin-4后5min，胰腺、肾脏和肝脏开始有摄取，在之后的60min，胰腺和肾脏的摄取继续增加，其他非靶器官快速清除。

8、专利申请号为202110305961.3，发明名称为“靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针及其制备方法”的中国发明专利公开了一种靶向胰高血糖素样肽-1受体的exendin-4放射性探针及其制备方法，放射性探针的标记时间为8min，标记产率>99％，radio-hplc测定产品放化纯>99％，产物表现出对胰高血糖素样肽-1受体的高亲和力和高特异性，同时具有较好的体内生物代谢性质，是较有潜力的胰高血糖素样肽-1受体pet显像剂。

9、综上，以exendin4为靶向基团、glp-1r为靶点的放射性探针既可用于bcm监测，实现糖尿病的早期诊断，又可用于胰岛素瘤显像定位，指导胰岛素瘤治疗，已受到大家的密切关注。

10、但是，目前已报道的探针，均存在胰岛β细胞特异性摄取较低、肾脏非特异性摄取过高和体内清除过快等问题，而胰腺临近肾脏，肾脏的高放射性摄取，会严重干扰显像结果，已成为该技术领域亟待解决的技术难题。

11、因此，以exendin4为靶向基团、glp-1r为靶点的放射性探针有很大的改进空间；提供一种具有改进结构的68ga标记的exendin 4放射性探针，标记反应条件温和、效率高，且具有更高的胰岛β细胞特异性摄取、胰岛素瘤摄取和靶/非靶比值，表现出对glp-1r的高亲和力和高特异性，同时具有较好的体内生物代谢性质和高胰腺放射性显像对比度，具有较高的靶器官摄取量和较长的血液循环时间，是性质优良的β细胞特异性显像探针，有潜力应用于糖尿病的早期诊断和胰岛素瘤的显像，就成为该技术领域亟需解决的技术难题。

技术实现思路

1、本发明的目的之一在于提供一种具有改进结构的68ga标记的exendin 4放射性探针，标记反应条件温和、效率高，且具有更高的胰岛β细胞特异性摄取、胰岛素瘤摄取和靶/非靶比值，表现出对glp-1r的高亲和力和高特异性，同时具有较好的体内生物代谢性质和高胰腺放射性显像对比度，具有较高的靶器官摄取量和较长的血液循环时间，是性质优良的β细胞特异性显像探针，有潜力应用于糖尿病的早期诊断和胰岛素瘤的显像。

2、本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

3、一种具有改进结构的68ga标记的exendin 4放射性探针，分别是[68ga]ga-c12-hbed-cc-mal-cys39-exendin-4、[68ga]ga-p-i-abm-hbed-cc-mal-cys39-exendin-4和[68ga]ga-p-me-abm-hbed-cc-mal-cys39-exendin-4，其结构式分别如下：

4、

5、本发明的另一目的在于提供上述具有改进结构的68ga标记的exendin 4放射性探针的制备方法。

6、本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

7、一种具有改进结构的68ga标记的exendin 4放射性探针的制备方法，其步骤如下：

8、(1)在碱和缩合剂的存在下，使双功能连接剂hbed-cc分别与调节基团和马来酰亚胺进行缩合反应；用酸脱去保护基团后，与cys39-exendin-4连接；

9、(2)将所得产物溶解在醋酸钠缓冲液中，加入[68ga]gacl3溶液，混合均匀，加热，得到具有改进结构的68ga标记的exendin 4放射性探针。

10、反应式如下：

11、

12、优选地，步骤(1)中，所述碱为n,n-二异丙基乙胺，加入量为3-5当量；所述缩合剂为2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯，加入量为1.2当量；所述调节基团为十二胺、4-(对碘苯基)丁酸或4-(对甲基苯基)丁酸。

13、优选地，步骤(1)中，所述酸为三氟乙酸，加入量为2毫升；所述cys39-exendin-4的多肽序列为：半胱氨酸-脯氨酸-脯氨酸-脯氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-亮氨酸-色氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-精氨酸-缬氨酸-丙氨酸-谷氨酸-谷氨酸-谷氨酸-蛋氨酸-谷氨酰胺-赖氨酸-丝氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-苏氨酸-甘氨酸-谷氨酸-甘氨酸-组氨酸。

14、优选地，具有改进结构的68ga标记的exendin 4放射性探针的具体制备步骤如下：

15、步骤1：具有改进结构的68ga标记的exendin 4放射性探针的标记前体的合成：

16、将化合物3,3’-(((2,2,13,13-四甲基-4,11-二氧-3,12-二氧杂-6,9-二氮四癸烷-6,9-二基)二(亚甲基))二(4-羟基-3,1-亚苯基))二丙酸，溶于超干n’n-二甲基甲酰胺中，冰浴条件下，向混合溶液中依次加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯、n,n-二异丙基乙胺，得混合溶液；将十二胺溶于超干n’n-二甲基甲酰胺，滴加至上述混合溶液中，室温反应(2-6小时)；向混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤有机相(两次)，再用饱和食盐水洗涤有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，除去固体杂质；利用减压旋蒸，除去有机溶液，将得到的黄色油状液体，用硅胶柱色谱纯化，得到粗产物，重新溶于超干n’n-二甲基甲酰胺中，依次加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯和n,n-二异丙基乙胺，得到混合溶液；将1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮三氟乙酸盐溶于超干n’n-二甲基甲酰胺，滴加至上述混合溶液中；室温反应(2-6小时)，向混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤有机相(两次)，再用饱和食盐水洗涤有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，除去固体杂质；利用减压旋蒸，除去有机溶液，用硅胶柱色谱纯化，得到无色油状化合物；将得到的无色油状化合物溶于三氟乙酸中，室温下搅拌(1小时)，加入二氯甲烷溶液，稀释，减压蒸馏，除去有机溶剂，用semi pre-hplc纯化，得到白色固体化合物，将白色固体化合物溶于磷酸盐缓冲溶液，冰浴条件下，加入cys39-exendin-4，室温搅拌，过夜，经semi pre-hplc纯化，得到白色固体化合物c12-hbed-cc-mal-cys39-exendin-4；

17、步骤2：具有改进结构的68ga标记的exendin 4放射性探针的标记

18、将步骤(1)制备的标记前体c12-hbed-cc-mal-cys39-exendin-4溶于醋酸钠缓冲液，得到标记前体的醋酸钠溶液；用高纯盐酸溶液淋洗锗镓发生器(ithembalaboratories，740mbq，20mci)，将所得[68ga]gacl3的盐酸溶液加入标记前体的醋酸钠溶液中，均匀混合，50℃反应(10min)，冷却至常温，用带放射性检测器的高效液相色谱(radio-hplc)测定其标记率，得到放射化学产率>98％的[68ga]ga-c12-hbed-cc-mal-cys39-exendin-4。

19、优选地，步骤2中，带放射性检测器的高效液相色谱的测试条件为：第一流动相为0.1％三氟乙酸水溶液(v/v)，第二流动相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液(v/v)，梯度洗脱条件为：0-10分钟，95％-0％的第一流动相；10-11分钟，5％-95％的第一流动相；11-15分钟，5％的第一流动相；流动相的流速为1毫升/分钟。

20、优选地，具有改进结构的68ga标记的exendin 4放射性探针的具体制备步骤如下：

21、步骤1：具有改进结构的68ga标记的exendin 4放射性探针的标记前体的合成：

22、将化合物3,3'-(((2,2,13,13-四甲基-4,11-二氧-3,12-二氧杂-6,9-二氮四癸烷-6,9-二基)二(亚甲基))二(4-羟基-3,1-亚苯基))二丙酸溶于超干n’n-二甲基甲酰胺中，冰浴条件下，向混合溶液中依次加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯、n,n-二异丙基乙胺，得混合溶液；将4-氨基丁基-4-碘苯基丁酰胺溶于超干n’n-二甲基甲酰胺，滴加至上述混合溶液中，室温反应(4h)；向混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤有机相(两次)，再用饱和食盐水洗涤有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，除去固体杂质；用减压旋蒸，除去有机溶液，将得到的黄色油状液体，用硅胶柱色谱纯化，得到粗产物，重新溶于超干n’n-二甲基甲酰胺中，依次加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯和n,n-二异丙基乙胺，得混合溶液；将1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮三氟乙酸盐溶于超干n’n-二甲基甲酰胺，滴加至上述混合溶液中，室温反应(4h)后，向混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤有机相(两次)，再用饱和食盐水洗涤有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，除去固体杂质；用减压旋蒸，除去有机溶液，用硅胶柱色谱纯化，得到无色油状化合物；将得到的无色油状化合物溶于三氟乙酸中，室温下搅拌(1h)，加入二氯甲烷溶液稀释，减压蒸馏，除去有机溶剂，利用semi pre-hplc纯化，得到白色固体化合物，将白色固体化合物溶于磷酸盐缓冲溶液，冰浴条件下，加入cys39-exendin-4，室温搅拌，过夜，经semi pre-hplc纯化，得到白色固体化合物p-i-abm-hbed-cc-mal-cys39-exendin-4；

23、步骤2：具有改进结构的68ga标记的exendin 4放射性探针的标记

24、将步骤(1)得到的标记前体p-i-abm-hbed-cc-mal-cys39-exendin-4溶于醋酸钠缓冲液，得到标记前体的醋酸钠溶液，用高纯盐酸溶液淋洗锗镓发生器(ithembalaboratories，740mbq，20mci)，将所得[68ga]gacl3的盐酸溶液加入标记前体的醋酸钠溶液中，均匀混合，50℃反应(10min)，冷却至常温，用带放射性检测器的高效液相色谱(radio-hplc)测定其标记率，得放射化学产率>98％的[68ga]ga-p-i-abm-hbed-cc-mal-cys39-exendin-4。

25、优选地，步骤2中，带放射性检测器的高效液相色谱的测试条件为：第一流动相为0.1％三氟乙酸水溶液(v/v)，第二流动相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液(v/v)，梯度洗脱条件为：0-10分钟，95％-0％的第一流动相；10-11分钟，5％-95％的第一流动相；11-15分钟，5％的第一流动相；流动相的流速为1毫升/分钟。

26、优选地，具有改进结构的68ga标记的exendin 4放射性探针的具体制备步骤如下：

27、步骤1：具有改进结构的68ga标记的exendin 4放射性探针的标记前体的合成：

28、将化合物3,3'-(((2,2,13,13-四甲基-4,11-二氧-3,12-二氧杂-6,9-二氮四癸烷-6,9-二基)二(亚甲基))二(4-羟基-3,1-亚苯基))二丙酸溶于超干n’n-二甲基甲酰胺中，冰浴条件下，得混合溶液，向混合溶液中依次加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯、n,n-二异丙基乙胺，得混合溶液；将n-(4-氨基丁基)-4-对甲苯基丁酰胺溶于超干n’n-二甲基甲酰胺，滴加至上述混合溶液中，室温反应(4h)，得混合物；向混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤有机相(两次)，再用饱和食盐水洗涤有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，除去固体杂质；用减压旋蒸，除去有机溶液，得到黄色油状液体，用硅胶柱色谱纯化，得到粗产物，重新溶于超干n’n-二甲基甲酰胺中，依次加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸酯和n,n-二异丙基乙胺，得混合溶液，将1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮三氟乙酸盐溶于超干n’n-二甲基甲酰胺，滴加至上述混合溶液中；室温反应(4h)后，向混合物中加入乙酸乙酯，用水洗涤有机相(两次)，再用饱和食盐水洗涤有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，除去固体杂质；用减压旋蒸，除去有机溶液，用硅胶柱色谱纯化，得到无色油状化合物；将得到的无色油状化合物溶于三氟乙酸中，室温下搅拌(1h)，加入二氯甲烷溶液稀释，减压蒸馏，除去有机溶剂，利用semi pre-hplc纯化，得到白色固体化合物，将白色固体化合物溶于磷酸盐缓冲溶液，冰浴条件下，加入cys39-exendin-4，室温搅拌，过夜，经semi pre-hplc纯化，得到白色固体化合物p-me-abm-hbed-cc-mal-cys39-exendin-4；

29、步骤2：具有改进结构的68ga标记的exendin 4放射性探针的标记

30、将步骤1制备的标记前体p-me-abm-hbed-cc-mal-cys39-exendin-4溶于醋酸钠缓冲液，得到标记前体的醋酸钠溶液，用高纯盐酸溶液淋洗锗镓发生器(ithembalaboratories，740mbq，20mci)，将所得[68ga]gacl3的盐酸溶液加入标记前体的醋酸钠溶液中，均匀混合，50℃反应(10min)，冷却至常温，用带放射性检测器的高效液相色谱(radio-hplc)测定其标记率，得放射化学产率>99％的[68ga]ga-p-me-abm-hbed-cc-mal-cys39-exendin-4。

31、优选地，步骤2中，带放射性检测器的高效液相色谱的测试条件为：第一流动相为0.1％三氟乙酸水溶液(v/v)，第二流动相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液(v/v)，梯度洗脱条件为：0-10分钟，95％-0％的第一流动相；10-11分钟，5％-95％的第一流动相；11-15分钟，5％的第一流动相；流动相的流速为1毫升/分钟。

32、有益效果：

33、本发明的具有改进结构的68ga标记的exendin 4放射性探针，表现出对胰高血糖素样肽-1受体蛋白的高亲和力和高特异性，具有较高的靶器官摄取量和较长的血液循环时间，是较有潜力的胰高血糖素样肽-1受体显像剂。

34、下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。