一种具有协同抗感染功能的中药活性成分组合物及其用途

1.本发明涉及中医药领域，具体涉及一种具有协同抗感染功能的中药活性成分组合物及其用途。


背景技术：

2.全身炎症反应综合征（systemic inflammatory responsesyndrome,sirs）是由感染或非感染病因所引起的机体失控的自我持续放大和自我破坏的全身性炎症反应。严重时可引起多器官功能障碍综合征（mods）等并发症。其中，由感染因素导致的sirs称为脓毒症（sepsis）。脓毒症的病情凶险，病死率高，全球每天约14000人死于其并发症，美国每年约21.5万人死亡。据国外流行病学调查显示，脓毒症的病死率已经超过心肌梗死，成为重症监护病房内非心脏病人死亡的主要原因。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，脓毒症的病死率仍高达30%～70%。
3.感染早期，侵入机体的病原微生物及其毒素从局部进入机体循环，激活宿主免疫系统，激活内皮细胞，导致炎性因子大量释放，引起细胞因子风暴。同时过度的活性氧和活性氮产生，引起氧化应激，组织因子表达、形成微血栓，不可控的炎症反应进一步引起免疫麻痹、细胞损伤、细胞器功能障碍，导致内皮完整性被破坏，通透性升高，凝血功能紊乱，微循环障碍，进而引起多器官功能障碍、多器官衰竭，最终导致宿主死亡。
4.内毒素是革兰氏阴性菌生长时释放或死亡时由细胞壁裂解产生的一类脂多糖物质（lps），具有多种毒性作用。lps分子由o-特异性多糖链、核心多糖和lipid a三个明确的区域组成。内毒素的生物学效应主要靠类脂a部分。内毒素血症是由革兰阴性菌所产生的内毒素入血所致的以发热为主要特征的综合征，内毒素血症是内、外科危重患者常见的并发症，常导致脓毒症和多器官功能障碍综合征。
5.脓毒症的发病机制是一个复杂的、多通路、多环节参与的过程，早期研究集中在抑制脓毒症期间的全身炎症反应综合征上，近期研究发现，多器官功能障碍和多器官衰竭是引起脓毒症患者死亡的重要原因，且全身炎症反应综合征与器官损伤并无确定的时间先后关系，因此，单纯的抑制过度炎症反应，或许并不能降低脓毒症患者的死亡率，炎症因子抑制剂在临床应用的失败也验证了这一点。因此，如何在抑制过度炎症反应、氧化应激的同时，改善器官损伤，恢复机体免疫系统功能是未来研究治疗脓毒症药物的重要方向。
6.对于脓毒症的治疗，现代医学采用抗感染治疗、抗凝治疗、血管活性药物治疗等多种方式。此外，抗生素的大量使用，虽然一定程度上降低了脓毒症患者的死亡率，但细菌耐药性的增加，给后续治疗带来了巨大的压力。中草药具有抗菌、抗病毒、调节免疫、副作用低等特点，而且其来源广泛、价格低廉，在治疗脓毒症方面具有悠久的历史，积累了丰富的验方，并显示出一定的临床效果。越来越多的药学工作者认为，用中药预防和治疗脓毒症是今后重要的一个研究方向。
7.因此，寻找健康有效治疗内毒素血症或脓毒症、全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征的方法具有重要意义。同时，市场也迫切需要一种无毒、能被生物体完全吸收
的、减轻患者的身心负担以及能有效治疗内毒素血症或脓毒症、全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征的药物制剂。


技术实现要素：

8.为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供一种治疗内毒素血症或脓毒症、全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征的中药活性成分组合物。本发明提供中药活性成分组合物具有抗毒血症功效，其组成的中药活性成分可通过调节多条脓毒症相关通路，参与防治脓毒症及脓毒症诱导的器官功能障碍中的过度炎症反应、氧化应激、免疫紊乱、细胞死亡和内皮通透性增加，极大程度上清除炎症介质，促进损伤细胞的保护与修复，提高机体的免疫功能从而抑制全身炎症反应、减少各种并发症的发生、明显改善患者的症状、极大缩短治疗时间。疗效确切、副作用少，能起到标本兼治的效果，并且其制备方法适合工业化生产等优点，便于开发应用。
9.所述的中药活性组合物在制备治疗内毒素血症或脓毒症、全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征的药物的应用。
10.所述的药物，其包含中药活性成分及任何一种或多种药学可接受的载体。
11.所述的药物，其可以根据需要被制成任何一种药学可接受的剂型。
12.现有技术相比，本发明的有益效果如下。
13.本发明提供的中药活性成分组合物具有抗毒血症功效，对治疗内毒素血症或脓毒症、全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征有显著疗效。使用本发明的中药活性成分组合物治疗后患者康复后不易复发，用药时临床表现无其他毒副作用。本发明提供的中药活性成分组合物活性组分组成分简单，抗脓毒症功效强，能够很好的抑制炎症因子释放，保护脏器损伤，降低脓毒症炎症级联反应，发挥抗脓毒症的作用。
附图说明
14.图1是活性组分在不同浓度（8
µ
g/ml，40
µ
g/ml，100
µ
g/ml）下对炎性因子及蛋白表达的影响。
15.图2是活性组分在不同浓度（8
µ
g/ml，40
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g/ml，100
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g/ml）下对炎性因子及蛋白表达的影响。
16.图3是活性组分在不同浓度（8
µ
g/ml，40
µ
g/ml，100
µ
g/ml）下对炎性因子及蛋白表达的影响。
17.图4是活性组分在不同浓度（8
µ
g/ml，40
µ
g/ml，100
µ
g/ml）下对炎性因子及蛋白表达的影响。
18.图5是t-pcr技术用于检测il-1β，tnf-α，inos，il-6和cox-2 mrna的表达水平。
19.图6是 western blot用于分析tlr4，myd88，nf-κbp65，nf-κbp-p65和inos的蛋白表达水平。
20.图7是各组大鼠脏器组织病理研究。
具体实施方式
21.下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
22.实施例1一种治疗内毒素血症或脓毒症、全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征的制备方法。
23.一种中药活性成分组合物，是由以下的中药活性成分组成：栀子苷、黄芩苷、小檗碱和巴马汀。
24.所述中药活性成分组合物的制备方法，包括如下步骤：黄连解毒汤按黄连：黄芩：黄柏：栀子= 3:2:2:3的比例称取总重量为1kg的药材，粉碎，水煎煮回流提取两次（第一次10倍量水，第二次8倍量水），每次1h，趁热过滤，合并两次滤液，静置，沉降3d后，离心（4200 r/min，30min），将离心得到的上清液合并，减压浓缩，得浓度为0.25g/ml上清液部位群；将沉淀部分干燥，得沉淀部位群。
25.ab-8大孔树脂用95%醇浸泡4h，95%醇装柱，用蒸馏水冲至无醇味后，以浓度为0.25g/ml上清液部位群上样，以2ml/min的流速通过树脂柱，反复上样，至药液面高出树脂面2cm后，吸附12h，以50%乙醇为流动相洗脱树脂柱，洗脱液颜色浅至无色，收集洗脱液，减压浓缩，回收溶剂，得到上清液醇洗部位群。称取一定量的聚酰胺，加入适量95%醇，82℃回流30min，放凉后甩干聚酰胺，反复3次，水浴使聚酰胺挥至无醇味，取处理过的聚酰胺加蒸馏水至1l，溶胀后，装柱，沉降12h，采用干法上样，将沉淀样品与聚酰胺拌样后，均匀撒到聚酰胺柱色谱中，以蒸馏水洗脱聚酰胺柱色谱，洗脱液颜色浅至无色，收集洗脱液，浓缩，得到沉淀水洗部位群。以50%醇为洗脱液，洗脱液颜色浅至无色，收集洗脱液，减压浓缩，回收溶剂，得到沉淀醇洗部位群。
26.称取300g柱色谱硅胶（200-300目），二氯甲烷溶胀后，以二氯甲烷装柱，沉降12h，将上清液醇洗样品与硅胶拌样后，均匀撒到硅胶柱中，依次以二氯甲烷-甲醇25:1（硅胶a组分）；二氯甲烷-甲醇10:1（硅胶b组分）；二氯甲烷-甲醇5:1（硅胶c组分）；二氯甲烷-甲醇2:1（硅胶d组分）洗脱硅胶柱，将得到的硅胶b组分与柱色谱硅胶（100目-200目）拌样，将石油醚-甲醇（8:1）洗脱的液体合并，反复过硅胶柱色谱，使化合物分离，然后结合理化性质和波谱解析，确定得到的化合物中存在栀子苷。
27.将沉淀水洗部位群10g与柱色谱硅胶15g（100目-200目）拌样，采用二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱硅胶柱，薄层色谱刮板，重结晶，使化合物分离，然后结合理化性质和波谱解析，确定得到的化合物中存在小檗碱与巴马汀。
28.将沉淀醇洗部位群10g与柱色谱硅胶15g（100目-200目）拌样，采用二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱硅胶柱，薄层色谱刮板，重结晶，使化合物分离，然后结合理化性质和波谱解析，确定得到的化合物中存在黄芩苷。
29.实施例2 药效学研究资料。
30.1、体外活性研究。
31.从-80℃的冰箱中取出将raw264.7细胞，37℃水浴锅对细胞进行复苏。离心收集细胞，室温离心5min，弃上清。用含10%胎牛血清的完全培养基悬浮细胞，接种到培养皿中，37℃ 5% co2条件下培养。待细胞的密度达到80%时，弃去培养基，pbs清洗，加 0.25%胰蛋白酶1-2ml消化细胞1-2min，显微镜下观察。弃去胰酶，加入完全培养基，按1:4的比例传代，37℃、5% co2饱和湿度条件下扩大培养。取处于对数生长期，生长状态良好的raw264.7细胞，以1.0
×
105cells/孔的细胞密度接种于24孔板， 37℃培养过夜。实验分为空白组，对照组和不同浓度活性成分干预组（小檗碱、巴马汀、黄芩苷和栀子苷四个化合物），加入不同浓度
有效组分干预2h，然后按分组加入lps（100ng/ml）共同培养24h，收集细胞上清。对照组不加任何试剂，lps组不加任何药品，药物处理组均设低、中、高（浓度分别为8、40、100 mg/ml）三个浓度梯度，继续培养1h。药物处理组和lps组加入浓度为100ng
·
ml-1的lps，置37℃、5% co2培养箱继续培养14h后，取上清采用elisa试剂盒测定raw264.7细胞上清液tnf-α、il-6、no、il-1β炎症因子的水平。
32.2、体内活性研究。
33.通过的体外活性研究，体外活性很好的化合物小檗碱、巴马汀、黄芩苷和栀子苷四个化合物进行组合，组合的比例依据四个化合物栀子苷：黄芩苷：小檗碱：巴马汀=4.2：3.4：2：1进行有机的整合后进行体内活性研究。
34.称取黄连解毒汤固体0.80g溶于20ml的0.5%cmc-na中，黄连解毒汤全方给药量按390mg/kg计算。称取黄芩苷23.54mg、巴马汀6.92mg、小檗碱13.84mg、栀子苷29.08mg，混合后溶于20ml的0.5%cmc-na中，给药量按36.69mg/kg计算。spf sd大鼠40只，体重为180-220g，随机分为四组分别为空白组、模型组、黄连解毒汤全方组、活性组分组合组，每组10只。实验时除空白组外，对其他的三组大鼠腹腔注射lps建立脓毒症模型（lps剂量为22mg/kg），造模6h后，黄连解毒汤组与单体组定量组灌胃给予相应的药物，空白组给予不含药物的0.5%cmc-na溶液。
35.给药24h后，水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，离心15min，取血清，elisa法检测大鼠血清tnf-α、il-6、no、il-1β炎症因子水平。取采集的血浆样品，依次加入生物素标记的二抗和酶标试剂，37℃反应60min, 洗板5次，加入显色液a、b，37℃显色15min，加入终止液，10min内测od值，根据标准曲线方程计算tnf-α、il-6、no、il-1β炎症因子水平。取心、肝、脾、肺、肾组织于10%的甲醛溶液中固定，取约1cm3小块组织，梯度酒精脱水，即浓度从50%
→
70%
→
80%
→
95%
ⅰ→
95%
ⅱ→
纯酒精
ⅰ→
纯酒精ⅱ，每一级酒精脱水时间约为30min；二甲苯ⅰ、ⅱ透明各20min后，浸蜡与包埋；用石蜡切片机切片，组织切片厚度为5微米；载片浸入二甲苯ⅰ20min，洗去石蜡，载片浸入二甲苯ⅱ10min，无水酒精5min，洗去二甲苯，无水酒精ⅱ5min，按顺序入95%、80%、70%、50%酒精中各5min ，使之逐步下行到水；进入苏木精溶液染色30min，自来水洗去浮色，1%盐酸酒精分色，自来水冲洗半小时以上，0.5%-1%伊红溶液复染1-10min，按顺序经95%酒精ⅰ、ⅱ中脱水兼分化伊红颜色各1min，入无水酒精中彻底脱水4-5min (ⅰ、ⅱ各2min)；先入二甲苯ⅰ1min ，再入二甲苯ⅱ彻底透明5min；用中性树胶封固，在载玻片上加1-2滴树胶，加盖玻片封固，显微镜观察组织形态。
36.3.数据处理。
37.实验结果的统计学处理：计量资料以均数
±
标准差表示，所有数据应用spss统计软件进行统计分析，多组均数间的比较采用单因素方差分析，p《0.05为差异有统计学意义。
38.4.结果。
39.（1）体外活性研究结果。
40.elisa法用于检测no，tnf-α，il-6和il-1β的表达水平，如图1-4所示，与空白组相比，lps组的no，il-1β，il-6和tnf-α分泌量明显升高（所有p 《0.01），将黄芩苷，巴马汀，小檗碱，或栀子苷分别加入经lps处理过的细胞，其结果显示：与lps组相比，它们可以显著抑制no，il-1β，il-6和tnf-α的表达（p 《0.01），8μg/ ml的巴马汀可抑制il-6的表达（p 《0.05），8μg/ ml的栀子苷对lps组no和il-6的表达无影响（p》 0.05）。rt-pcr技术用于检测
il-1β，tnf-α，inos，il-6和cox-2 mrna的表达水平。与空白组相比，lps组显示出高水平的inos，il-1β，il-6，tnf-α和cox-2 mrna表达（所有p 《0.01），用lps和黄芩苷，巴马汀，小檗碱，或栀子苷分别处理细胞后，inos，il-1β，il-6，tnf-α和cox-2 mrna的表达水平明显低于lps组（均p 《0.01），如图5所示。western blot用于分析tlr4，myd88，nf-κbp65，nf-κbp-p65和inos的蛋白表达水平。结果表明，lps组的tlr4，myd88，p65，p-p65和inos表达水平均高于对照组（所有p 《0.01），用黄芩苷，巴马汀，小檗碱，或栀子苷处理细胞时，tlr4，myd88，p65，p-p65和inos的表达水平均低于lps组（所有p 《0.01）如图6所示。
41.（2）活性成分的体内活性研究结果。
42.组分组合和全方干预下对大鼠体血清细胞因子检测和死亡抑制率的影响见表1。从表1 中可以看出，体内活性实验模型组表明空白组与模型组相比具有显著性差异（p《0.01），说明实验中成功建立脓毒症大鼠模型；黄连解毒汤全方和活性组分组合组与模型组相比均具有显著性差异（p《0.01），表明黄连解毒汤全方和活性组分组合组具有较好的治疗脓毒症的功效，并且两组治疗脓毒症的功效相接近，活性组分组能够显著降低脓毒症的死亡率，呈现很好的抑制炎性因子释放活性。
43.表1组分组合和全方干预下对大鼠体血清细胞因子检测和死亡抑制率的影响。
44.从图7中可以看出黄连解毒汤全方和活性组分组合组能够对心、肝、肺、肾和肠脏器组织具有较好的保护作用，起到降低脓毒症脏器损伤的功效，尤其活性组分组方成分简单，药效较强改善脓毒症脏器损伤的作用。
45.从体内外活性研究表明，活性组分组成分简单，抗脓毒症功效强，能够很好的抑制炎症因子释放，保护脏器损伤，降低脓毒症炎症级联反应，发挥抗脓毒症的作用。