PD-1靶向IL-2变体免疫缀合物和FAP/4-1BB结合分子的组合疗法的制作方法

本发明涉及pd-1靶向il-2变体免疫缀合物与结合人fap和4-1bb的抗原结合分子的组合疗法。可以向组合中加入抗cea/抗cd3双特异性抗体，优选为赛必妥单抗(cibisatamab)。

背景技术：

1、癌症是经济发达国家的首要死因，并且是发展中国家的第二大死因。尽管最近在化学疗法方面取得了进展，并且开发了靶向分子水平的药剂以干扰癌细胞中生长信号的传导和调节，但晚期癌症患者的预后总体上仍然很差。因此，迫切需要开发新的疗法，这些疗法可以加入到现有治疗中，以增加存活率而不引起不可接受的毒性。

2、白介素2(il-2)是活化淋巴细胞和自然杀伤(nk)细胞的细胞因子。il-2已被证明具有抗肿瘤活性；然而，高水平的il-2会导致肺毒性，并且il-2的抗肿瘤活性受到许多抑制性反馈回路的限制。

3、基于其抗肿瘤功效，高剂量il-2(阿地白介素，商品名为)治疗已被批准用于美国转移性肾细胞癌(rcc)和恶性黑素瘤患者，并且在欧盟已经批准用于rcc患者。然而，由于il-2的作用方式，il-2的全身性和非靶向应用可能会经由诱导treg细胞和aicd而显著损害抗肿瘤免疫性。全身性il-2治疗的另一个问题与静脉施用后的严重-副作用有关，其包括严重的心血管、肺水肿、肝脏、胃肠道(gi)、神经和血液学事件(proleukin(aldesleukin)summary of product characteristics[smpc]:http://www.medicines.org.uk/emc/medicine/19322/spc/(2013年5月27日访问))。已在患者中测试了低剂量il-2方案，但是，是以次优的治疗结果为代价。总之，若可以克服与其应用相关的不利因素，利用il-2的治疗方法可能对癌症疗法有用。包含pd-1靶向抗原结合部分和基于il-2的效应部分的免疫缀合物描述于例如wo 2018/184964 a1。

4、程序性细胞死亡蛋白1(pd-1或cd279)是cd28受体家族的抑制成员，该家族也包括cd28、ctla-4、icos和btla。pd-1是细胞表面受体，并在活化的b细胞、t细胞和骨髓细胞上表达(okazaki等人(2002)curr.opin.immunol.14:391779-82；bennett等人(2003)j immunol170:711-8)。pd-1的结构是一种单体1型跨膜蛋白，其由一个免疫球蛋白可变样细胞外结构域和细胞质结构域组成，该细胞质结构域包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)和基于免疫受体酪氨酸的转换基序(itsm)。已经鉴定出pd-1的两种配体，pd-l1和pd-l2，它们已经显示出在与pd-1结合后下调t细胞的活化作用(freeman等人(2000)j exp med 192:1027-34；latchman等人(2001)nat immunol 2:261-8；carter等人(2002)eur j immunol32:634-43)。pd-l1和pd-l2都是与pd-1结合但不与其他cd28家族成员结合的b7同源物。pd-1的一种配体，pd-l1在各种人类癌症中大量存在(dong等人(2002)nat.med 8:787-9)。pd-1与pd-l1之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞的减少，t细胞受体介导的增殖的减少，以及由癌细胞所致的免疫逃避(dong等人(2003)j.moi.med.81:281-7；blank等人(2005)cancer immunol.immunother.54:307-314；konishi等人(2004)clin.cancer res.10:5094-100)。可以通过抑制pd-1与pd-l1的局部相互作用来逆转免疫抑制，并且当pd-1与pd-l2的相互作用也被阻断时，这种作用是相加的(iwai等人(2002)proc.nat 7.acad.scl usa99:12293-7；brown等人(2003)j.immunol.170:1257-66)。与pd-1结合的抗体描述于例如wo2017/055443 a1中。

5、4-1bb(cd137)，tnf受体超家族的成员，首先被鉴定为由t细胞活化表达的诱导型分子(kwon和weissman,1989,proc natl acad sci usa 86,1963-1967)。随后的研究表明，许多其他免疫细胞也表达4-1bb，包含nk细胞、b细胞、nkt细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞(dc)和非造血来源的细胞，诸如内皮细胞和平滑肌细胞(vinay和kwon,2011,cell mol immunol 8,281-284)。4-1bb在不同细胞类型中的表达主要通过各种刺激信号诱导和驱动，例如t细胞受体(tcr)或b细胞受体触发，以及通过促炎性细胞因子的共刺激分子或受体所诱导的信号传导(diehl等人,2002,j immunol 168,3755-3762；zhang等人,2010,clin cancer res 13,2758-2767)。

6、在1993年鉴定了4-1bb配体(4-1bbl或cd137l)(goodwin等人，1993,eur jimmunol 23,2631-2641)。已经表明，4-1bbl的表达受限于专业抗原呈递细胞(apc)，诸如b细胞、dc和巨噬细胞。4-1bbl的可诱导表达是t细胞(包含αβ和γδt细胞亚群)和内皮细胞的特征(shao和schwarz,2011,j leukoc biol 89,21-29)。

7、通过4-1bb受体的共刺激(例如通过4-1bbl连接)活化t细胞(cd4+和cd8+亚群)内的多个信号级联反应，从而有力地增强t细胞活化(bartkowiak和curran,2015)。与tcr触发相结合，激动性4-1bb特异性抗体可增强t细胞的增殖、刺激淋巴因子分泌并降低t淋巴细胞对经活化诱导的细胞死亡的敏感性(snell等人,2011,immunol rev 244,197-217)。这种机制作为癌症免疫疗法的第一个概念证明得到了进一步的发展。在临床前模型中，在荷瘤小鼠中施用针对4-1bb的激动性抗体导致有效的抗肿瘤作用(melero等人，1997,nat med 3,682-685)。后来，越来越多的证据表明，4-1bb通常仅在与其他免疫调节化合物、化学治疗剂、肿瘤特异性疫苗接种或放疗组合施用时才表现出其作为抗肿瘤剂的效力(bartkowiak和curran,2015,front oncol 5,117)。

8、tnfr超家族的信号传导需要三聚化配体的交联以与受体结合，需要野生型fc结合的4-1bb激动性抗体也是如此(li和ravetch,2011,science333,1030-1034)。然而，具有功能活性fc结构域的4-1bb特异性激动性抗体的全身施用导致与肝毒性相关联的cd8+ t细胞流入(dubrot等人，2010,cancer immunol immunother 59,1223-1233)，在小鼠没有功能性fc受体的情况下流入减少或显著改善。在临床中，fc活性4-1bb激动性ab(bms-663513)(nct00612664)导致4级肝炎，从而导致试验终止(simeone和ascierto,2012,jimmunotoxicol 9,241-247)。因此，需要有效且更安全的4-1bb激动剂。

9、已制造出由4-1bb配体的一个细胞外结构域和单链抗体片段(hornig等人,2012,jimmunother 35,418-429；müller等人,2008,j immunother 31,714-722)或融合到重链c末端的单个4-1bb配体(zhang等人,2007,clin cancer res 13,2758-2767)所组成的融合蛋白。wo 2010/010051公开了融合蛋白的产生，该融合蛋白由三个相互连接并与抗体部分融合的tnf配体胞外域组成。wo 2016/075278和wo 2016/156291公开了由对4-1bb具有特异性的抗原结合结构域和对肿瘤相关抗原fap具有特异性的抗原结合结构域和fc非活性结构域组成的抗原结合分子，它们被证明特别稳定和稳健。4-1bb特异性结合结构域包含三聚体，因此具有生物活性的人4-1bb配体，尽管其中一个三聚化4-1bbl胞外域位于分子的除其他两个4-1bbl胞外域外的另一多肽上。fap抗原结合结构域通过fap靶向特异性交联替换了负责fc介导的毒性的非特异性fcγr介导的交联。

10、t细胞双特异性抗体赛必妥单抗(cibisatamab)(rg7802、ro6958688、cea-tcb)是新型t细胞活化双特异性抗体，其靶向肿瘤细胞上的癌胚抗原(cea)和t细胞上的cd3，可将t细胞重新定向在细胞表面表达cea糖蛋白的肿瘤细胞，而与其t细胞受体特异性无关(bacac等人,oncoimmunology.2016；5(8):1-30)。t细胞重新定向双特异性抗体的一个主要优点是它们独立于新抗原负载介导t细胞对癌细胞的识别。cea在许多结直肠癌(crc)的细胞表面上过表达，因此赛必妥单抗是用于非高突变微卫星稳定(mss)crc的有前途的免疫治疗剂。

11、赛必妥单抗具有针对t细胞上的cd3ε链的单个结合位点和两个cea结合位点，这些结合位点调节对具有中度至高度cea细胞表面表达的癌细胞的结合亲和力(bacac等人，clin cancer res.2016；22(13):3286–97)。这避免了靶向具有低cea表达水平的健康上皮细胞，这些细胞在生理上存在于一些组织中。赛必妥单抗与癌细胞表面上的cea和t细胞上的cd3结合会触发t细胞活化、细胞因子分泌和细胞毒性颗粒释放。在至少两次先前化学治疗方案失败的表达cea的转移性crc患者中，赛必妥单抗的i期试验显示出抗肿瘤活性，在11％(4/36)和50％(5/10)分别用单一疗法或与抑制pd-l1的抗体组合治疗的患者中具有放射性萎缩(argilés等人,ann oncol.2017jun 1；28(suppl_3):mdx302.003-mdx302.003；tabernero等人,j clin oncol.2017may 20；35(15_suppl):3002)。基于这些结果，cea是mss crc中免疫疗法的最有希望的靶抗原之一。尽管该剂量递增试验中的一些患者用低于最终推荐剂量的剂量治疗，但应答率仍然表明肿瘤亚群对治疗具有抗性。

技术实现思路

1、本发明包括pd-1靶向il-2变体免疫缀合物与fap/4-1bb结合分子的组合疗法，其用为治疗癌症的组合疗法，用为预防或治疗转移的组合疗法，或用为刺激免疫反应或功能诸如t细胞活性的组合疗法，其中用于该组合疗法的该pd-1靶向il-2变体免疫缀合物包含seq id no:1的重链可变结构域vh和seq id no:2的轻链可变结构域vl和seq id no:3的多肽序列，并且其中用于组合疗法的fap/4-1bb结合分子包含：第一抗原结合部分，其包含seqid no:11的重链可变结构域vh和seq id no:12的轻链可变结构域vl，和第二抗原结合部分，其包含通过二硫键相互连接的第一多肽和第二多肽，其中第一多肽包含seq id no:13的氨基酸序列，并且第二多肽包含seq id no:14的氨基酸序列。

2、在本发明的一个方面，与fap/4-1bb结合分子组合的pd-1靶向il-2变体免疫缀合物可用于治疗乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、黑素瘤癌、膀胱癌、肾癌(renal cancer)、肾脏癌(kidney cancer)、肝癌、头颈部癌、结直肠癌、黑素瘤、胰腺癌、胃癌、食道癌、间皮瘤、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤。

3、在本发明的一个方面，与fap/4-1bb结合分子组合的pd-1靶向il-2变体免疫缀合物的特征在于该fap/4-1bb结合分子和该免疫缀合物的抗体组分为人igg1或人igg4亚类。

4、在一个方面，pd-1靶向il-2变体免疫缀合物和fap/4-1bb结合分子的特征在于抗体组分具有降低的或最小的效应子功能。在一个方面，最小效应子功能由无效应子fc突变引起。在进一步方面，无效应子fc突变是l234a/l235a或l234a/l235a/p329g或n297a或d265a/n297a。

5、在一个方面，本发明提供与fap/4-1bb结合分子组合的pd-1靶向il-2变体免疫缀合物，其中pd-1靶向il-2变体免疫缀合物包含i)seq id no:5或seq id no:6或seq id no:7的多肽序列，或ii)seq id no:5和seq id no:6和seq id no:7的多肽序列，其中用于组合疗法的fap/4-1bb结合分子包含：第一抗原结合部分，该第一抗原结合部分包含seq id no:11的重链可变结构域vh和seq id no:12的轻链可变结构域vl，以及第二抗原结合部分，该第二抗原结合部分包含通过二硫键相互连接的第一多肽和第二多肽，其中第一多肽包含seq id no:13的氨基酸序列，并且其中第二多肽包含seq id no:14的氨基酸序列。

6、在另一个方面，本发明提供一种与fap/4-1bb结合分子组合的pd-1靶向il-2变体免疫缀合物，其中该pd-1靶向il-2变体免疫缀合物包含i)seq id no:5或seq id no:6或seq id no:7的多肽序列，或ii)seq id no:5以及seq id no:6和seq id no:7的多肽序列，其中用于组合疗法的fap/4-1bb结合分子包含i)seq id no:15或seq id no:16或seq idno:17或seq id no:18的多肽序列，或ii)seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18的多肽序列。

7、在一方面，本发明提供了与fap/4-1bb结合分子组合的pd-1靶向il-2变体免疫缀合物，用于i)抑制肿瘤中的肿瘤生长；和/或ii)增强患有肿瘤的受试者的中位和/或总生存期；其中pd-1出现在免疫细胞(特别是为t细胞)上或出现在肿瘤细胞环境中，其中用于组合疗法的pd-1靶向il-2变体免疫缀合物的特征在于包含i)seq id no:1的重链可变结构域vh和seq id no:2的轻链可变结构域vl，以及seq id no:3的多肽序列，ii)seq id no:5或seqid no:6或seq id no:7的多肽序列，或iii)seq id no:5、seq id no:6和seq id no:7的多肽序列，并且用于组合疗法的fap/4-1bb结合分子的特征在于包含i)第一抗原结合部分，其包含seq id no:11的重链可变结构域vh和seq id no:12的轻链可变结构域vl；和第二抗原结合部分，其包含通过二硫键相互连接的第一和第二多肽，其中第一多肽包含seq id no:13的氨基酸序列且其中第二多肽包含seq id no:14的氨基酸序列；ii)seq id no:15或seqid no:16或seq id no:17或seq id no:18的多肽序列；或iii)seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18的多肽序列。

8、在一方面，本发明提供了与fap/4-1bb结合分子组合的pd-1靶向il-2变体免疫缀合物，其中用于组合疗法的pd-1靶向il-2变体免疫缀合物的特征在于包含seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3的多肽序列，并且其中用于组合疗法的fap/4-1bb结合分子的特征在于包含seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18的多肽序列。

9、在另一方面，本发明提供了与fap/4-1bb结合分子组合的pd-1靶向il-2变体免疫缀合物，其中该组合进一步包含施用抗cea/抗cd3双特异性抗体。

10、在另一优选方面，该抗cea/抗cd3双特异性抗体是赛必妥单抗。

11、在一方面，本发明提供了与fap/4-1bb结合分子组合的pd-1靶向il-2变体免疫缀合物，其中该患者是经免疫疗法治疗或经过免疫疗法预先治疗或预处理。在另一方面，该免疫疗法包含过继细胞转移、施用单克隆抗体、施用细胞因子、施用癌症疫苗、t细胞接合疗法或其任何组合。

12、在另一方面，本发明提供与fap/4-1bb结合分子组合的pd-1靶向il-2变体免疫缀合物，其中过继细胞转移包括施用嵌合抗原受体表达t细胞(car t细胞)、t细胞受体(tcr)、经修饰的t细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、嵌合抗原受体(car)修饰的自然杀伤细胞、t细胞受体(tcr)转导细胞或树突状细胞或其任何组合。