葛根素在制备AMPK激动剂中的应用

葛根素在制备ampk激动剂中的应用
技术领域
1.本发明涉及制药领域，具体地说，是关于葛根素在制备ampk激动剂中的应用。


背景技术：

2.葛根素(puerarin)是从豆科植物野葛中提取出的单体异黄酮化合物，是一类含有皂苷类化合物，对肝组织免疫损害具有保护作用，可有效逆转化学诱导的肝纤维化，增强心肌收缩力，保护心肌细胞作用。可促进正常人和肿瘤病人的淋巴细胞转化率，增强自然素作用，还具有活血化瘀、改善微循环、扩张冠状动脉和脑血管、降低心肌耗氧量等作用。在心血管系统中，葛根中的总黄酮能增加脑及冠状动脉的血流量，葛根素对动物和人体的脑循环以及外周循环有明显的促进作用。葛根总黄酮在改善高血压及冠心病患者的脑血管张力、弹性和博动性供因等方面均有温和的促进作用。葛根素不仅改善人体的正常脑微循环，而且对微循环障碍也有明显的改善作用，主要表现为局部微血管血流和运动的幅度增加。葛根素对突发性耳聋患者的甲皱微循环也有改善作用，能加快微血管血流速度，清除血管袢淤血，提高患者的听力。
3.腺苷酸激活蛋白激酶(ampk)在细胞能量稳态调节中起到关键作用，可促进各种组织中atp的产生并抑制atp的消耗途径。ampk可作为异源三聚体复合体出现，内含一个催化性α亚单位和调节性β和γ亚单位。ampk激活可正向调节补充细胞atp供应的信号通路。例如，ampk的激活同时增强了glut4的转录和易位，导致胰岛素刺激的葡萄糖摄取增加。此外，它还通过抑制acc和激活pfk2来刺激分解代谢过程，例如脂肪酸氧化和糖酵解。同时，ampk还是脂代谢和糖代谢的主要调控分子，amp依赖的蛋白激酶(ampk)是生物能量代谢调节的关键分子，是研究糖尿病及其他代谢相关疾病的核心。在许多物种中，ampk可以通过与mtor和sirtuins相互作用作为衰老的重要调节物。由于它是脂质和葡萄糖代谢的中央调节剂，ampk被认为是治疗肥胖症，ii型糖尿病和癌症的关键治疗靶标。
4.中国专利cn109485675a，公开日2019.03.19，公开了一种葛根素衍生物及其制备方法以及应用，所述葛根素衍生物以葛根素以及l-丙氨酸异丙酯盐酸盐为主要原料，经六步反应制得，该葛根素衍生物不仅具有良好的水溶性，且具有良好的抗血小板聚集作用，可以用于制备抗血小板聚集的药物中。中国专利cn111084771a，公开日2020.05.01，公开了中药单体葛根素新药理作用，包括糖尿病、高脂血症、肥胖、甲状腺疾病在内的代谢性疾病导致的肌病、肌肉萎缩及肌肉骨骼并发症的预防、缓解和/或治疗作用。可将其用于预防、缓解和治疗糖尿病，高脂血症，肥胖，甲状腺疾病等相关代谢性疾病导致的肌肉萎缩、肌病、肌肉骨骼并发症。
5.而目前如本发明的天然化合物葛根素在制备ampk激动剂中的应用还未见报道。


技术实现要素：

6.本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种ampk激动剂。
7.本发明的第二个目的是，提供了葛根素作为ampk激动剂的用途。
8.本发明的第三个目的是，提供一种治疗代谢相关性疾病的药物组合物。
9.本发明的第四个目的是，提供一种药物组合物的用途
10.为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
11.一种ampk激动剂，由式(1)所示的葛根素制备而成
[0012][0013]
作为一个优选例，所述的葛根素无细胞毒性，并通过激活细胞ampk磷酸化水平发挥作用。
[0014]
作为一个优选例，所述的细胞为人肝癌细胞系hepg2、小鼠肝细胞系aml12、小鼠原代脂肪细胞。
[0015]
作为一个优选例，所述的葛根素浓度在大于1μm时可提升ampkα磷酸化水平，并具有剂量依赖型。
[0016]
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0017]
如上任一所述的ampk激动剂在制备治疗代谢相关性疾病药物中的应用。
[0018]
作为一例优选例，所述的代谢相关性疾病包括：肥胖、脂肪肝、糖尿病、动脉粥样硬化、高血压、血脂异常。
[0019]
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0020]
一种激活ampk的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以权利要求1中式(1)的葛根素及药物学上可接受的载体作为活性成分。
[0021]
作为一例优选例，所述药物组合物剂型为外用剂型或内用剂型。
[0022]
作为一例优选例，所述药物组合物的剂型包括贴剂、糊剂、凝胶剂、涂抹剂、巴布剂、片剂、口服液、注射剂、胶囊剂或颗粒剂。
[0023]
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
[0024]
如上所述的药物组合物在制备治疗抗代谢相关性疾病药物中的应用。
[0025]
本发明优点在于：
[0026]
1.本发明通过体外细胞实验发现，葛根素能够显著激活肝细胞hepg2和原代脂肪细胞中ampkα磷酸化水平，呈剂量依赖性，且无细胞毒性。
[0027]
2.本发明通过体内动物实验发现，葛根素能够显著降低高脂饮食诱导肥胖小鼠的体重、血脂、脂肪肝和血糖等指标。
[0028]
3.本发明使用中药提取物作为ampk激动剂，不仅原料丰富易得，价格便宜，易于制备，且副作用小，适合临床推广使用。
附图说明
[0029]
附图1为葛根素增加人肝癌细胞系hepg2ampkα磷酸化水平(western blot法)。
[0030]
附图2为葛根素增加小鼠原代脂肪细胞ampkα磷酸化水平(westernblot法)。
[0031]
附图3为葛根素对小鼠肝细胞aml12细胞活力的影响(cck8法)。
[0032]
附图4为葛根素治疗代谢相关性疾病小鼠形态学和体重统计图。ncd组与hfd组比较，
####
p《0.001，hfd组与葛根素治疗组比较，
****
p《0.001。
[0033]
附图5为葛根素治疗代谢相关性疾病小鼠腹股沟白色脂肪组织对比图。
[0034]
附图6为葛根素治疗代谢相关性疾病小鼠肝脏组织对比图。
[0035]
附图7为葛根素治疗代谢相关性疾病小鼠肝脏重量和肝脏脂质含量统计图。ncd组与hfd组比较，
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p《0.001，hfd组与葛根素治疗组比较，
****
p《0.001。
[0036]
附图8为葛根素治疗代谢相关性疾病小鼠空腹血糖统计图。
####
p《0.001，hfd组与葛根素治疗组比较，
****
p《0.001。
[0037]
附图9为葛根素激活代谢相关性疾病小鼠小鼠肝脏ampk(western blot法)。
具体实施方式
[0038]
本发明涉及的葛根素的分子式为c
21h20
o9(8-beta-d-葡萄吡喃糖-4',7-二羟基异黄酮)，分子量416.38，结构式如下所示：
[0039][0040]
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。本技术中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域的通用方法，在本发明的实施例公开的数据的基础上结合本领域的公知技术，经过有限次试验均能得到本发明的实验结果。
[0041]
实施例1葛根素激活肝细胞ampk
[0042]
1.实验材料
[0043]
人肝细胞系hepg2(购自上海中乔新舟生物科技有限公司)；葛根素(纯度大于99％，购自mce公司，hy-n0145)，以100mm的初始浓度溶于二甲基亚砜中，贮存在-80℃冰箱。胎牛血清(gibco)，dmem培养基(gibco)，离心管，6孔板，p-ampkα抗体(cst,#2535，1:2000)、ampkα抗体(cst,#2532，1:2000)、gapdh抗体(cst,#5174，1:5000)。
[0044]
2.实验方法
[0045]
2.1hepg2细胞培养
[0046]
人肝细胞系hepg2在含有10％胎牛血清，1％青霉素和链霉素的dmem培养基中培养，并置于37℃，5％co2的培养箱中，细胞融合度达到90％以上时进行传代。从10cm皿中吸出旧的培养基并丢弃，加入3ml 1xpbs清洗一次，向10cm皿中加入1ml含0.25％edta的胰酶后，将培养瓶放入培养箱消化3min，往皿中加入2ml新鲜培养基终止消化，将细胞按1:3的比例等分到新的10cm皿中，补充含血清培养基至10ml继续培养。
[0047]
2.2葛根素处理细胞
[0048]
hepg2细胞更换新鲜培养基，加入终浓度分别为1μm、10μm、20μm、50μm、100μm的葛
根素，对照组加入等量dmso，并继续培养24小时。
[0049]
2.3ampkα磷酸化水平检测
[0050]
采用westernblot法检测细胞中ampkα、ampkα磷酸化、gapdh表达水平。
[0051]
3.实验结果
[0052]
结果如图1所示，hepg2细胞经过1μm的葛根素处理后，胞内pampk水平显著增加，且随着剂量的增大而逐渐增加，ampk蛋白的表达无明显改变。表明葛根素能够显著增加hepg2细胞ampk磷酸化水平，激活ampk，且具有剂量依赖性。
[0053]
实施例2葛根素激活脂肪细胞ampk
[0054]
1.实验材料
[0055]
hanks缓冲液(购自北京碧云天生物公司)、胶原酶(sigma)、dmem/f12培养基(gibco)、葛根素(纯度大于99％，购自mce公司，hy-n0145)，以100mm的初始浓度溶于二甲基亚砜中，贮存在-80℃冰箱。胎牛血清(gibco)，dmem培养基(gibco)，离心管，6孔板，p-ampkα抗体(cst,#2535，1:2000)、ampkα抗体(cst,#2532，1:2000)、gapdh抗体(cst,#5174，1:5000)。
[0056]
2.实验方法
[0057]
2.1小鼠原代脂肪细胞分离培养
[0058]
颈椎脱臼法处死小鼠，切取腹股沟脂肪组织约10g。hanks液洗涤后，用无菌剪刀剪碎成约2mm
×
2mm的小块，加入消化液，置37℃摇床消化两小时。1000rpm离心5min，去除漂浮的脂肪细胞及培养液，沉积的细胞经150μm滤网滤掉组织碎片和纤维结缔组织。1000rpm离心5min去上清，hanks液洗涤并离心2次。沉淀的细胞用细胞dmem/f12培养基制成细胞悬液，调节浓度2
×
105/ml接种于6孔板中。并置于37℃，5％co2的培养箱中培养，12小时后细胞换液。
[0059]
2.2葛根素处理细胞
[0060]
小鼠原代脂肪细胞更换新鲜培养基，加入终浓度分别为1μm、10μm、20μm、50μm的葛根素，对照组加入等量dmso，并继续培养24小时。
[0061]
2.3ampkα磷酸化水平检测
[0062]
采用westernblot法检测细胞中ampkα、ampkα磷酸化、gapdh表达水平。
[0063]
3.实验结果
[0064]
结果如图2所示，小鼠原代脂肪细胞经过1μm的葛根素处理后，胞内pampk水平显著增加，20μm时达到最大值。同时ampk蛋白的表达无明显改变。表明葛根素能够显著增加小鼠原代脂肪细胞ampk磷酸化水平，激活ampk，且具有剂量依赖性。
[0065]
实验例3葛根素无细胞毒性
[0066]
1.实验材料
[0067]
小鼠肝细胞系aml12(购自上海中乔新舟生物科技有限公司)；葛根素(纯度大于99％，购自mce公司，hy-n0145)，以100mm的初始浓度溶于二甲基亚砜中，贮存在-80℃冰箱。胎牛血清(gibco)，dmem/f12培养基(gibco)，离心管，96孔板，cellcountingkit-8(购自苏州科尤博生物科技有限公司)。
[0068]
2.实验方法
[0069]
2.1aml12细胞培养
[0070]
aml12细胞在含有10％胎牛血清，1％青霉素和链霉素的dmem/f12培养基中培养，并置于37℃，5％co2的培养箱中，细胞融合度达到90％以上时进行传代。
[0071]
2.2葛根素处理细胞
[0072]
收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度为5x103个/孔种入96孔板，每孔加入100μl培养基。培养24h使细胞贴壁。更换培养液后浓度梯度组分别加入0μm、1μm、10μm、20μm、50μm、100μm浓度的葛根素分别处理细胞48h，同时设立对照组，每组设置6个复孔。
[0073]
2.3细胞活力检测
[0074]
处理结束后，取出96孔板，每孔加入10μlcck-8试剂，继续培养1小时。取出后用酶标仪在450nm处测量各孔的吸光度值(od值)。以0h的od值为1，分别计算其余时间节点的相对活力，根据细胞相对活力评价细胞增殖能力。
[0075]
细胞活力计算公式：细胞活力改变倍数＝第n天od值/第0天od值。该实验重复三次。
[0076]
3.实验结果
[0077]
如图3所示，各浓度葛根素下aml12细胞活力无显著差异，表明葛根素对aml12细胞活力无影响。
[0078]
实验例4葛根素改善代谢相关性疾病的动物实验
[0079]
1.实验材料和方法
[0080]
1.1实验动物和药物
[0081]
雄性c57bl/6小鼠，体重20～25g，6周龄，购自杰斯捷公司；高脂饲料购自戴茨生物科技公司，hfd饲料热量提供百分比为脂肪60％，蛋白质20％，碳水化合物20％；葛根素(纯度大于98％)购自大连美伦生物科技有限公司。1.2代谢相关性疾病模型的建立
[0082]
采用高脂饮食(hfd)喂养小鼠建立代谢相关性疾病模型，小鼠喂食hfd12周将自然进展为代谢相关性疾病，表现为肥胖、脂肪肝、高血糖、高血脂等。购买小鼠经适应性喂养7天后，随机分为正常饲养(ncd)组10只、高脂饲料(hfd)组10只、高脂饲料+葛根素(hfd+puerarin)组10只，每组每天喂食40ghfd饲料12周诱导代谢相关性疾病后，葛根素(100mg/kg)灌胃给药4周。同时以等体积的生理盐水灌胃ncd组、hfd组。取材前过夜禁食但不禁水，取材当日以1％戊巴比妥钠、50mg/kg、体积50μl/10g腹腔注射麻醉小鼠并称重，待小鼠充分麻醉后，小鼠眼球取血，收集全血，室温放置半小时，3000rpm离心15min，收集的血清-80℃下保存。取血后小鼠脱颈处死，于正中线逐层剪开胸壁，取出肝脏后称重。将左肝叶平均分为两块，各放入4％多聚甲醛中固定，剩余肝脏放入ep管中液氮冷冻保存备用。将小鼠腹股沟处两条长条状白色脂肪组织取出，分别放入4％多聚甲醛和ep管中液氮保存备用。
[0083]
1.3体重和肝重的测量
[0084]
取材前过夜禁食但不禁水，取材当日以1％戊巴比妥钠麻醉小鼠并称重。小鼠脱颈处死，于正中线逐层剪开胸壁，取出肝脏后称重。
[0085]
1.4甘油三酯和血糖检测
[0086]
使用日立全自动生化分析仪测定小鼠肝脏脂肪堆积相关指标。取材前，鼠尾采血并使用血糖仪检测小鼠空腹血糖。
[0087]
2统计学分析
[0088]
数据统计结果采用平均值
±
sd表示。使用双尾未配对t检验评估两组定量数据之
间的显著性，以p《0.05作为统计学显著性的依据。
[0089]
3.实验结果
[0090]
3.1葛根素对体重的影响
[0091]
如图4所示，与ncd对照组相比，hfd模型组小鼠体重显著增加。与hfd组相比，葛根素治疗组体重显著下降，几乎恢复到正常水平。结果表明，葛根素能够显著降低肥胖小鼠体重。
[0092]
3.2葛根素对白色脂肪的影响
[0093]
如图5所示，与ncd对照组相比，hfd模型组小鼠腹股沟白色脂肪组织显著增加。与hfd组相比，葛根素治疗组腹股沟白色脂肪组织显著缩小。结果表明，葛根素能够显著降低肥胖小鼠白色脂肪含量。
[0094]
3.3葛根素对肝脏脂肪变性的影响
[0095]
如图6和图7所示，与ncd对照组相比，hfd模型组小鼠肝脏组织发生明显的脂肪浸润，肝脏重量和脂肪含量显著增加。与hfd组相比，葛根素治疗后肝脏重量和脂肪含量显著降低。结果表明，葛根素有明显的脂肪肝治疗效果。
[0096]
3.4葛根素对血糖的影响
[0097]
如图8所示，与ncd对照组相比，hfd模型组小鼠血糖显著增加。与hfd组相比，葛根素治疗组血糖显著降低。结果表明，葛根素有显著的降血糖效果。
[0098]
3.5葛根素对肝脏ampk磷酸化水平的影响
[0099]
如图9所示，与ncd对照组相比，hfd模型组小鼠肝脏组织ampk磷酸化水平显著降低。与hfd组相比，葛根素治疗组肝脏组织ampk磷酸化水平显著增加。结果表明，葛根素能够在体内激活ampk。
[0100]
综上所述，葛根素作为一种天然ampk激动剂，能够在体内、体外激活细胞ampk，且对代谢相关性疾病包括肥胖、脂肪肝、高血糖、高血脂有显著的治疗效果，可用于制备治疗代谢相关性疾病的药物。
[0101]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。