BCLX基因反义寡核苷酸在制备脑胶质瘤放疗增敏试剂中的应用

本发明属于生物医药领域，涉及一种用于脑胶质瘤放射治疗增敏的剪接调控反义寡核苷酸，具体涉及调控bclx基因选择性剪接的反义寡核苷酸在制备脑胶质瘤放疗增敏试剂中的应用。

背景技术：

1、胶质母细胞瘤(gbm)是起源于中枢神经系统的最常见和最致命的实体肿瘤之一，中位生存期不到12个月，占所有中枢神经系统恶性肿瘤的80.8％，其发病率排在颅内肿瘤的第一位。gbm具有非常高的侵袭性，且由于其较强的抗药性和辐射耐受，导致预后较差，患者在接受治疗后会很快复发，目前的治疗方法只能起到缓和作用。

2、放射治疗(放疗)是指通过致电离辐射射线的促电子电离作用使生物体产生直接和间接的dna损伤，最终引起肿瘤靶区细胞死亡。目前，放射治疗已经是去除术后残留gbm肿瘤组织的主要辅助治疗，并被用作标准治疗方法。然而，尽管许多gbm患者能够响应最初的放射治疗，但残留的辐射耐受细胞往往会不可避免的导致肿瘤复发，且研究发现辐射后仍然存活的细胞获得了更强的侵袭能力。然而，通过增加辐射剂量来改善病人预后的手段会导致健康脑组织细胞由于暴露在极限耐受剂量而受到损伤。因此，寻找gbm放射治疗过程中产生的潜在放射耐药机制并进行药物抑制有望为安全有效地促进gbm的放疗敏感性提供途径。如何提高放射治疗疗效已成为放疗领域的一大热点话题，药物增敏已有多年的历史，但其疗效和稳定性方面一直不是很理想，因此，迫切需要新的策略来提高放疗的治疗效果。

3、近年来，基于bclx基因选择性剪接调控药物的研究进展为我们这项发明的提出提供了契机。bclx基因的新生转录本能通过选择性剪接产生两种功能相互拮抗的异构体：促凋亡亚型bcl-xs和抑凋亡亚型bcl-xl。促凋亡bcl-xs和抗凋亡bcl-xl亚型的比例在调节细胞生存和死亡的切换中起着重要作用，其剪接事件也是最早发现的癌细胞响应凋亡的致癌剪接。

4、splice-switching oligonucleotides(sso)，又称剪接转换寡核苷酸，通常为15-30个核苷酸，是一种合成、经过修饰、发挥空间位阻效应的反义寡核苷酸，广泛用于调控前体mrna的可变剪接模式。它能够靶新生转录本，从而影响剪接体和关键剪接因子的可及性，但不会导致转录本的降解。天然寡核苷酸具有易降解、亲和力低、脱靶效应高等缺点。对ssos的磷酸骨架或核糖环进行的各种化学修饰显著提高了其稳定性和亲和力，同时降低细胞毒性和免疫原性。第三代反义寡核苷酸pmos是一种中性带电核酸，其中呋喃糖环被吗啉环取代。目前，pmos修饰的ssos药物eteplirsen和golodirsen已被fda批准分别用于临床治疗杜氏肌萎缩症和脊髓性肌萎缩症。pmo通常需要共价结合细胞穿透肽才能实现体内递送。gene tools公司合成了能够实现体内递送的vivo-morpholinos(vmo)，vmo由mo寡核苷酸共轭连接递送基团组成，该递送基团由八胍基树突状分子组成，提高了其稳定性，能够高效的进行细胞及动物体内的药物递送。

5、综上所述，gbm细胞中高表达的促癌亚型bcl-xl能够被靶向剪接位点的ssos阻断，从而实现异常剪接的重定向和bcl-xl/bcl-xs比值的改变。目前，尚未见有调控bclx基因选择性剪接的反义寡核苷酸对gbm辐射治疗增敏有疗效的报道，

技术实现思路

1、本发明目的是解决目前脑胶质瘤放射治疗过程中出现的辐射抗性问题，提供一种调控bclx基因选择性剪接的剪接转换寡核苷酸(ssos)在制备gbm放射治疗增敏药物中的应用。该ssos能够减少放射治疗后的gbm细胞中升高的促生存亚型bcl-xl，同时促进促凋亡亚型bcl-xs的表达，降低bcl-xl/bcl-xs的比值，从而有效促进gbm细胞的放疗敏感性，减少辐射抗性细胞的存活和转移。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案。

3、本发明第一方面提供了反义寡核苷酸(ssos)在制备治疗脑胶质瘤的药物中的应用，所述反义寡核苷酸(ssos)包含如下序列(seq id no.1)：5’-gcttggttcttacccagccgccgtt-3’。

4、本发明所述反义寡核苷酸为经过吗啉修饰的反义寡核苷酸。

5、所述反义寡核苷酸基于vivo-morpholinos技术，将morpholinos与递送基团八胍基树突状分子共轭，通过静电引力、氢键与胞膜结构中的磷脂结合，高效携带ssos穿越胞膜结构到达胞浆和胞核。

6、所述应用表现为1)抑制bcl-xl的剪接，促进bcl-xs的剪接，显著下调bcl-xl/bcl-xs的比值；

7、2)抑制人脑胶质瘤细胞活力，促进人脑胶质瘤细胞凋亡。

8、本发明还提供反义寡核苷酸(ssos)在制备脑胶质瘤放疗增敏试剂中的应用。

9、所述应用中，所述放疗为x射线放疗和/或重离子束放疗。

10、更具体地，所述应用为反义寡核苷酸(ssos)在制备具有如下1)-3)中任一项所述功能的药物中的应用：

11、1)人脑胶质瘤的x射线放疗增敏，表现为bclx-vmo协同x射线抑制人脑胶质瘤细胞的增殖、bclx-vmo协同x射线促进人脑胶质瘤细胞的凋亡；

12、2)人脑胶质瘤的重离子束放疗增敏，表现为bclx-vmo协同重离子束促进人脑胶质瘤细胞的凋亡、bclx-vmo协同重离子束抑制人脑胶质瘤细胞的克隆存活；

13、3)阻止x射线和/或重离子束放疗抵抗细胞导致的胶质瘤复发和转移。

14、所述重离子束具体可为12c6+离子束。

15、本发明的另一方面是提供了一种治疗脑胶质瘤的药物或脑胶质瘤放疗增敏试剂。

16、所述治疗脑胶质瘤的药物或脑胶质瘤放疗增敏试剂包括反义寡核苷酸(ssos)以及药学可接受的载体。

17、所述反义寡核苷酸(ssos)包含如下序列(seq id no.1)：5’-gcttggttcttacccagccgccgtt-3’。

18、本发明所述反义寡核苷酸为经过吗啉修饰的反义寡核苷酸，其结构式如下所示，参见文献paul a.morcos,yongfu li,and shan jiang.vivo-morpholinos:a non-peptidetransporter delivers morpholinos into a wide array of mousetissues.biotechniques.2008dec；45(6):616-26.

19、

20、所述反义寡核苷酸基于vivo-morpholinos技术，将morpholinos与递送基团八胍基树突状分子共轭，通过静电引力、氢键与胞膜结构中的磷脂结合，高效携带ssos穿越胞膜结构到达胞浆和胞核。

21、所述反义寡核苷酸以及所述载体可被制备成脂质体、纳米材料、微乳液、微球、凝胶或囊泡等剂型，这些剂型的制备方法和所用的辅料均为现有技术。

22、本发明与现有技术相比具有下列优点：

23、(1)bclx剪接转换寡核苷酸协同x射线和/或重离子束，促进肿瘤凋亡相关基因表达，进一步抑制gbm肿瘤细胞的增殖、促进辐照后细胞凋亡增加。

24、(2)bclx剪接转换寡核苷酸可直接抑制由于辐射引起的bcl-xl上调而导致的辐射耐受事件的发生，同时上调bcl-xs亚型的剪接，促进辐照后细胞凋亡。

25、(3)基于vivo-morpholinos技术，使反义寡核苷酸更加高效，安全的进入细胞和瘤体内发挥作用。

26、(4)本发明所述bclx剪接转换寡核苷酸联合放疗对人脑胶质瘤细胞诱导凋亡的作用高于单一放疗组，呈现明显放疗增敏协同效应。因此，本发明从肿瘤细胞增殖、dna复制、凋亡、克隆存活等多个层面上提供了bclx剪接转换寡核苷酸制备放疗增敏试剂的潜在应用价值。