DNA凝缩体系、无解旋环状复合物、制备方法和在制备基因治疗药物中的应用与流程

本发明涉及基因递送，特别涉及一种dna凝缩体系、无解旋环状复合物、制备方法和在制备基因治疗药物中的应用。

背景技术：

1、通过引入外源基因对人类基因进行纠正或补偿，从而治疗某些人类遗传性疾病的方法被称作基因治疗策略。基因治疗在理论层面具有相当大的优势，通过在临床上实行单纯的基因治疗就可以永久性治愈某些疾病。虽然理论再到临床应用的过程是曲折并且漫长的，但是随着基因载体的开发、嵌合抗原受体t(car-t)细胞免疫疗法的兴起和基因组编辑技术的突破，基因治疗在近几年逐渐成为了疾病治疗的一种重要的方法，为多个医学领域提供了全新的治疗选择。由于将裸露的dna直接注射入生物体内存在诸多的局限性，比如，核酸在生物体内容易降解，细胞对核酸分子的摄取量比较低等，限制了治疗基因的实际应用，因此通过使用基因载体将治疗基因运送到病变部位从而提高治疗基因在生物体内的利用率，是基因治疗走向未来的关键。

2、具有复制缺陷的重组病毒载体是第一个能够高效地将目的基因转移到人体细胞的分子工具。虽然病毒具有复杂的结构和生命周期，其中许多是病原体，但有几种病毒是高效的基因传递工具。非病毒载体通常不能接近病毒载体的效率，因为基因拷贝必须呈递给靶细胞，才能在细胞核中表达一个或几个拷贝。对于病毒载体，通常的方法是去除不需要的或致病的基因，同时在适当的位置保留基因传递、表达和持久性的效率。同时病毒载体也需要克服许多常见的问题，比如去除毒性基因，缺少复制能力强的亲本病毒和目的基因对病毒载体成分的影响。病毒类基因载体，虽然可以实现dna的高效表达，但是由于病毒独特的结构带来的较高的免疫原性和基因的整合突变效应，降低了病毒载体的安全性。同时，病毒载体的生产比较困难，这也使病毒载体难以支撑未来基因治疗的发展。因此，就目前而言，能够使用的病毒载体是非常的有限的。

3、因此，开发和发展非病毒载体成为了基因治疗中的研究重点，其中阳离子聚合物载体由于其化学结构可控、易于化学修饰、原料来源广泛、可大规模生产等优点，使之成为了非病毒载体中的研究热点。

技术实现思路

1、针对基因治疗中细胞对核酸分子摄取量比较低，裸露dna在体内循环时间短、dna在凝缩包埋过程中双链结构容易遭到破坏等问题，本发明的目的包括提供一种dna凝缩体系、无解旋环状复合物、制备方法和在制备基因治疗药物中的应用，该dna凝缩体系可制备得到dna和聚合物的无解旋环状复合物，从而有助于保留dna完整地双链结构、改善细胞的内吞效率，增加dna在生物体内的循环时间，应用于基因治疗。

2、在本发明的第一方面，提供一种dna凝缩体系，其包括如下成分：嵌段共聚物、dna、盐离子和水；

3、其中，所述盐离子的浓度为150～1200mmol/l；

4、所述嵌段共聚物具有聚乙二醇嵌段和侧氨基型聚氨基酸嵌段，所述侧氨基型聚氨基酸嵌段为聚赖氨酸嵌段和聚鸟氨酸嵌段中的至少一种，且0～45％的所述侧氨基型聚氨基酸嵌段的侧基-nh2被-sh取代；其中，所述聚乙二醇嵌段的重均分子量为5kda～20kda，所述侧氨基型聚氨基酸嵌段的重均分子量为3.5kda～15kda。

5、在一些实施方式中，所述嵌段共聚物具有式(1)所示结构：

6、

7、式(1)中，q为选自200～250的整数；y为选自35～50的整数；

8、r1为c1-3烷基；

9、l1为c1-6亚烷基；

10、z1为-nh-、-o-nh-或-o-；

11、任一个l2独立地为亚丁基或亚丙基；

12、任一个r2独立地为-nh2或r3；其中，r3的结构为-nh-z3-l3-sh，其中l3为c2-6亚烷基，z3为-c(＝nh)-、-c(＝o)-或*-c(＝o)-nh-，其中“*”表示l2方向；式(1)中，r3的数量为n且n与y的比值为0～45％。

13、在一些实施方式中，所述的dna凝缩体系满足如下特征中的任一个或任意多个：

14、所述盐离子为钠离子；

15、所述盐离子的浓度为500～700mmol/l；优选为550～650mmol/l

16、所述dna凝缩体系的ph为7.2～7.6。

17、在一些实施方式中，所述的dna凝缩体系满足如下特征中的任一个或任意多个：

18、所述嵌段共聚物中氨基正电荷和dna中磷酸基团负电荷的摩尔比记为n/p，所述n/p为1～16，优选为1～2；

19、所述dna的浓度为20～150ng/μl；优选为25～50ng/μl。

20、在一些实施方式中，所述的dna凝缩体系满足如下特征中的任一个或任意多个：

21、所述dna的长度为3k～20k bp；

22、所述侧氨基型聚氨基酸嵌段为聚赖氨酸嵌段；

23、所述聚乙二醇嵌段的重均分子量为6kda～12kda；

24、所述侧氨基型聚氨基酸嵌段的重均分子量为4kda～13kda；

25、0～42％的所述侧氨基型聚氨基酸嵌段的侧基-nh2被-sh取代。

26、在一些实施方式中，n与y的比值为0～42％；

27、可选地，n与y的比值为0或8％～42％。

28、在一些实施方式中，所述的dna凝缩体系满足如下特征中的任一个或任意多个的组合：

29、l2均相同；

30、r2均相同；

31、q为选自225～230的整数；

32、y为选自36～44的整数；

33、r1为甲基；

34、l1为1,2-亚乙基、1,3-亚丙基或1,4-亚丁基；

35、z1为-nh-；

36、l2为1,4-亚丁基；

37、z3为-c(＝nh)-；

38、l3为1,2-亚乙基、1,3-亚丙基或1,4-亚丁基。

39、在一些实施方式中，所述的dna凝缩体系满足如下特征中的任一个或两个：

40、l1为1,2-亚乙基；

41、l3为1,3-亚丙基。

42、在本发明的第二方面，提供一种无解旋环状复合物，其由嵌段共聚物和dna复合而成；其中，所述嵌段共聚物如本发明第一方面所定义。

43、在一些实施方式中，所述无解旋环状复合物由本发明第一方面所述dna凝缩体系制备而成。

44、在一些实施方式中，满足如下特征中的任一个或两个：

45、所述无解旋环状复合物的流体力学直径为180～190nm；

46、至少一部分所述dna具有完整双链结构；

47、所述无解旋环状复合物中含有交联的二硫键。

48、在本发明的第三方面，提供一种无解旋环状复合物的制备方法，其包括如下步骤：在150～1200mmol/l盐离子存在条件下，将dna和嵌段共聚物进行涡旋混合，将制成的混合体系静置；其中所述嵌段共聚物为本发明第一方面所述凝缩体系。

49、在一些实施方式中，所述的制备方法，满足如下特征中的一种或多种：

50、所述涡旋混合时间为1～5秒；

51、静置温度为4～25℃；

52、静置时间为0.5～24h；

53、静置结束后还包括如下步骤：采用水透析；

54、所述dna和所述嵌段共聚物构成的混合体系为本发明第一方面所述dna凝缩体系。

55、在一些实施方式中，所述侧氨基型聚氨基酸嵌段的侧链结构中含有-sh；将所述dna和所述嵌段共聚物混合之前，采用二硫键还原剂对所述嵌段共聚物进行预处理。

56、在一些实施方式中，所述二硫键还原剂选自二硫苏糖醇、谷胱甘肽和tcep中的一种或多种。

57、在本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述dna凝缩体系，或本发明第二方面所述无解旋环状复合物，或本发明第三方面所述的制备方法制备得到的所述无解旋环状复合物在制备基因治疗药物中的应用。

58、在一些实施方式中，所述的药物用于治疗下述疾病中的至少一种：缺血性疾病、肿瘤和眼部新生血管性疾病。

59、在本发明的第五方面，提供一种嵌段共聚物作为非病毒基因载体或者在基因递送中的应用，所述的应用不是诊断和治疗目的；所述嵌段共聚物如本发明第一方面所定义；

60、所述的应用基于下述任一种体系或物质：

61、本发明第一方面所述dna凝缩体系；

62、本发明第二方面所述无解旋环状复合物；以及

63、本发明第三方面所述的制备方法制备得到的所述无解旋环状复合物。

64、本发明提供的dna凝缩体系通过聚乙二醇-侧氨基型聚氨基酸嵌段共聚物(可记为peg-pnaa)与dna分子离子复合作用，可以将dna分子凝缩成为纳米粒子，形成dna和聚合物的环状无解旋复合物，从而有助于保留dna完整地双链结构，最大限度地保留dna生物活性，改善细胞的内吞效率，并通过携带聚乙二醇保护壳增加dna在生物体内的循环时间。该dna凝缩体系及环状复合物可广泛应用于基因治疗。

65、peg-pnaa的侧氨基可以被-sh，此时记为peg-pnaa(sh)，也可以不被-sh取代，此时记为peg-pnaa(nh2)。通过将侧氨基型聚氨基酸嵌段的一部分侧基-nh2取代为-sh，得到的巯基修饰的聚乙二醇-侧氨基型聚氨基酸嵌段共聚物可记为peg-pnaa(sh)，该嵌段共聚物可以使形成的纳米复合物中的-sh交联形成二硫键，可增加纳米复合物的在细胞外的稳定性，在进入细胞内的时候响应胞内的谷胱甘肽使二硫键还原，促进纳米复合物在胞内的解离，进而促进dna在细胞内的释放，实现在血液循环中稳定存在，并且在到达靶细胞内的时候能够迅速的释放dna。

66、当侧氨基型聚氨基酸嵌段为聚赖氨酸嵌段时，peg-pnaa记为peg-plys，peg-pnaa(sh)记为peg-plys(sh)，peg-pnaa(nh2)记为peg-plys(nh2)。进一步地，使用peg-pnaa(peg-pnaa(nh2)和/或peg-pnaa(sh))与pdna(质粒dna)定向凝缩成为环状的复合物，可显著提高非病毒载体携带dna的转染效率。

67、此外，本发明提供的环状dna凝缩体为环状自缠绕凝缩体，其中dna的双链结构未发生破坏，有利于后期的dna转录。