用于不同类型癌症免疫治疗的HLA展示肽的制作方法

背景技术：

1、根据世界卫生组织(who)，癌症列于2012年全球范围内四大非传染性致命疾病之一。同年，结直肠癌、乳腺癌和呼吸道癌症在高收入国家被列为前10位死亡原因内。

2、考虑到治疗癌症相关的严重副作用和费用，有必要确定可用于治疗癌症的因子。

3、也有必要确定代表癌症生物标志物的因子，从而更好地诊断癌症、评估预后和预测治疗成功性。

4、癌症免疫治疗

5、癌症免疫治疗代表了特异性靶向癌症细胞的一个选择，同时最大限度地减少副作用。癌症免疫治疗利用存在的肿瘤相关抗原。

6、肿瘤相关抗原(taa)的目前分类包括以下主要的几组：

7、a)癌症-睾丸抗原：有史以来发现的第一个可以被t细胞识别的taa属于此类，最初称为癌症-睾丸(ct)抗原。由于睾丸细胞不表达hla i类和ii类分子，因而在正常组织中，这些抗原不能被t细胞识别，因此可认为在免疫学上具有肿瘤特异性。ct抗原的熟知实例是mage家族成员和ny-eso-1。

8、b)分化抗原：肿瘤和产生肿瘤的正常组织都含有这些taa。大多数已知的分化抗原发现于黑色素瘤和正常黑色素细胞中。实例包括但不仅限于黑色素瘤的酪氨酸酶和melan-a/mart-1或前列腺癌的psa。

9、c)过度表达的taa：在组织学上不同类型的肿瘤中以及许多正常组织中已经检测到了编码广泛表达的taa的基因，一般表达水平较低。有可能许多由正常组织加工和潜在提呈的表位低于t细胞识别的阈值水平，而它们在肿瘤细胞中的过度表达能够通过打破先前确立的耐受性而引发抗癌反应。这类taa的典型实例为her-2/neu、生存素、端粒酶或wt1。

10、d)肿瘤特异性抗原：这些独特的taa产生于正常基因(如β-连环蛋白、cdk4等)的突变。这些分子变化中有一些与致瘤性转化和/或进展相关。肿瘤特异性抗原一般可在不对正常组织带来自体免疫反应风险的情况下诱导强的免疫反应。另一方面，这些taa在多数情况下只与在其上确定有taa的确切肿瘤相关，并且通常在许多个体肿瘤之间并不共用。在蛋白质具有肿瘤特异性(相关性)同种型的情况下，如果肽源自肿瘤特异性(相关性)外显子，则也可能出现肽的肿瘤特异性(或相关性)。

11、e)肿瘤病毒蛋白：这些tta是病毒蛋白，可在致癌过程中发挥关键作用，并且由于它们是外源蛋白(非人源蛋白)，所以能够激发t细胞反应。这类蛋白的实例是人乳头状瘤16型病毒蛋白e6和e7，它们在宫颈癌中表达。

12、人内源性逆转录病毒(herv)构成了人基因组的显著部分(～8％)。这些病毒元件在数百万年前即已融合入基因组，并从那时起开始垂直世代传播。绝大多数herv通过突变或截短失去了功能活性，但是有些内源性逆转录病毒(如herv-k进化枝的成员)仍然编码功能基因，并被证明可形成逆转录病毒样颗粒。herv前病毒的转录受表观遗传程序控制，在正常生理条件下保持沉默。但是，已描述在某些疾病，特别是各类型癌症中有再激活和过度表达，导致病毒蛋白活性翻译。herv衍生蛋白的这种肿瘤特异性表达可用于不同类型的癌症免疫治疗。

13、f)由异常翻译后修饰产生的taa：此类taa可以由肿瘤中既不具有特异性也不过度表达的蛋白产生，但其仍然通过主要在肿瘤中有活性的翻译后加工具有肿瘤相关性。此类的实例产生自糖基化模式的改变(导致肿瘤中产生如muc1的新型表位)或在降解过程中的诸如蛋白剪接的事件(这些事件可以具有也可以不具有肿瘤特异性)。

14、基于t细胞的免疫治疗靶向由mhc分子提呈的来源于肿瘤相关性或肿瘤特异性蛋白的肽表位。肿瘤特异性t淋巴细胞所识别的抗原，即其表位，可以是源自所有蛋白类型的分子，如酶、受体、转录因子等，它们在相应肿瘤的细胞中被表达，并且与同源未变的细胞相比通常上调。

15、mhc分子有两类：mhc i类和mhc ii类。mhc i类分子由α重链和β-2-微球蛋白组成，mhc ii类分子由α链和β链组成。其三维构象形成结合槽，用于与肽进行非共价相互作用。

16、大部分有核细胞上都可发现mhc-i类分子。它们提呈主要为内源性蛋白、缺陷核糖体产物(drip)和较大肽的蛋白水解切割生成的肽。但是，源自内体隔室或外源性来源的肽也经常在mhc-i类分子上发现。这种i-类提呈的非经典方式在文献中被称为交叉提呈(brossart and bevan,1997；rock et al.,1990)。mhc ii类分子主要发现于专职性抗原提呈细胞(apc)上，并且主要提呈例如在内吞作用过程中由apc摄入并且随后被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。

17、肽和mhc i类的复合体由负载适当t细胞受体(tcr)的cd8-阳性t细胞识别，而肽和mhc ii类分子的复合体由负载适当tcr的cd4-阳性辅助t细胞识别。熟知tcr、肽和mhc由此按1:1:1的化学计算量而存在。

18、cd4-阳性辅助t细胞在诱导和维持cd8-阳性细胞毒性t细胞的有效反应中发挥重要作用。肿瘤相关抗原(taa)衍生的cd4-阳性t细胞表位的识别对开发能触发抗肿瘤免疫反应的药物产品非常重要。在肿瘤部位，t辅助细胞维持着对细胞毒性t细胞(ctl)友好的细胞因子环境并吸引效应子细胞，如ctl、天然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞和粒细胞。

19、在没有炎症的情况下，mhc ii类分子的表达主要局限于免疫系统细胞，尤其是专职性抗原提呈细胞(apc)，例如，单核细胞、单核细胞源性细胞、巨噬细胞、树突状细胞。在癌症患者中，已经发现肿瘤细胞表达mhc ii类分子(dengjel et al.,2006)。

20、本发明的延长(较长)肽可作为mhc ii类活性表位。

21、mhc-ii类表位激活的辅助t细胞在调控抗肿瘤免疫的ctl效应子功能中发挥着重要作用。触发th1类型的t辅助细胞反应的辅助t细胞表位支持cd8阳性杀伤t细胞的效应子功能，其包括以肿瘤细胞为目标的细胞毒性功能(在该肿瘤细胞表面展示有肿瘤相关肽-mhc复合体)。以这种方式，肿瘤相关t辅助细胞肽表位单独地或与其他肿瘤相关肽联合可作为刺激抗肿瘤免疫反应的疫苗组合物的活性药物成分。

22、由于hla ii类分子的组成性表达通常限于免疫细胞，因此，直接从原发肿瘤中分离ii类肽在之前被认为是不可能的事。然而，dengjel等人成功地从肿瘤中直接鉴定了多个mhc ii类表位(wo 2007/028574,ep 1 760 088b1，其内容通过引用以其整体并入本文)。

23、对于mhc i类肽触发(引发)细胞免疫反应，其也必须与mhc分子结合。这一过程依赖于mhc分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特异多态性。mhc-i类结合肽的长度通常为8-12个氨基酸残基，并且在其与mhc分子的相应结合槽相互作用的序列中通常包含两个保守残基(“锚”)。以这种方式，每个mhc的等位基因都有“结合基序”，从而确定哪些肽能与结合槽特异性结合。

24、在mhc i类依赖性免疫反应中，肽不仅必须能与由肿瘤细胞表达的某些mhc-i类分子结合，而且之后它们还必须能被负载特异性tcr的t细胞识别。

25、对于被t淋巴细胞识别为肿瘤特异性抗原或相关性抗原以及用于治疗的蛋白质，必须具备特殊的条件。所述抗原应主要由肿瘤细胞表达，而不由正常健康组织表达或表达相对较少量。与正常健康组织相比，肿瘤细胞过度提呈肽可以是有利的。更为适宜的情况是，该相应抗原不仅存在于一种类型的肿瘤中，而且浓度(即每个细胞的相应肽拷贝数目)亦高。因为它们例如在细胞周期控制或凋亡抑制中的功能，肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原往往是源自直接参与正常细胞向肿瘤细胞转化的蛋白。另外，直接导致转化的蛋白的下游靶标可能会被上调，因此可能与肿瘤间接相关。这些间接的肿瘤相关抗原也可以是预防接种方法的靶标(singh-jasuja et al.,2004，其内容通过引用以其整体并入本文)。至关重要的是，表位存在于抗原的氨基酸序列中，以确保这种源自肿瘤相关抗原的肽(“免疫原性肽”)可导致体外或体内t细胞反应。

26、taa可以是开发基于t细胞的免疫治疗的起点。识别和表征taa的方法通常基于可分离自患者或健康对象的t细胞的使用，或基于肿瘤与正常组织之间差别转录特性或差别肽表达模式的产生。但是，识别肿瘤组织或人肿瘤细胞系中过度表达的基因或在这类组织或细胞系中选择性表达的基因，不能提供免疫疗法中使用这些基因所转录抗原的准确信息。这是因为，由于相应tcr的t细胞必须要存在而且对这个特定表位的免疫耐受性需要不存在或为最低，因此，这些抗原的表位只有个别亚群适合这种应用。

27、在通过根据本发明的特定tcr(例如可溶性tcr)和抗体或其他结合分子(支架)靶向肽-mhc的情况下，潜在肽的免疫原性是次要的。在这些情况下，提呈是决定因素。

技术实现思路

1、第一方面，本发明涉及一种肽或其药学上可接受的盐，其包含选自由seq id no 1至seq id no 216及其变体序列(该变体序列与mhc分子结合和/或诱导t细胞与所述变体肽交叉反应)组成的组中的氨基酸序列。

2、下表(表1a)显示了根据本发明的肽及其各自的seq id no。

3、表1a：根据本发明的肽及其各自的seq id no。

4、

5、

6、表1b：根据本发明的肽。

7、 seq id no 序列 217 elagigiltv 218 yllpaivhi

8、本发明总体上进一步涉及根据本发明所述的肽用于治疗增殖性疾病。该背景下的增殖性疾病为：例如，急性髓性白血病、乳腺癌、胆管细胞癌、慢性淋巴细胞白血病、结直肠癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管交界癌、肝细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌和子宫内膜癌。

9、特别优选为根据本发明所述的肽(单独或组合)，其选自由seq id no:1至seq idno:216组成的组。

10、因此，本发明的另一方面涉及根据本发明所述的肽(优选为组合)治疗增殖性疾病的用途。

11、本发明进一步涉及根据本发明所述的肽，其具有与mhc i类分子或以延长形式(例如长度变体)与mhc-ii类结合的能力。

12、本发明进一步涉及延长的肽，其在给药(例如作为疫苗)后可在细胞内加工，产生由或基本上由根据seq id no:1至seq id no:216的氨基酸序列组成的较短肽，然后由hla提呈于细胞表面。

13、本发明进一步涉及本发明中的肽，其中所述肽(每种肽)由或基本上由根据seq idno 1至seq id no 216的氨基酸序列组成。

14、本发明进一步涉及根据本发明所述的肽，其中所述肽包含非肽键。

15、本发明进一步涉及本发明的肽，其中所述肽为融合蛋白的一部分，特别是与hla-dr抗原相关不变链(ii)的n-端氨基酸融合，或与抗体(例如，树突状细胞特异性抗体)或抗体的序列融合。

16、本发明进一步涉及一种核酸，其编码根据本发明的肽。本发明进一步涉及为dna、cdna、pna、rna或其组合的本发明的核酸。

17、本发明进一步涉及一种表达载体，其能够表达和/或表达本发明的核酸。

18、本发明进一步涉及本发明的肽、本发明的核酸或本发明的表达载体用于治疗疾病及用于药物中，特别是用于治疗癌症。

19、本发明进一步涉及对本发明肽或本发明肽与mhc的复合体具有特异性的抗体以及制备这些抗体的方法。

20、本公开还可以涉及产生与肽复合的mhc i类分子特异性结合的抗体的方法，所述肽包含根据seq id no:1至seq id no:216的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，该方法包括用肽复合的可溶性形式mhc i类分子对含有表达所述mhc i类分子的细胞的基因工程改造非人哺乳动物进行免疫，所述肽由或基本上由根据seq id no:1至seq id no:216的氨基酸序组成)；从所述非人哺乳动物的抗体产生细胞中分离出mrna分子；产生噬菌体展示文库，其展示由所述mrna分子编码的蛋白分子；以及从所述噬菌体展示文库分离出至少一种噬菌体，其中所述至少一种噬菌体展示特异性结合肽复合的所述mhc i类分子的所述抗体，所述肽包含根据seq id no:1至seq id no:216的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成。另一方面，抗体可以为单克隆抗体。

21、一方面，抗体可以与抗原复合的所述mhc i类分子结合，所述抗原包含根据seq idno:1至seq id no:216的氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成，其中结合亲和力(kd)为<100nm，更优选为<50nm，更优选为<10nm，更优选为<1nm，更优选为<0.1nm，更优选为<0.01nm。

22、另一方面，产生抗体的方法还可包括将抗体人源化。在一些方面，产生抗体的方法可进一步包括将抗体与毒素缀合。另一方面，产生抗体的方法还可包括将抗体与免疫刺激结构域缀合。

23、一方面，产生抗体的方法可进一步包括将抗体修饰为双特异性抗体形式。另一方面，产生抗体的方法可进一步包括将抗体修饰为嵌合抗体形式。另一方面，产生抗体的方法可进一步包括将抗体修饰为fv形式。一方面，产生抗体的方法可进一步包括将抗体修饰为fab形式。另一方面，产生抗体的方法可进一步包括将抗体修饰为fab'形式。另一方面，产生抗体的方法可进一步包括用放射性核苷酸标记抗体，所述放射性核苷酸可选自由111in、99tc、14c、131i、3h、32p和35s组成的组。另一方面，非人类哺乳动物可以为小鼠。

24、本发明进一步涉及tcr，特别是可溶性tcr和改造至自体或异体t细胞中的克隆tcr，以及制备这些tcr以及载有所述tcr或与所述tcr发生交叉反应的nk细胞或其他细胞的方法。可溶性tcr的结合亲和力(kd)可以为<100nm，更优选为<50nm，更优选为<10nm，更优选为<1nm，更优选为<0.1nm，更优选为<0.01nm。而基于克隆细胞的tcr的结合亲和力(kd)可以为<50μm，更优选为<25μm，更优选为<10μm，更优选为<1μm，更优选为<0.1μm。

25、抗体和tcr是根据本发明的肽现有免疫治疗用途的另外实施方案。

26、本发明进一步涉及一种宿主细胞，其包含根据本发明的核酸或前述的表达载体。本发明进一步涉及本发明的宿主细胞，其为抗原提呈细胞，优选为树突状细胞。

27、本发明进一步涉及根据本发明的方法，其中通过使足够量的抗原与抗原提呈细胞接触来将抗原载入表达于合适抗原提呈细胞或人工抗原提呈细胞的表面的mhc i类或ii类分子。

28、本发明进一步涉及根据本发明的方法，其中该抗原提呈细胞包含表达载体，该表达载体有能力表达包含seq id no:1至seq id no:216的所述肽。

29、本发明进一步涉及通过本发明方法产生的激活t细胞，其中所述t细胞有选择性地识别细胞，所述细胞表达包含本发明氨基酸序列的多肽。

30、本发明进一步涉及一种杀伤患者靶细胞的方法，其中患者的靶细胞异常表达包含本发明任何氨基酸序列的多肽，所述方法包括向患者施用按本发明制备的有效数量的t细胞。

31、本发明进一步涉及任何所述肽、本发明的核酸、本发明的表达载体、本发明的细胞、本发明的激活t淋巴细胞、tcr或抗体或其他肽和/或肽-mhc结合分子作为药剂或制备药剂的用途。所述药剂优选为具有抗癌活性。优选地，所述药剂为基于可溶性tcr或抗体的细胞疗法、疫苗或蛋白质。

32、本发明进一步涉及根据本发明的用途，其中所述癌症为急性髓性白血病、乳腺癌、胆管细胞癌、慢性淋巴细胞白血病、结直肠癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管交界癌、肝细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌和子宫内膜癌，优选为急性髓性白血病、乳腺癌、胆管细胞癌、慢性淋巴细胞白血病、结直肠癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管交界癌、肝细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌和子宫内膜癌细胞。

33、本发明进一步涉及基于根据本发明肽的生物标志物，本文称为“靶标”，其可用于诊断癌症，癌症优选为急性髓性白血病、乳腺癌、胆管细胞癌、慢性淋巴细胞白血病、结直肠癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤、胃癌、胃食管交界癌、肝细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、膀胱癌和子宫内膜癌。所述标志物可为肽本身过度提呈或相应基因过度表达。标志物也可以用于预测治疗成功的可能性，优选为免疫疗法，最优选为靶向所述生物标志物识别的相同靶标的免疫疗法。例如，抗体或可溶性tcr可用于染色肿瘤切片以检测与mhc复合的感兴趣肽的存在。

34、可选地，抗体携带另外的效应子功能，如免疫刺激结构域或毒素。

35、本发明进一步涉及这些新靶标在癌症治疗中的用途。

36、还提供了一种或多种延长的肽，其在给药(例如作为疫苗)后可在细胞内加工，产生由或基本上由根据seq id no:1至seq id no:216的氨基酸序列组成的较短肽，然后由hla提呈于细胞表面。

37、在一些实施方案中，提供本文公开的肽作为化学合成肽。例如，可以通过固相合成来合成所述肽。

38、在一些实施方案中，提供本文公开的肽作为重组肽。例如，可以由表达该肽的重组宿主细胞分泌所述肽。在这样的实施方式中，可以将所述肽从包含所述细胞的培养基中分离出来。在这样的实施方案中，可以沉淀细胞，并收集上清液以分离所述肽。在一些实施方案中，所述肽可以在重组宿主细胞中被表达而不被分泌。在这样的实施方案中，可以从所述细胞分离出所述肽。