一种复合多孔止血敷贴及其应用

一种复合多孔止血敷贴及其应用
【技术领域】
1.本发明属于医用材料技术领域，具体地说，是关于一种复合多孔止血敷贴及其应用。


背景技术：

2.烧伤是日常生活中常见损伤，创伤愈合是指机体遭受外力作用，皮肤等组织出现离断或缺损后的愈复过程，包括各种组织的再生和肉芽组织增生、瘢痕组织形成的复杂组合，表现出各种过程的协同作用。烧伤创面治疗的关键在于抗感染和促进愈合。中医药在缓解创面疼痛、抗感染、促进创面愈合、减少瘢痕形成及增强免疫调理等方面展示出良好的治疗作用。然而，传统的中药剂型已经不能适应现代临床及战场环境的应用需求。因此，构建一种传统中药与现代制剂技术相结合的、兼具抗感染和促进创面组织再生双重效应的新型烧伤创面治疗材料具有重要意义。
3.伤口的创伤愈合的基本过程：急性炎症期
→
细胞增生期
→
瘢痕形成期
→
表皮及其它组织再生。根据损伤程度及有无感染，创伤愈合可分为一期愈合、二期愈合、三期愈合这三种类型。流血时通过一定方式处理，快速让血停止向外流动叫做止血。止血效果因人而异。有人快，有人慢，与血小板有关。正常情况下，小血管受损后引起的出血在几分钟内就会自行停止，这种现象称为生理性止血。生理性止血是机体重要的保护机制之一，是多种因子和机制相互作用的结果。止血过程主要包括血管收缩、血小板血栓形成和血液凝固三个过程
4.中药白及是临床常用止血中药，因其止血作用极为突出，被称为收敛止血的要药，可用于外伤出血、咯血、吐血等体内外诸多出血证。同时白及还具有消肿生肌的功效，对于痈肿疮疡、手足皲裂、水火烫伤等病症的治疗及创面修复具有较佳疗效。白及的主要药理成分为白及胶，即白及多糖。现代研究证实白及胶组织相容性及生物降解性好，无刺激性，甚至以白及胶为主的2％白及代血浆可代替人体血浆用于失血性休克的治疗。药理作用发现，白及胶对于创面发挥止血作用可能是与激活了内源性和外源性的凝血系统，从而促进血小板聚集有关，除此之外，对实质性器官例如肝、脾、肌肉、血管等出血的效果良好。白及胶在促进创面愈合的方面具有独特的优势，它能够加速炎性细胞的渗出，在伤口形成新生毛细血管和创面胶原纤维，增强细胞的增殖能力，减少伤口愈合时间，从而加速伤口的愈合。白及胶还具有一定的抗菌消炎及镇痛作用。此外，白及胶具有良好的吸湿且透气的物理性质，湿润后黏性自动变强，对渗出液较多的创面可以直接贴敷，一方面不仅可以吸收渗出液，另一方面吸收渗液后黏附性增强，不易脱落，无需其它胶带固定，既增加了透气性，又防止胶带过敏。因此，具有止血、抗感染、促伤口修复及强粘附性、组织相容性好、易被自体吸收的白及胶是一种非常理想的止血敷料基质，在医用敷料和经皮药物传递系统中具有潜在的应用价值。
5.作为天然的有机高分子化合物之一，壳聚糖作为具有如下五个优良特性，因此使其成为制备战创伤敷料的首选材料：
①
止血性，壳聚糖是一种阳离子碱性多糖，能吸附阴离
子的红细胞而使其发生聚集，也会促进血小板黏附与聚集。从而实现止血作用；
②
抗菌性，壳聚糖对阳性菌和阴性菌都有一定的抑制和杀灭作用，可以防止伤口感染和恶化；
③
保湿性，由于自身的高亲水性，壳聚糖具有极强的保湿能力，能在患处产生舒适的湿润感和柔和的触感；
④
促进性，壳聚糖具有良好的生物相容性，为皮肤细胞的生长因子加速愈合；
⑤
成型性，壳聚糖易成型，能与许多高分子化合物共混制成多种形态，常见的如纤维、膜、水凝胶、海绵等，可用于多种用途。但由于壳聚糖水溶性较差，只能在弱酸性溶液中溶解，一定程度上限制了壳聚糖的应用。但壳聚糖的新型衍生物-羧甲基壳聚糖，除了具备壳聚糖上述的特性之外，它的水溶性和生物降解性更加突出，还具有广谱抗菌、抗氧化、抗溃疡等作用，因此是一种应用更加广泛的高分子成膜材料，在创伤止血、创伤修复、药物缓释控制、骨缺损支架材料以及防止手术后组织粘连等方面均有应用和研究。
6.黄连是中医临床最常用的清热解毒中药。黄连及其主要有效成分黄连素(又称盐酸小檗碱)具有广谱抗菌的作用，研究发现对溶血性链球菌、金葡菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、阴沟杆菌及伤寒杆菌多种细菌及真菌等都有抑制或杀灭作用。此外，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌、耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌、耐碳青霉烯铜绿假单胞菌等多重耐药菌株的抑菌作用效果良好，与其他抗生素联合协同使用，一定程度上可逆转耐药。
7.中国专利文献cn：108815381a公开了一种用于烧伤创面愈合的中药钛酸银复合多孔材料及制备方法与应用，是由体积比为1:1:(1～5)的黄芩苷溶液、白及胶胶液与羧甲基壳聚糖胶液制成，其中：黄芩苷溶液的浓度为100mg/ml，白及胶胶液的浓度为5％，羧甲基壳聚糖胶液的浓度为4％；钛酸银的负载量为0.1～5wt％。该复合多孔材料具备良好的抗菌性、吸水性和透气性能，对烧伤创面有明显的促进愈合作用。中国专利文献cn：201810606523.9公开了一种用于烧伤创面愈合的中药复合多孔支架材料及制备方法与应用，由体积比为1:1:(1～5)的黄芩苷溶液、白及胶胶液与羧甲基壳聚糖胶液制成，其中：黄芩苷溶液的浓度为100mg/ml，白及胶胶液的浓度为5％，羧甲基壳聚糖胶液的浓度为4％。本发明制备的用于烧伤创面愈合的中药复合多孔支架材料具备良好的抗菌性、吸水性和透气性能，无皮肤刺激性，对烧伤创面有明显的促进愈合作用。上述两个申请与本技术药物组成不同、浓度不同，在应用方面，上述申请是针对于烧伤创面愈合，而本技术是在烧伤创面愈合的基础上拓展的应用，还应用于快速止血。
8.因此，本研究选用具有止血性能、促创面愈合作用、生物相容性优异的白及胶、羧甲基壳聚糖作为外用高分子成膜材料，同时也是主要药效成分，再辅以具有广谱抗菌作用的黄连素，旨在构建一种具有快速止血、抗感染、促创面修复等多种功效的复合多孔止血敷贴。


技术实现要素：

9.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种复合多孔止血敷贴。
10.本发明的再一目的是，提供一种上述止血敷贴的用途。
11.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
12.一种复合多孔止血敷贴，是由体积比为(1-5)：(1-5)：(1-5)的黄连素溶液、白及多糖溶液与羧甲基壳聚糖胶液制成，其中：黄连素溶液的浓度为5mg/ml、白及胶胶液的浓度为
2-8％、羧甲基壳聚糖溶液的浓度为2-8％。
13.优选地，所述的复合多孔止血敷贴是由体积比为1:1:3的黄连素溶液、白及多糖溶液与羧甲基壳聚糖胶液制成，其中：黄连素溶液的浓度为5mg/ml、白及胶胶液的浓度为5％、羧甲基壳聚糖溶液的浓度为5％。
14.为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
15.如上任一所述的复合多孔止血敷贴在制备止血和/或创面愈合药物中的应用。
16.中药复合多功能敷贴的使用方法：
17.(1)创伤内外出血
18.该敷贴适用于各种形状的出血创面，可直接将敷贴贴敷出血创面。当出血量较大时，可用外加止血绷带，配合使用。原为多孔膜状结构的敷贴贴敷于伤口，在吸收血液湿润后会变为半固态凝胶状，能紧密贴敷于不同形状的创面，同时其黏性自动变强，不易脱落，无需借助其它化学黏附材料及医用绷带固定，使用方便，不易过敏，而且能自体吸收降解，减少了因更换敷料而造成的二次损伤。
19.(2)皮肤创伤缺损
20.直接将敷贴贴敷在皮肤创伤缺损处。对于有渗出液的创口，该敷贴同样可以吸收多余的渗出液而产生较强的黏附性，可直接贴敷。对于渗出液较少的创面，可在创面上添加少许的生理盐水，再贴敷使用。该敷贴组织相容性较好，贴敷后可逐渐自体吸收，无需更换，当基本吸收之后，可再次贴敷，直至伤口愈合结痂。贴敷后可在伤口上形成覆盖物，将伤口与外界进行一定的物理隔离，同时该敷贴孔隙率和透气率均较高，利于创面的气体交换，另外该敷贴具有一定的抑菌作用，防治创面进一步受到外界感染。
21.本发明优点在于：
22.本研究选用具有止血性能、促创面愈合作用、生物相容性优异的白及胶、羧甲基壳聚糖作为外用高分子成膜材料，同时也是主要药效成分，再辅以具有广谱抗菌作用的黄连素，旨在构建一种具有快速止血、抗感染、促创面修复等多种功效的复合多孔止血敷贴。该敷贴为易储存的固态膜状结构，当贴敷于出血伤口或有渗液的创面会变为半固态凝胶状，能紧密贴敷于各种形状的创面，同时具有强黏附性能，无需借助其他黏附材料及医用绷带即可固定，减少了过敏的可能；还具有组织相容性好，易被机体吸收，无需更换的特点，非常适合多种环境下使用。
【附图说明】
23.图1是5种不同比例的白及多糖溶液(bsp)和5％羧甲基壳聚糖溶液(cmc)的孔隙率的筛选；
24.图2是5种不同比例的白及多糖溶液(bsp)和5％羧甲基壳聚糖溶液(cmc)的吸水率的筛选；
25.图3是5种不同比例的白及多糖溶液(bsp)和5％羧甲基壳聚糖溶液(cmc)的透气率的筛选；
26.图4是不同敷料的体外凝血指数的对比(与医用纱布相比，*p＜0.05，**p＜0.01；与明胶海绵相比，
#
p＜0.05，
##
p＜0.01)；
27.图5是不同敷料在大鼠创伤止血实验的效果(n＝8，x
±
s)(与医用纱布相比，*p＜
0.05，**p＜0.01；与明胶海绵相比，
#
p＜0.05，
##
p＜0.01)；
28.图6是各组不同时间点的创面愈合率的对比(与医用纱布相比，*p＜0.05，**p＜0.01；与壳聚糖敷料相比，
#
p＜0.05，
##
p＜0.01)；
29.图7是创面及周围的皮肤和组织进行常规he染色切片图；
30.图8(a、b、c)是各组各组大鼠血清il-1β、tnf-α、il-10水平对比(与医用纱布相比，*p＜0.05，**p＜0.01；与壳聚糖敷料相比，
#
p＜0.05，
##
p＜0.01)；
31.图9是不同浓度bbccd提取液孵育24h后，小鼠l929细胞的细胞活力值图。
【具体实施方式】
32.下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
33.实施例1复合多孔止血敷贴中白及胶与羧甲基壳聚糖的比例筛选
34.在保持混合物总量不变及黄连素的终浓度为5mg/ml的基础上，将5％白及多糖溶液(bsp)和5％羧甲基壳聚糖溶液(cmc)以5种不同的比例(分别为5:1、3:1、1:1、1:3、1:5)混合，置于55℃水浴中充分交联30min，搅拌至无气泡。将交联后的混合胶液倒于24孔板，每孔加液0.6ml，冷却至室温；将24孔板预冷冻，然后真空冷冻干燥，获得系列浓度梯度的自制敷料，分别依次命名bsp5/cmc1、bsp3/cmc1、bsp1/cmc1、/bsp1/cmc3、bsp1/cmc5。将以上样品分别取5个批次的自制敷料材料，进行孔隙率、吸水率、透气率的测定，并计算平均值，筛选其最佳比例。
35.结果显示(图1、图2、图3)，自制敷料的吸水率随着cmc的比例增加而逐渐上升，在bsp与cmc的配比为1：3和1：5时，自制敷料的吸水率均达到最高，分别为524.78％和517.23％，具有优异的吸水性。自制敷料的孔隙率随着cmc的比例增加而先升高后降低，当bsp与cmc的配比为1：3时，孔隙率最高，为92.91％。各组自制敷料的透气率均超过65％，其变化趋势与孔隙率相似，较高的透气率有利于创面的气体交换，加速创面愈合。因此综合评价自制敷料中的bsp与cmc的最佳配比为1：3。
36.实施例2止血作用研究
37.1.体外凝血实验
38.1.1实验过程
39.将医用纱布(gauze)、明胶海绵(gelatinsponge，gs)、中药复合多功能敷贴(bbccd)均剪裁成质量为10mg块状，并分别置于离心管中，其中空白对照组不加任何样品。将上述离心管37℃预热5min，随后每管再加入新鲜的抗凝兔血0.45ml，随后再快速加入50μl的0.2mol/l的氯化钙溶液，再次37℃预热5min，随后再分别加入40ml的双蒸水，37℃恒温振摇20min。采用酶标仪测定各样品的上清液在540nm处的吸光度a样品，其中不加样品的为空白对照组，其吸光度为a对照。通过以下公示计算凝血指数bci(blood clottingindex)：bci(％)＝a样品/a对照
×
100％。一般认为bci越小，则说明该敷贴的止血效果越好。
40.1.2实验结果
41.bbccd的凝血指数最低，与其它两组相比具有差异性(p＜0.01)，表明bbccd的体外凝血效果优于医用纱布和明胶海绵(图4)。
42.2.止血动物实验
43.2.1动物
44.75只sd大鼠购买于斯贝福(北京)生物技术有限公司，spf级，体重170-185g，雄性，许可证号scxk(京)2019-0010，质量检测单位(苏州西山生物技术有限公司)。60只大鼠用于实施例2中的止血实验，15只大鼠用于实施例3中的创面修复实验。
45.2.2分组
46.60只大鼠其中股静脉为12只，肝脏为24只，断尾为24只。股静脉中纱布组、明胶海绵组、中药复合多功能敷贴组各4只，每只大鼠的左右腿各采集一组股静脉止血数据，每组2个
×
4只＝8个数据。肝脏中纱布组、明胶海绵组、中药复合多功能敷贴组各8只，每组1个
×
8只＝8个数据。断尾中纱布组、明胶海绵组、中药复合多功能敷贴组各8只，每组1个
×
8只＝8个数据。
47.2.3大鼠股静脉止血实验
48.先将各组敷料进行称重。股静脉、肝脏和断尾止血实验中，大鼠均做麻醉处理(按体重0.3-0.4ml/100g剂量腹腔注射给予10％水合氯醛麻醉剂，使其全身麻醉)，对于股静脉和肝脏止血实验中，对需要解剖的部位(大腿和腹部)做剃毛处理。将麻醉大鼠的大腿部脱毛消毒处理后，用手术刀切开皮肤暴露股静脉。然后用手术刀片快速划穿股静脉及附近组织，深度为0.5cm，让其自由流血2s后，分别用不同敷料覆盖伤口，同时在敷料上放置10g砝码进行按压，并开始记录时间，待50s后，轻轻取下敷料，观察伤口情况，如有继续出血，则重复覆盖敷料并按压，随后每隔约15s观察一次，重复以上操作直至伤口无活动性出血。此时记录不同敷料的止血时间。
49.2.4大鼠肝脏止血实验
50.麻醉大鼠固定在手术台上，对其腹部进行脱毛消毒处理。用手术剪在大鼠腹部剑突下剪开3cm左右，暴露肝脏。取医用纱布垫于肝脏下方，然后用手术刀在肝脏表面作长度为1cm，深度为0.5cm的切口，让其自由流血2s后，立即取不同的敷料进行贴敷止血。实验分组和止血时间的测量方法同大鼠股静脉止血实验。
51.2.5大鼠断尾止血实验
52.将大鼠麻醉后，在距其尾部约2cm处用手术刀片切断鼠尾，建立大鼠断尾出血模型，然后立即给予各止血材料并施加固定压力，实验分组和止血时间的测量方法同大鼠股静脉止血实验。
53.2.6大鼠股静脉、肝脏和断尾止血实验结果
54.在大鼠股静脉、肝脏止血实验中，bbccd的止血时间均为最短，与医用纱布以及明胶海绵相比均具有统计学意义(p＜0.05)。大鼠断尾止血中，bbccd止血时间最短，与医用纱布以及明胶海绵差距显著，具有统计学差异(p＜0.05)(图5)。
55.实施例3动物皮肤创面修复作用研究
56.1.皮肤愈合率的对比
57.15只大鼠随机分为空白组(control)、壳聚糖敷料组(chitosan)和多功能复合敷贴组(bbccd)，每组5只。
58.将麻醉大鼠的背部脱毛消毒处理后，用1cm的皮肤打孔器在大鼠的背部制作4个圆形全皮层切除创面，创面位置以脊柱为对称，左右各两个，分别靠近肩脚骨和尾脚骨。每个创面损伤至肌筋膜深层。用生理盐水冲洗创面后，分别贴敷上述敷料，其中空白组不做任何处理。随后每只大鼠单笼饲养，每天更换一次敷料，并在第1、3、5、7、14天用相机拍摄创面。
使用imagejpro软件测量创面面积，并按以下公式计算创面愈合率：愈合率(％)＝(s1-sn)/s1
×
100％，其中s1为手术结束后当天测量的创面面积，sn为手术后结束第n天所测量的面积。
59.实验结果：在治疗后的第3、5、7、14d，bbccd组的愈合率均优于壳聚糖敷料和空白组(p＜0.05)，同时bbccd组的创面愈合平整，且疤痕较小(图6)。
60.2.皮肤组织病理学的分析
61.在创伤后的第3，7，14，21天处死分别3只大鼠，对创面及周围的皮肤和组织进行常规he染色切片制作，进行创面病理学分析，综合评价敷料的促愈合作用。
62.实验结果：组织病理学结果显示，与空白组和壳聚糖敷料组相比，bbccd可通过降低伤口的炎症反应，加速创面表皮重建等途径，促进伤口愈合(图7)。
63.3.不同愈合时期的血清il-1β、tnf-α、il-10的对比
64.取上述第1、7、14天大鼠血清，严格按照elisa试剂盒方法测定各组il-1β、tnf-α和il-10水平。
65.实验结果：在第7、14d，与空白组相比，bbccd组和壳聚糖敷料组的il-1β、tnf-α的水平显著降低，且bbccd组较壳聚糖敷料组更低，均有统计学意义(p《0.05)；bbccd组和壳聚糖敷料组较空白组il-10水平显著增高，bbccd组较壳聚糖组更高，均有统计学意义(p《0.05)。说明bbccd能更有效地抑制促炎因子的释放，控制创面的炎症反应(图8)。
66.实施例4细胞毒性实验
67.(1)准备工作：小鼠l929细胞株购买于上海雷根科技生物有限公司(no：sc374)；在dmem培养基中加入10％的胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)以及1％青霉素-链霉素溶液混合均匀，配制成完全培养基。
68.(2)细胞复苏：迅速解冻细胞冻存液，于离心机1000rpm离心5min后弃上清，加入新鲜培养基吹混悬成细胞悬液。将均匀的细胞悬液接种于10cm培养皿中，置于细胞孵箱，37℃、5％co2培养备用。
69.(3)细胞传代：培养2～3天后细胞即可达到需要传代的密度。用pbs清洗细胞2～3遍，加入适量体积的0.25％胰酶，放入孵箱消化3min后加入适量体积完全培养基终止消化，于离心机1000rpm离心5min。按细胞复苏中离心后的步骤进行培养。
70.(4)细胞铺板与处理：取对数生长期的小鼠l929细胞，以30000个/ml的密度，每孔100μl的体积接种于96孔板中，每组样品设置5个复孔。待细胞融合率达到80％左右时，小心去除培养基，分别加入不同浓度(0、0.1、1、10、100、1000μg/ml)的bbccd提取液，培育1天后，遵照试剂盒说明书于每孔细胞加入10μlcck-8试剂，避光条件下孵育40-60min，期间定时观察培养基的颜色变化，待未加bbccd的一组培养基变为橙黄色时用酶标仪于450nm波长处检测各孔的吸光度值。
71.(5)实验结果：细胞实验显示(图9)，与不同浓度bbccd提取液(0.1、1、10、100、1000μg/ml)孵育24h后，小鼠l929细胞的细胞活力值分别为114.25％、102.74％、101.52％、95.61％、88.67％，均高于85％，且各组之间无显著性差异(p＞0.05)。因此，bbccd具有无明显的细胞毒性。
72.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为
本发明的保护范围。