EP300降解剂和其在神经母细胞瘤中的用途的制作方法

背景技术：

1、各种研究已表明，e1a结合蛋白质p300(ep300、kat3b)和camp应答元件结合蛋白质(creb)结合蛋白质(cbp、crebbp、kat3a)在细胞存活的调控中发挥重叠但不同的作用。ep300或cbp的种系损失导致具有不同表型的鼠胚胎致死性(yao等cell 93:361-72(1998))。此外，cbp是自我更新所需的，而ep300是造血干细胞分化所需的(rebel等proc.natl.acad.sci.u.s.a.99:14789-94(2002))。ep300或cbp的体细胞突变见于多种恶性肿瘤(包括神经母细胞瘤)中，并且cbp突变的肿瘤细胞中ep300的损失在合成上是致死的(barretina等nature 483:603-7(2012)；ogiwara等cancer discov.6:430-45(2016))。

2、与高通量测序耦合的染色质免疫沉淀(chip-seq)研究已在全基因组鉴别出用于ep300和cbp的重叠但不同的dna结合位点，表明这两种蛋白质可通过调控不同基因的增强子而不同地起作用(martire等bmc mol.cell biol.21:55(2020)；ramos等nucleic acidsres.38:5396-5408(2010))。询问ep300和cbp的许多研究依赖于不允许时间相关分析的对每个基因的遗传破坏或mrna耗尽，或者可选地依赖于使用对两种酶具有非选择性活性的抑制剂(dancy和cole,chem.rev.115:2419-52(2015)；hammitzsch等proc.natl.acad.sci.u.s.a.112:10768-173(2015)；lasko等nature550:128-2(2017)；yan等j.invest.dermatol.133:2444-52(2013)；zucconi等biochemistry 55:3727-34(2016))。因此，仅靶向这些酶中的一种的药理学抑制剂的衍生受限于这些蛋白质之间的同源性(dancy和cole,chem.rev.115:19-2452(2015)；lasko等nature 550:128-32(2017))。

技术实现思路

1、本发明基于以下令人惊讶的发现：ep300而不是其旁系同源物creb结合蛋白质(cbp)是调控高风险神经母细胞瘤中的关键增强子所必需的。ep300是神经母细胞瘤(nb)中的增强子调控依赖物，其通过与转录因子活化蛋白质2b(tfap2β)(高风险神经母细胞瘤的谱系定义的核心调控回路的成员)相互作用被募集到dna。通过蛋白水解靶向嵌合体jqad1对ep300的靶向药理学降解导致神经母细胞瘤中组蛋白乙酰化的整体损失。ep300的降解部分地由于mycn染色质定位的损失而驱动神经母细胞瘤凋亡，并且对未转化的细胞具有有限的毒性。功能基因组和化学分析揭示了在许多类型的人癌症中对ep300的广泛依赖性，所述癌症例如骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌、脑癌和胰腺癌。

2、通过以下方式实施治疗患有与ep300依赖性和升高的小脑蛋白(cereblon)(crbn)表达水平相关的疾病或病症的受试者(例如，人受试者)的方法：从患有所述疾病或处于发展成所述疾病的风险中的受试者获得测试样品；鉴定所述测试样品中与参考样品相比crbn的增加的表达水平；并且向所述受试者施用治疗有效量的ep300的选择性降解剂，从而治疗所述疾病或病症。

3、在一个方面，疾病或病症是癌症。在某些实施方案中，癌症是实体瘤(即，缺乏任何液体或囊肿的肿瘤)，例如，神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、黑色素瘤、结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌、脑癌和胰腺癌。在某些实施方案中，癌症是血液癌症(即，影响血液、骨髓和淋巴结的癌症)，例如白血病、骨髓瘤和淋巴瘤。在某些实施方案中，癌症是高风险神经母细胞瘤。

4、例如，从肿瘤组织或肿瘤微环境获得测试样品。或者，从体液(例如血浆、血液、尿液、痰或脑脊液(csf))获得测试样品。其他示例性体液包括浆液(例如，胸膜液、腹膜液和心包液)、滑液以及引流和透析液。

5、在一个方面，从健康正常组织或肿瘤组织获得参考样品。例如，从来自与测试样品相同的个体的健康正常组织，或来自不同个体的一个或多个健康正常组织获得参考样品。

6、在一些情况下，通过测试样品的细胞中ep300的crispr-cas9介导的敲除来鉴定肿瘤生长是否需要ep300，即肿瘤是否是ep300依赖性的。

7、在一些情况下，经由affymetrix基因阵列杂交、下一代测序、核糖核酸测序(rna-seq)、实时逆转录酶聚合酶链式反应(实时rt-pcr)测定、免疫组织化学(ihc)或免疫荧光来检测crbn的表达水平。

8、在一个方面，ep300的选择性降解剂是jqad1或其药学上可接受的盐。

9、优选地，肿瘤细胞存活、肿瘤细胞增殖或肿瘤转移被抑制例如至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。

10、任选地，肿瘤细胞生长减少例如至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。在另一方面，诱导肿瘤细胞凋亡。

11、在一些情况下，所述方法进一步包括向受试者施用化学治疗剂、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或干细胞移植。例如，化学治疗剂包括顺式视黄酸、环磷酰胺顺铂卡铂长春新碱(vincasarvcr)、多柔比星(doxorubicin)依托泊苷(etoposide)(vp-16)、拓扑替康(topotecan)白消安(busulfan)和美法仑(melphalan)(l-pam、)或噻替派(thiotepa)

12、在一个方面，将化学治疗剂与类固醇施用。例如，类固醇是泼尼松(prednisone)(prednisone intensol)或地塞米松

13、在一些情况下，所述方法进一步包括向所述受试者施用组合化学治疗剂。例如，组合化学治疗剂包括卡铂或顺铂环磷酰胺多柔比星和依托泊苷(vp-16)或伊立替康(irinotecan)替莫唑胺(temozolomide)或异环磷酰胺在一些情况下，该治疗之后是干细胞移植。

14、在一些情况下，所述方法进一步包括向受试者施用免疫抑制剂，诸如有或无顺式视黄酸的地妥昔单抗(dinutuximab)

15、还提供了确定患有癌症的受试者中ep300的降解是否将在所述受试者中产生临床益处的方法，所述方法包括：从患有癌症或处于发展成癌症的风险中的受试者获得测试样品；确定所述测试样品中crbn的表达水平；将crbn的所述表达水平与参考样品中crbn的所述表达水平进行比较；以及如果所述测试样品中crbn的所述表达水平不同于所述参考样品中crbn的所述表达水平，则确定ep300降解是否将抑制所述受试者的所述癌症。

16、例如，从肿瘤组织或肿瘤微环境获得测试样品。或者，从体液(例如血浆、血液、尿液、痰或csf)获得测试样品。其他示例性体液包括浆液(例如，胸膜液、腹膜液和心包液)、滑液以及引流和透析液。

17、在一个方面，从健康正常组织获得参考样品。

18、例如，受试者中的临床益处包括如由实体瘤应答评价标准(response evaluationcriteria in solid tumors,recist)定义的完全或部分应答、如由recist定义的疾病稳定、或如由irrc标准定义的尽管有疾病进展或应答下的长期存活。

19、在一种情况下，从癌症组织获得测试样品，并且所述方法进一步包括如果测试样品中crbn的表达水平等于或高于参考样品中crbn的水平，则确定患有癌症的受试者中ep300的降解将在所述受试者中产生临床益处。

20、在另一种情况下，从癌症组织获得测试样品，并且所述方法进一步包括如果测试样品中crbn的表达水平低于参考样品中crbn的水平，则确定患有癌症的受试者中ep300的降解将不会在所述受试者中产生临床益处。

21、定义

22、除非明确陈述或从上下文显而易见，否则如本文所使用的术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。“约”可理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非上下文另外明确说明，否则本文所提供的所有数值均由术语“约”来修饰。

23、短语“异常表达”用于指偏离基因的正常参考表达水平的表达水平(即，增加或降低的表达水平)。

24、“药试”意指任何小化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。

25、“改变”意指如通过本领域已知的标准方法(诸如本文所述的那些)所检测到的基因或多肽的表达水平或活性的变化(增加或减少)。如本文所用，改变包括表达水平的至少1％变化，例如表达水平的至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％变化。例如，改变包括表达水平的至少5％-10％变化，优选25％变化，更优选40％变化，且最优选50％或更大的表达水平变化。

26、如本文所用的术语“抗体”(ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现期望的生物活性。术语“免疫球蛋白”(ig)在本文中与“抗体”可互换使用。

27、“结合到”分子意指对该分子具有物理化学亲和力。

28、“对照”或“参考”意指比较标准。在一个方面，如本文所用，“与对照样品或受试者相比改变”被理解为具有与来自正常、未处理或对照样品的样品统计学上不同的水平。对照样品包括例如培养中的细胞、一个或多个实验室测试动物或一个或多个人受试者。选择和测试对照样品的方法在本领域技术人员的能力范围内。分析物可以是由细胞或生物体特征性表达或产生的天然存在的物质(例如，抗体、蛋白质)或由报告构建体产生的物质(例如，β-半乳糖苷酶或荧光素酶)。取决于用于检测的方法，变化的量和测量可变化。统计显著性的确定在本领域技术人员的能力范围内，例如，与构成阳性结果的平均值的标准偏差数。

29、如本文所用，术语“药学上可接受的”在盐的背景下是指化合物的盐，其不消除化合物的生物活性或性质，并且相对无毒，即，盐形式的化合物可施用于受试者而不引起不期望的生物效应(诸如头晕或胃部不适)或不以有害的方式与含有它的组合物的任何其他组分相互作用。术语“药学上可接受的盐”是指通过本发明的化合物与适合的酸或碱反应获得的产物。本发明化合物的药学上可接受的盐的示例包括衍生自适合的无机碱的那些，诸如li盐、na盐、k盐、ca盐、mg盐、fe盐、cu盐、al盐、zn盐和mn盐。药学上可接受的无毒酸加成盐的示例是氨基与无机酸形成的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、糖质酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、4-甲基苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐等。本发明的某些化合物可与各种有机碱(诸如赖氨酸、精氨酸、胍、二乙醇胺或二甲双胍)形成药学上可接受的盐。

30、术语制剂或制剂组分的“有效量”和“治疗有效量”意指单独或组合的足以提供期望作用的制剂或组分的量。例如，“有效量”意指相对于未治疗的患者，改善疾病(例如，nb)的症状所需的单独或组合的化合物的量。术语“治疗有效量”包括单独或组合的化合物的量，其在被施用时，可在受试者中诱导疾病(例如，nb)的积极改变(例如，降解患病细胞中的ep300)，或足以预防疾病的发展或进展，或至少在一定程度上减轻疾病的一种或多种症状。用于实施本发明的用于治疗性治疗疾病的活性化合物的有效量根据施用方式、受试者的年龄、体重和一般健康状况而变化。最终，主治医师或兽医将决定适当的量和给药方案。此类量被称为“有效”量。

31、术语“表达谱”广泛用于包括基因组表达谱。可通过用于确定核酸序列水平的任何方便的手段(例如微小rna、标记的微小rna、扩增的微小rna、互补/合成dna(cdna)等的定量杂交，定量聚合酶链式反应(pcr)和用于定量的elisa)生成谱，并且允许分析两个样品之间的差异基因表达。测定受试者或患者肿瘤样品。通过本领域已知的任何方便的方法收集样品。根据一些实施方案，术语“表达谱”意指测量所测量样品中核酸序列的相对丰度。

32、可用于本发明方法中的核酸分子包括编码本发明多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源性核酸序列100％同一，但通常将展现出基本同一性，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性。与内源序列具有“基本同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。

33、如本文所用，如“获得药剂”中的“获得”包括合成、购买或以其他方式获取药剂。

34、除非明确陈述或从上下文显而易见，否则如本文所用的术语“或”应理解为包括性的。除非明确陈述或从上下文显而易见，否则如本文所用，术语“一(a/an)”和“所述”应理解为单数或复数。

35、短语“药学上可接受的载体”是本领域公认的，并且包括适于向哺乳动物施用本发明的化合物的药学上可接受的材料、组合物或媒介物。合适的载体可包括例如液体(水性和非水性的类似物，以及它们的组合)、固体、封装材料、气体和它们的组合(例如，半固体)和气体，其功能是将化合物从机体的一个器官或部分携带或运输到机体的另一器官或部分。载体在对配制剂的其他成分为生理惰性与配制剂的其他成分相容的意义上是“可接受的”，并且对受试者或患者无害。根据配制剂的类型，组合物可进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。可充当药学上可接受的载体的材料的一些示例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄蓍胶粉和；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热源水；等渗盐水；林格氏溶液(ringer’s solution)；乙醇；磷酸盐缓冲液溶液；和用于药物制剂中的其他无毒相容性物质。

36、“蛋白质”或“多肽”或“肽”意指构成如本文所述的天然存在或非天然存在的多肽或肽的全部或部分的超过两个天然或非天然氨基酸的任何链，而无论翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)如何。

37、术语“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指向处于发展成不良病况、病症或疾病的风险中、易感或易患特定不良病况、病症或疾病的临床无症状的个体施用药剂或组合物，因此涉及预防症状和/或它们的根本原因的发生。

38、术语“预后”、“分期”和“侵袭性的确定”在本文中被定义为预测瘤形成(例如，nb)的严重程度和其演变，以及如从疾病的通常过程所预期的恢复前景。一旦确定了侵袭性，就选择适当的治疗方法。

39、范围在本文中可表示为从“约”一个具体值和/或到“约”另一具体值。当表示这一范围时，另一方面包括从一个具体值和/或到另一具体值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应当理解，所述具体值形成另一方面。进一步应当理解，每个范围的端点相对于另一端点以及独立于另一端点都是显著的。还应当理解，本文中公开了许多值，并且除了值本身之外，每个值还在本文中被公开为“约”该具体值。还应当理解，在本技术通篇中，以许多不同的格式提供数据，并且该数据代表端点和起点以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了具体数据点“10”和具体数据点“15”，则应当理解，认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于、和等于10和15，以及10到15。还应当理解，还公开了两个具体单元之间的每个单元。例如，如果公开10和15，则还公开11、12、13和14。

40、本文提供的范围应理解为该范围内的所有值的简写。例如，1到50的范围应理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组的任何数字、数字的组合或子范围，以及上述整数之间的所有中间十进制值，诸如例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，特别考虑从该范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。例如，1到50的示例性范围的嵌套子范围可在一个方向上包括1到10、1到20、1到30和1到40，或者在另一方向上包括50到40、50到30、50到20和50到10。

41、“减少”意指至少10％、25％、50％、75％或100％的负改变。

42、“特异性结合”意指识别并结合本发明的多肽，但基本上不识别并结合天然包含本发明的多肽的样品(例如，生物样品)中的其他分子的化合物或抗体。

43、“选择性降解剂”是指优先结合并募集特定蛋白质(例如，ep330)用于靶向蛋白酶体降解的双功能化合物或(例如，jqad1)。

44、“罹患或疑似罹患”特定疾病、病况或综合征的受试者具有足够数量的风险因素或呈现有疾病、病况或综合征的足够数量的体征或症状或其组合，使得适任个体将诊断或怀疑该受试者罹患该疾病、病况或综合征。用于鉴别罹患或疑似罹患与ep300依赖性和升高的crbn表达水平相关的病况(例如，癌症(例如nb))的受试者的方法在本领域技术人员的能力范围内。罹患和疑似罹患特定疾病、病况或综合征的受试者不一定是两个不同的群体。

45、如本文所用，“易感”或“易发生”或“易患”特定疾病或病况或“处于发展成特定疾病或病况的风险中”是指基于遗传、环境、健康和/或其他风险因素比一般群体更可能发展成疾病或病况的个体。发展成疾病的可能性的增加可以是约10％、20％、50％、100％、150％、200％或更多的增加。

46、如本文所用的术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指向患有不良病况、病症或疾病的有临床症状的个体施用药剂或制剂，以便实现症状的严重性和/或频率的降低，消除症状和/或它们的根本原因，和/或促进损伤的改善或修复。应当了解，尽管没有排除，但治疗疾病或病况不要求完全消除该疾病、病况或与其相关的症状。

47、在一些情况下，将本发明的组合物口服或全身施用。其他施用模式包括直肠、局部、眼内、口腔、阴道内、脑池内、脑室内、气管内、鼻、透皮、植入物内/上或胃肠外途径。术语“胃肠外”包括皮下、鞘内、静脉内、肌内、腹膜内或输注。可将包括本发明组合物的组合物添加到生理流体(诸如血液)中。由于对患者的方便性以及给药方案，因此口服施用可优选用于预防性治疗。胃肠外方式(皮下或静脉内)可优先用于更急性的疾患，或者用于由于胃肠不耐受、肠梗阻或其他危重疾患的伴随而不能耐受肠内施用的患者的治疗。吸入疗法可能最适合于肺血管疾病(例如，肺动脉高压)。

48、在一些实施方案中，本发明的组合物可以胶囊或片剂形式口服施用于有需要的受试者。在一些实施方案中，本发明的组合物可以液体形式经胃肠外施用于有需要的受试者。

49、可将药物组合物组装到试剂盒或药物系统中，用于阻滞快速分裂的细胞(例如，癌细胞)的细胞周期。根据本发明这一方面的试剂盒或药物系统包括载体装置，诸如盒子、纸盒或管，在其中密闭地具有一个或多个容器装置，诸如小瓶、管、安瓿、瓶、注射器或袋。本发明的试剂盒或药物系统还可包括用于使用试剂盒的相关说明书。

50、本文提供的任何组合物或方法可与本文提供的任何其他组合物和方法中的一种或多种组合。

51、在适用或未明确否认的情况下，预期本文所述的任何一种实施方案均能够与任何其他一种或多种实施方案组合，即使实施方案是在本发明的不同方面下描述的。

52、这些和其他实施方案由下文具体实施方式公开和/或涵盖。