一种重组腺相关病毒及其应用

本发明属于生物医药领域，涉及一种载有c-rel特异性核糖核酸的重组腺相关病毒及其在抑制角膜移植排斥方面的应用。

背景技术：

1、角膜移植是治疗严重感染，化学伤等所致不可逆性角膜盲的唯一治疗手段，移植后排斥是角膜移植失败的主要原因。全球每年角膜移植数量数十万例，其排斥率高达50％以上，尤其是高危角膜移植。造成这一难题的关键在于角膜移植排斥免疫发生机制不明确。

2、临床应用免疫抑制剂是预防和治疗角膜移植免疫排斥最常见的方法，它的优点主要是易于操作和患者医从性较高。目前主要使用的免疫抑制剂是类固醇激素、糖皮质激素、环孢素a、他克莫司、霉酚酸酯、雷帕霉素和fty720等。但临床上使用的各类抗排斥药物防治疗效不佳,并且由于缺乏特异性，药物毒副作用较大，只能短期使用来控制急性炎症。

3、近年来抗体和融合蛋白免疫抑制剂因靶点明确和作用效果明显而受到了广泛的关注，已成功用于角膜移植免疫排斥防治的抗体和融合蛋白免疫抑制剂靶点主要包括il-2、cd25、tnf-α、ctla4-ig、il-10，tlr2，ccr7等。

技术实现思路

1、本发明的目的是减少角膜移植后的排斥反应，为临床预防和治疗角膜移植排斥提供新的手段和策略。

2、在第一方面，本发明提供了c-rel特异性核糖核酸在用于制备预防、抑制和/或治疗角膜移植排斥反应或并发症的药物的应用，其序列如sed id no.1、sed id no.2或sedid no.3、sed id no.4所示：

3、正义链5’caaccggacatacccgtct 3’(sed id no.1)

4、反义链5’agacgggtatgtccggttg 3’(sed id no.2)；

5、或

6、正义链5’caaccgaacatacccttct 3’(sed id no.3)

7、反义链5’agaagggtatgttcggttg 3’(sed id no.4)。

8、在第二方面，本发明提供了一种用于抑制c-rel基因的表达和/或抑制c-rel调控的炎症因子的表达重组腺相关病毒，其包含以c-rel为靶点的c-rel特异性核糖核酸或其功能等价物，所述c-rel特异性核糖核酸序列如sed id no.1、sed id no.2或sed id no.3、sed id no.4所示：

9、正义链5’caaccggacatacccgtct 3’(sed id no.1)

10、反义链5’agacgggtatgtccggttg 3’(sed id no.2)；

11、或

12、正义链5’caaccgaacatacccttct 3’(sed id no.3)

13、反义链5’agaagggtatgttcggttg 3’(sed id no.4)；

14、所述功能等价物与seq id no：1-4所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性；可选地为取代、缺失和/或插入一个或多个seq id no：1-4所示的核苷酸序列。

15、所述重组腺相关病毒的血清型包括aav2、aav4、aav 5、aav6、aav8及aav9。

16、在一个实施方案中，所述重组腺相关病毒的血清型为aav6，包装滴度为5×10e12～1×10e13vg/ml，可选地包装滴度为6×10e12～7×10e12vg/ml。

17、在第三方面，本发明还提供了用于预防、抑制和/或治疗角膜移植排斥的药用组合物，其特征在于，包含以c-rel为靶点的c-rel特异性核糖核酸或其功能等价物、药用可接受载体，还可以进一步包括药用可接受辅料；

18、所述以c-rel为靶点的c-rel特异性核糖核酸，其序列如sed id no.1、sed idno.2或sed id no.3、sed id no.4所示：

19、正义链5’caaccggacatacccgtct 3’(sed id no.1)

20、反义链5’agacgggtatgtccggttg 3’(sed id no.2)；

21、或

22、正义链5’caaccgaacatacccttct 3’(sed id no.3)

23、反义链5’agaagggtatgttcggttg 3’(sed id no.4)；

24、所述功能等价物与seq id no：1-4所示的序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性；

25、所述药用可接受载体包括质粒载体和/或病毒载体。

26、所述药用可接受辅料包括但不限于水、生理盐水、葡萄糖、免疫抑制剂(类固醇激素、糖皮质激素、环孢素a、他克莫司、霉酚酸酯、雷帕霉素和fty720等)、靶向c-rel的小分子化合物(己酮可可碱等)、多肽或sirna药物(il-2r单克隆抗体、抗cd25单克隆抗体、贝伐单抗、tnf-α单克隆抗体、cd154单克隆抗体、ctla4-ig等)。

27、作为本发明一个优选的实施方案，所述药用可接受载体为腺相关病毒。

28、在一个实施方案中，所述腺相关病毒的血清型为aav6,病毒包装滴度为5×10e12-1×10e13vg/ml；所述药用组合物的剂型为注射液，所述药用组合物通过结膜注射施用于眼部。

29、在第四方面，本发明提供了上述重组腺相关病毒、药用组合物在用于制备预防、抑制和治疗角膜移植排斥的药物中的应用。

30、在第五方面，本发明提供了上述重组腺相关病毒、药用组合物在用于制备抑制角膜移植后排斥患者细胞内c-rel基因的表达和/或c-rel调控的炎症因子的表达的药物中的应用。

31、在一个实施方案中，所述重组腺相关病毒、药用组合物在用于制备预防、抑制和治疗角膜移植排斥的药物中的应用，或在用于制备抑制角膜移植后排斥患者细胞内c-rel基因的表达和/或c-rel调控的炎症因子的表达的药物中的应用，包括施予角膜移植后排斥个体有效量的c-rel特异性核糖核酸从而抑制所述个体体内巨噬细胞、树突状细胞、淋巴细胞、单核细胞、cd4+t细胞中一种或多种细胞内c-rel基因的表达和/或抑制c-rel调控的炎症因子的表达的过程。

32、在一个实施方案中，所述c-rel调控的炎症因子包括tnf-α、il-1β、il-17a、ifn-γ、il-2、il-6中的一个或多个。

33、在第六方面，本发明提供了一种用于预防、抑制和/或治疗角膜移植后排斥反应的方法，其特征在于：施予角膜移植后个体有效量的所述c-rel特异性核糖核酸、或所述重组腺相关病毒、或所述药用组合物。

34、本发明说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一个”，“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。

35、本发明的术语例如“99％同一性程度”是指除了1％的核酸序列与所要求保护的c-rel特异性核糖核酸不同外，99％的核酸序列与所要求保护的c-rel特异性核糖核酸相同，并且与所要求保护的c-rel特异性核糖核酸具有99％同一性程度的c-rel特异性核糖核酸具有相同或相似的性质，均能实现本发明的技术效果。

36、在本发明中，术语“个体”或“患者”在此可互换地使用并且是指一种脊椎动物，优选一种哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。优选地，所述患者是人。这样的“个体”或“患者”典型地遭受或易于患有一种可以通过给予本发明的上述药物、药用组合来预防或治疗的病症，包括但不限于如下角膜移植排斥症状：突然流泪、眼红、眼内异物感、视物模糊、角膜植片水肿明显等；包括但不限于c-rel基因的表达增高、c-rel调控的炎症因子表达增高，例如tnf-α、il-1β、il-17a、ifn-γ、il-2、il-6中的一个或多个。

37、本发明中，术语“有效量”是指向“个体”或“患者”赋予治疗或抑制作用(例如，控制、缓解、改善、缓和或减缓进展)；或预防(例如，延迟发作或降低发展风险)疾病、病症或病状或其症状的上述药物、药用组合物。对此用途有效的量将取决于例如递送的途径、所采用的具体的活性物质或制剂的活性、角膜移植排斥的严重性、个体体重和总体健康状况、以及处方医师的判断。剂量的给予可以每周一次，或两天或每天一次，或甚至每天几次。可以在短期(例如数周至数月)或更长时间段(数月至数年)给予剂量单元。

38、有益效果

39、以c-rel为靶点防治角膜移植排斥具有以下明显优点：1)c-rel主要表达于活化的淋巴细胞和单核细胞，与靶向整个nf-κb家族相比，副作用小；2)靶向c-rel能抑制下游一系列炎症因子的表达，因而与仅以单一炎性因子为靶点的抗体药物相比，以c-rel为靶点能更有力切断先天性免疫与适应性免疫间的恶性炎症回路；3)c-rel基因敲除小鼠发育正常，说明以c-rel为靶点安全性较高。