一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶及其制备方法和应用

本发明涉及一种生物凝胶，具体涉及一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、生理条件下，循环系统为机体提供充足的氧气和营养物质，而病理条件下，提供足够的营养物质会产生相反的效果。组织损伤的炎症条件下，m1型炎症巨噬细胞功能高度活跃，有氧糖酵解速率显著上调。同时，炎症细胞对葡萄糖的摄取量显著增加，以维持细胞高活性状态，产生慢性的非可控的炎症反应。过度的炎症造成组织损伤炎症免疫失衡，从而阻碍组织修复。

2、细胞外基质是免疫微环境中非常重要的非细胞成分，为免疫细胞提供结构基础和生化支持。作为一种有效的大规模传输介质，天然的细胞外基质对于维持足够的三磷酸腺苷和生物合成中间体以满足高活性免疫细胞的能量和物质需求至关重要。细胞外基质微环境的重塑可引起代谢改变，例如，从细胞外基质中分离出的细胞由于葡萄糖转运蛋白的丢失而导致腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,atp)缺乏。改造和构建细胞外基质，可能可以实现“无药物”的炎症环境抑制，从而促进组织再生。

3、目前，细胞外基质改造用于组织再生仍然是一大难题，特别是自体来源材料改造细胞外基质。申请号为cn201810343820.9的发明专利公布了一种组装型细胞衍生细胞外基质膜复合骨修复材料及其制备方法和应用，复合骨修复材料是由片状脱细胞基质膜在无菌条件下将三维可降解生物支架完全包覆后制备得到，其实现了可降解吸收的生物支架的制备，但是过程复杂，细胞培养周期过长，并在脱细胞过程中引入了外源性物质，存在生物安全隐患，且不具有炎症调控特性。申请号为cn201810956245.x的发明专利公布了一种高效修复痘印的美容凝胶及制备方法，将多种成分进行捏合，制得高效修复痘印的美容凝胶，具有即时制备的优点，但是含有大量外源性成分，生物安全性低，且不具有炎症调控特性。因此，需要一种自体来源成分、制备便捷的生物凝胶，用于组织损伤的炎症调控，促进组织修复再生。

4、出血期间，血小板和纤维蛋白原被凝血酶激活形成凝胶状凝块。这种在损伤过程中自发形成的天然的细胞外基质是组织修复的关键部分。血小板在组织愈合和血管再生中起重要作用，但血小板作为促炎细胞可能通过活化后释放炎症因子而加重炎症，进一步使炎症免疫失衡，而纳米化的血小板具有血小板样功能，激活后不会显著释放促炎因子。因此，需要一种搭载纳米血小板囊泡的天然来源的生物凝胶。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶及其制备方法和应用。所述凝胶基于饥饿疗法调控促炎细胞的炎症反应，并通过纳米血小板促进组织再生，从而促进损伤组织修复。

2、为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶，该凝胶由纳米血小板、纤维蛋白原和凝血酶自然活化后形成。

4、所述的纳米血小板指自体血小板成分经纳米化处理得到的囊泡，其保留血小板的成分和结构完整；所述的纤维蛋白原指来源于自体血浆的纤维蛋白原；所述的凝血酶指产品化凝血酶。

5、本发明还提供一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的制备方法。包括以下步骤：

6、获取外周血，分离并富集血小板，进行挤出纳米化，加入纤维蛋白原，并加入凝血酶，活化后得到生物凝胶。

7、上述技术方案中，分离并富集血小板的方式包括机器单采法、两步离心法和密度梯度离心法，优选的，两步离心法，由以下方式进行：

8、将外周血上下颠倒混匀，置于离心管，300×g，离心10分钟。小心吸取上层含血小板血浆，转移至新的离心管中，800×g，离心6分钟。吸取一定量体积的上清，将下层血浆和沉淀轻柔地吹打混匀，即获得富血小板血浆。

9、进一步的，上述“一定量体积的上清”的体积占比为1/2至9/10，优选的，取4/5体积的上清，以提高最终血小板浓度。

10、上述技术方案中，纳米化的方式包括挤出法、超声法、冻融法，优选的，挤出法，由以下方式进行：

11、将富集血小板依次通过400nm、200nm和100nm孔径的挤出膜匀速反复挤出。

12、进一步的，上述挤出膜包括pc、pe、pes、pvdf膜，优选的，采用pes膜。

13、上述技术方案中，加入纤维蛋白原的方式为将上述“一定量体积的上清”加回纳米化血小板，并调节纳米血小板浓度至原始外周血浓度的1-4倍，优选的，将倍率设定为1.5倍。

14、上述技术方案中，加入凝血酶的方式为按体积比10％至100％加入50-500u/ml的凝血酶生理盐水溶液，优选的，体积比设定为10％，凝血酶浓度为200u/ml。

15、本发明还提供一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的应用。应用内容如下：

16、将搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶，或包载特定药物，用于通过饥饿疗法抑制炎症，通过纳米血小板促进再生，从而促进组织修复。

17、进一步的，上述特定药物包括抗生素及抗肿瘤药物。优选的，抗生素为万古霉素，抗肿瘤药物为阿霉素。

18、进一步的，上述组织修复包括骨科、肌肉、皮肤、脏器等修复，优选的，用于糖尿病足、关节炎、骨感染等难愈合性组织损伤，更优选的，用于糖尿病足溃疡。

19、本发明的有益效果：

20、1)本发明提供的搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶，其搭载的血小板实现纳米化，保留了血小板的成分和结构完整性。

21、2)本发明提供的搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶，其有效实现了炎症细胞的营养物质阻断的饥饿疗法。

22、3)本发明提供的搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶，其通过纳米血小板有效促进了组织修复。

23、4)本发明提供的搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶，其已进入临床应用，有效实现了难愈合性组织损伤的创面修复。

技术特征：

1.一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶，其特征在于：该凝胶由纳米血小板、纤维蛋白原和凝血酶自然活化后形成。

2.根据权利要求1所述的一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的制备方法，其特征在于：所述的分离并富集血小板的方式包括机器单采法、两步离心法和密度梯度离心法。

4.根据权利要求3所述的一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的制备方法，其特征在于：所述的两步离心法，由以下方式进行：

5.根据权利要求4所述的一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的制备方法，其特征在于：所述的吸取的部分体积的上清，其中吸取的体积占比为1/2至9/10。

6.根据权利要求4或5所述的一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的制备方法，其特征在于：取4/5体积的上清，以提高最终血小板浓度。

7.根据权利要求2所述的一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的制备方法，其特征在于：所述的纳米化的方式为挤出法、超声法、冻融法中的一种。

8.根据权利要求2所述的一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的制备方法，其特征在于：所述的纳米化的方式为挤出法，由以下方式进行：

9.根据权利要求2所述的一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的制备方法，其特征在于：所述的挤出膜包括pc、pe、pes、pvdf膜。

10.根据权利要求8或9所述的一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的制备方法，其特征在于：所述的挤出膜为pes膜。

11.根据权利要求2所述的一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的制备方法，其特征在于：加入纤维蛋白原的方式为将外周血分离后的部分上清加回纳米化血小板，并调节纳米血小板浓度至原始外周血浓度的1-4倍。

12.根据权利要求11所述的一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的制备方法，其特征在于：调节纳米血小板浓度至原始外周血浓度的1.5倍。

13.根据权利要求2所述的一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的制备方法，其特征在于：加入凝血酶的方式为按体积比10％至100％加入50-500u/ml的凝血酶生理盐水溶液。

14.根据权利要求13所述的一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的制备方法，其特征在于：加入凝血酶的方式为按体积比10％加入200u/ml的凝血酶生理盐水溶液。

15.一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的应用，其特征在于：将搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶，或包载药物，用于通过饥饿疗法抑制炎症，通过纳米血小板促进再生，从而促进组织修复。

16.根据权利要求15所述的一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的应用，其特征在于：所述的药物包括抗生素及抗肿瘤药物。

17.根据权利要求16所述的一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的应用，其特征在于：所述的抗生素为万古霉素，抗肿瘤药物为阿霉素。

18.根据权利要求15所述的一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的应用，其特征在于：所述的组织修复包括骨科、肌肉、皮肤、脏器的修复。

19.根据权利要求15所述的一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶的应用，其特征在于：所述的组织修复用于糖尿病足、关节炎、骨感染。

技术总结
本发明公开了一种搭载纳米血小板囊泡的生物凝胶及其制备方法和应用。该凝胶由纳米血小板、纤维蛋白原和凝血酶自然活化后形成；所述凝胶基于营养物质的选择性渗透，实现促炎细胞的饥饿疗法，并通过纳米血小板促进修复再生，并已进入临床应用，为天然来源生物材料的制备、应用和临床转化提供新策略。

技术研发人员：林贤丰,陈鹏飞,顾辰辉
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13