可注射缓冲水凝胶的制作方法

本发明涉及包含聚合物胶凝剂的可注射液体水凝胶制剂，其在与水性辅助组合物交联后产生弹性和缓冲水凝胶，其还包含有利于应力松弛的可逆交联。这些缓冲水凝胶可用于预防和治疗骨关节炎。

背景技术：

1、脊椎动物中的关节(join或articulation)是骨骼的骨之间的连接。滑膜关节，诸如踝关节、膝关节和手指关节，能够传递垂直于其表面的巨大力，并沿其进行实质上几乎无摩擦的运动。这是通过覆盖骨末端的软骨和润滑关节并包含在柔性膜内的滑膜的存在来实现的。与骨相反，软骨不含神经，因此负载和滑动不会引起任何疼痛。软骨由蛋白聚糖、胶原蛋白和软骨细胞(软骨内的细胞)构成。这些细胞承受全方位的液压并且几乎没有任何剪切(扭曲)应力。在这些条件下，它们会产生新的胶原蛋白和蛋白聚糖来修复微损伤。

2、软骨可能因创伤、严重过度使用和/或炎症而受损。如果基质受损(最常见的是胶原蛋白失效)，蛋白聚糖就会被释放并且软骨内的液压就会丧失。软骨内的软骨细胞体积缩小，并承受来自关节负载的更直接的力，从而产生扭曲应变。结果，它们失去了球形形状并变得拉长，从而引发细胞反应，导致炎症并产生进一步分解基质的酶。这种退化的恶性循环可能会在不被注意的情况下发展数年，直到最终整个关节软骨层被分解至下面的骨；一种称为骨关节炎的痛苦病症，这是最常见的关节疾病类型。

3、尽管骨关节炎是多因素疾病，涉及滑膜炎症和软骨基质退化，但越来越多的人认为机械创伤是(非常)大部分患者中疾病的原因。发明人发现机械创伤导致关节软骨中放射学上不可见但机械上可测量的瘀伤。在此类软骨瘀伤中，撞击区域比邻近软骨软50-90％，因为ii型胶原蛋白网络因撞击而被破坏，并且水结合蛋白聚糖被释放，从而降低了软骨基质的静水压力。来自额外创伤或仅仅来自日常活动的进一步负载，使软骨陷入基质损伤、水分流失、软骨细胞剪切负载增加、炎症和分解代谢基因表达以及随后基质进一步分解的恶性循环。这会导致瘀伤面积扩大以及软骨质量恶化。通常情况下，这种退化的恶性循环需要10-15年的时间才会变得疼痛并在临床上变得明显，然后才发现软骨已经恶化到无法再做任何事情来治愈关节的程度，并且需要进行侵入性和毁损性手术。由于高机械负载会刺激软骨退化，抑制这种机械负载可以减少其破坏性刺激。如d.l.bader等人,arthritis,2011,2011,979032所示，静水压力的恢复驱动软骨细胞进入合成代谢、基质产生模式，这可以再生因创伤而引起的损伤。另一方面，完全去负载会导致软骨废用性萎缩，这表明软骨再生需要特定的机械负载机制，这是软骨负载和去负载之间的权衡。

4、因此，需要一种合适的材料来减轻关节软骨的机械负载，但又不会导致关节完全去负载。此外，该材料应恢复软骨细胞周围的静水压力，从而刺激它们产生新的基质并治愈受损的软骨组织。这种植入物通过提供机械环境，该环境通过关节负载消除高剪切应力并且反而缓冲受损软骨并刺激软骨组织愈合，从而防止创伤性软骨瘀伤进展为有症状的骨关节炎。显然，用于这种植入物的材料应该能够耗散能量(以便分散和减少瘀伤软骨上的负载)，能够承受大的负载力而不失效(以便用于日常生活活动中的承重关节)，是可注射的(以便使干预是微创的)，并且在一定时间内可生物降解(以便临时预防或治疗并且消除长期免疫性异物反应的风险)。

5、目前骨关节炎的治疗集中于临时抑制症状——例如通过口服或局部止痛药——直到症状严重到只有手术融合或关节置换才能缓解。

6、阻止、减缓或逆转软骨退化的恶性循环的可能性有限。此外，据发明人所知，没有可用于预防或治疗引发软骨退化恶性循环的第一(创伤性)局灶性(骨)软骨(微)损伤的技术。

7、此前，患有膝骨关节炎的患者接受了外部牵引装置，该装置减轻膝关节的机械负载，同时保持其活动能力。经过一年的随访，这些患者中大多数人的关节中都长出了新的关节软骨，从而带来了显著的临床益处(减轻疼痛，提高生活质量)，如k.wiegant等人,osteoarthritis cartilage,21,2013,pp 1660-1667所表明的那样。虽然关节牵引对膝关节提供了良好的结果，但使用外部牵引器是一种不方便的治疗方法，并且存在相当大的感染风险。此外，与膝关节牵引相比，其它关节(例如踝)的外部牵引似乎更成问题(e.c.rodriguez-merchan.,arch.bonejt.surg.,5,2017,pp 208-212)。

8、正在研究的另一种治疗方法是使用人源细胞和/或蛋白质对新软骨进行组织工程。wo2011/059325a2(通过引用并入本文)公开了包含接枝有酪胺修饰的葡聚糖的透明质酸的可注射水凝胶，其原位交联并且可以负载有能够产生新软骨的活细胞，其中基于多糖的水凝胶由于透明质酸酶的酶促水解而容易降解(1-3周)。

9、e.jooybar等人,acta biomat.83,2019,pp 233-244(通过引用并入本文)公开了例如包含接枝有酪胺修饰的葡聚糖的透明质酸的可注射水凝胶，其原位交联。所公开的水凝胶还包含从人外周血获得的血小板裂解物和人骨髓来源的间充质干细胞(hmsc)，并且显示可用于新软骨的组织工程，其中水凝胶在一周内被透明质酸酶降解。因此，这些水凝胶充当临时软骨替代品，填充软骨缺陷并释放药物以增强软骨再生。

10、水凝胶可以表征为聚合物链的三维网络，其可以吸收极性溶剂，诸如水。它们可用于水管理和医疗应用中，包括骨移植、组织粘合剂、药物递送系统和药品。水凝胶可以以交联形式或以非交联形式存在。由于聚合物链的分子活动性受到强烈限制，交联通常会提供更硬的凝胶。交联可以通过形成共价键(永久)以化学方式实现，或可以通过形成可逆键(动态)(例如氢键或离子相互作用)以物理方式实现。显然，交联也可以通过化学和物理手段二者来实现。基于氢键合的可逆键的一个实例是脲基嘧啶酮衍生物的二聚体(4h单元的实例)。

11、wo2006/118460a1(通过引用并入本文)公开了包含水胶凝剂的超分子水凝胶材料，所述水胶凝剂由亲水性聚合物组成，至少两个4h单元通过氨基甲酸乙酯-烷基部分共价连接至所述亲水性聚合物。然而，这些可逆氢键合的水凝胶材料的强度不足以满足多种应用的需要，并且它们在生物医学相关温度的粘度太高，无法通过液体处理技术(例如通过注射器注射)进行施用。

12、ep1972661a1(通过引用并入本文)公开了在亲水性聚合物中包含4h单元以及脲键合基序的超分子水凝胶。这些水凝胶由于其超分子性质且水凝胶中不存在共价交联而具有热可逆性。然而，当例如体内存在过量的水时，它们的可逆性质也可能导致凝胶溶解。

13、m.m.c.bastings等人,adv.healthcare mat.,3,2014,pp 70-78(其全部内容通过引用并入本文)公开了ep1972661a1的具体实施方案的水凝胶，其由具有4h单元端基的10.000da的聚(乙二醇)组成，只有在溶解于ph高于8.5的强碱性水溶液中才可注射，这不利于生物医学应用。此外，所得水凝胶的弹性强度非常有限，仅用于心肌内的药物递送。

14、p.y.w.dankers等人,adv.mater.,24,2012,pp 2703-2709(其全部内容通过引用并入本文)公开了基于ep1972661a1的具体实施方案的瞬时水凝胶网络，其是由用4h单元末端官能化的聚乙二醇组成的超分子聚合物。这些水凝胶4h单元的瞬时性质再次导致软水凝胶。此外，研究表明，这些载药水凝胶在体外和体内均在数天内溶解，从而阻止了它们在需要长(数周或数月)停留时间的承载应用中的使用。

15、us10358521b1(通过引用并入本文)公开了包含4h单元和化学可交联部分的粘合剂可注射水凝胶，其对组织具有粘合性质，在25℃粘合搭接剪切强度为至少10kpa，杨氏模量小于100kpa。据公开，该水凝胶可用于生物医学或美容产品，用于受控药物递送、组织工程、伤口护理、组织粘附，或用作组织密封剂、人造软骨材料、心脏贴片、透皮贴片、心血管结构和用于医疗装置的涂层。作为人造软骨材料的应用需要将粘性水凝胶注射到或进入现有受损或退化的软骨中，其中水凝胶粘附到软骨上，诸如内部裂缝或其它缺陷。通常，在应用人造软骨材料之前，需要先对受损的软骨进行调理。这种预调理可能需要手术。仅仅注射粘合剂水凝胶不会产生(人造)软骨材料。需要将粘合剂水凝胶与启动软骨生长所需的生物添加剂(诸如，例如干细胞、自体软骨细胞或富含血小板的血浆(prp))一起注射到或进入现有受损或退化的软骨中。

16、从h.wang等人,adv.mat.,27,2015,pp 3717-3736可见，适应性水凝胶(包含可逆交联的水凝胶)是用于组织生长的有前途的平台。通过破坏和重新形成可逆连接(诸如4h单元)，适应性水凝胶可以进行局部修饰，以允许复杂的细胞功能，同时保持其长期完整性并提供功能性组织生长所需的机械诱因。这与永久性(水凝胶)材料形成鲜明对比。此外，这些适应性材料可以具有仿生粘弹性性质，使其非常适合需要形成新组织的医疗应用。特别是，这种水凝胶的特定粘弹性性质似乎是调节细胞行为的一个因素，如c.correia等人tissueengin.a 18,2012,pp 1979-1991用于人类间充质干细胞的分化中所示。这种分化是所研究的水凝胶的粘弹性性质的直接结果，其诱导分子细胞分化因子的表达增加。此外，c.correia等人tissue engin.a 18,2012,pp 1979-1991中已经表明，当人鼻软骨细胞被封装在体外热可逆多糖水凝胶中时，通过以频率和振幅依赖的方式增强软骨组织发育，可以检测和响应物理力，从而类似于关节负载。

17、由于目前骨关节炎治疗的缺点，需要改进的微创治疗。

18、因此，本发明的一个目的是提供用于治疗或预防脊椎动物中的骨关节炎的改进的和/或微创的方法，其中所述方法优选不需要植入固体装置、使用外部牵引装置和/或施用组织来源的活性成分。

19、本发明的另一个目的是提供用于治疗或预防脊椎动物中的骨关节炎的改进的和/或微创的方法中使用的组合物，其中所述组合物优选不包含组织来源的活性成分。

20、本发明的又一个目的是提供用于治疗或预防脊椎动物中的骨关节炎的改进的和/或微创的方法，以及用于这些方法中的组合物，其中骨关节炎的所述治疗和预防包括预防处于发展骨关节炎风险的脊椎动物中的软骨的初始(微)损伤，其中仅存在对软骨的初始(微)损伤的亚临床阶段直至其中软骨退化已经发生的症状阶段。

技术实现思路

1、本发明人出乎意料地发现，在脊椎动物的滑膜关节腔中形成某些水凝胶在所述滑膜腔的关节表面之间提供了缓冲垫或缓冲作用，从而分散和减少关节接触负载，使得保留软骨组织以防止进一步损伤和/或诱导软骨组织再生。此外，这会导致内部牵引，而无需借助于/使用其它产品或装置。这些水凝胶可以有效吸收关节表面之间的冲击，因为它们具有高弹性并且能够很好地消散应力。这是由于水凝胶中存在由掺入部分介导的可逆氢键合的交联。此外，由生理关节力负载的缓冲垫产生静水压力，其促进包含胶原蛋白、蛋白聚糖和非胶原蛋白的软骨细胞的基质沉积。

2、通过这种方式，可以防止局灶性(骨)软骨(微)损伤的发生。当局灶性(骨)软骨(微)损伤已经存在时，本发明确保减轻疼痛并防止或减少进一步的软骨退化。

3、将这些水凝胶的液体前体施用到滑膜关节腔可以通过微创技术在创伤或超载之后立即进行，或者甚至在预期损伤之前进行。这种水凝胶的液体前体也可以施用到已经退化的骨关节炎滑膜关节的腔内。在这种情况下，所产生的缓冲可以极大地有助于减轻疼痛并减少或防止进一步的软骨退化。

4、因此，本文公开的医学用途可应用于如图1所示的骨关节炎发展的所有三个阶段(a)、(b)和(c)。

5、这些水凝胶在脊椎动物滑膜关节腔内显示出有限的生物降解性，并且不粘附于软骨材料。此外，这些水凝胶包含化学和/或物理交联，优选化学和物理交联。

6、因此，在第一方面，本发明提供了一种用于治疗或预防脊椎动物中的骨关节炎的试剂盒(kit of parts)，其由在各自容器中的组合物(c1)和(c2)组成，其中：

7、(a)组合物(c1)是液体水凝胶制剂，其包含基于组合物(c1)的重量50.0-99.7重量％的水、0.3-50.0重量％的根据式(viii)的聚合物胶凝剂和0-20重量％的其它成分：

8、

9、其中：

10、·m和n各自独立地为1至20范围内的整数；

11、·a为选自0或1的整数；

12、·k为选自酰胺、酯或醚的连接基团；

13、·e为在水性辅助制剂(c2)中可以与另一基团e由一种或多种化合物y引发或介导而反应的基团，其中所述一种或多种化合物y选自由氧化剂、氧化酶、过氧化物酶及其组合组成的组，从而在不同基团e之间形成一个或多个共价键，或者e为在水性辅助制剂(c2)中可以与一种或多种交联剂z反应的基团，其中所述一种或多种交联剂z具有两个或更多个反应性基团，从而在e和所述一种或多种交联剂z之间形成共价键；

14、·pol为直链聚合物基团，其通过端基滴定测定的平均分子量mn为约250至约30000da；

15、·a代表选自由式(i-b)至(v-b)组成的组的部分，其中a通过标有星号的键连接至l：

16、

17、·x为n或cr1；

18、·每个l独立地为氨基甲酸乙酯或脲连接基团，条件是根据式(i-b)和(ii-b)的任何部分a总是与4-嘧啶酮的2-位上的脲连接基团l偶联，根据式(iii-b)和(iv-b)的任何部分a对于x＝n总是与1,3,5-三嗪的4-位上的脲连接基团l偶联，或对于x为cr1总是与嘧啶的2-位上的脲连接基团l偶联，并且根据式(v-b)的任何部分a总是与两个脲连接基团l偶联；

19、·r1选自由氢和c1-c20烷基组成的组；

20、·r2选自由c1-c20亚烷基组成的组；

21、·r3选自由直接共价键、直链c1-c24亚烷基基团、支化c2-c24亚烷基基团、环状c3-c24亚烷基基团、c6-c24亚芳基基团、c7-c24亚烷芳基基团和c7-c24芳基亚烷基基团组成的组，其中所述亚烷基基团、亚芳基基团、亚烷芳基基团和芳基亚烷基基团任选地包含1-5个选自由o、n和s组成的组的杂原子；并且

22、·r4选自由直链或支化c2-c20亚烷基基团和环状c3-c24亚烷基基团组成的组；并且

23、(b)组合物(c2)是水性辅助制剂，其包含基于组合物(c2)的重量75.0-99.9重量％的水、0-5重量％的其它成分和0.1-20重量％的：

24、·一种或多种溶解的交联剂z，其具有两个或更多个反应性基团，所述两个或更多个反应性基团可以通过与两个或更多个基团e形成共价键来化学交联根据式(viii)的聚合物胶凝剂；或

25、·一种或多种溶解的化合物y，其选自由氧化剂、氧化酶、过氧化物酶及其组合组成的组，其引发或介导根据式(viii)的聚合物胶凝剂上的两个或更多个基团e的化学交联；

26、其中所述治疗包括将组合物(c1)和(c2)组合以形成液体水凝胶组合物(c3)，并将所述液体水凝胶组合物(c3)施用于所述脊椎动物的滑液或滑膜关节腔，以在所述脊椎动物的所述滑膜关节腔内形成交联水凝胶(c4)。

27、在第二方面，本发明涉及一种用于治疗或预防脊椎动物中的骨关节炎的试剂盒，其由在各自容器中的组合物(c1)和(c2)组成，其中：

28、(a)组合物(c1)是液体水凝胶制剂，其包含基于组合物(c1)的重量50.0-99.7重量％的水、0.3-50.0重量％的根据式(viii)的聚合物胶凝剂和0-20重量％的其它成分：

29、

30、其中：

31、·m和n各自独立地为1至20范围内的整数；

32、·a为选自0或1的整数；

33、·k为选自酰胺、酯或醚的连接基团；

34、·e为在水性辅助制剂(c2)中可以与另一基团e由一种或多种化合物y引发或介导而反应的基团，其中所述一种或多种化合物y选自由氧化剂、氧化酶、过氧化物酶及其组合组成的组，从而在不同基团e之间形成一个或多个共价键，或者e为在水性辅助制剂(c2)中可以与一种或多种交联剂z反应的基团，其中所述一种或多种交联剂z具有两个或更多个反应性基团，从而在e和所述一种或多种交联剂z之间形成共价键；

35、·pol为直链聚合物基团，其通过端基滴定测定的平均分子量mn为约250至约30000da；

36、·a代表选自由式(i-b)至(v-b)组成的组的部分，其中a通过标有星号的键连接至l：

37、

38、·x为n或cr1；

39、·每个l独立地为氨基甲酸乙酯或脲连接基团，条件是根据式(i-b)和(ii-b)的任何部分a总是与4-嘧啶酮的2-位上的脲连接基团l偶联，根据式(iii-b)和(iv-b)的任何部分a对于x＝n总是与1,3,5-三嗪的4-位上的脲连接基团l偶联，或对于x为cr1总是与嘧啶的2-位上的脲连接基团l偶联，并且根据式(v-b)的任何部分a总是与两个脲连接基团l偶联；

40、·r1选自由氢和c1-c20烷基组成的组；

41、·r2选自由c1-c20亚烷基组成的组；

42、·r3选自由直接共价键、直链c1-c24亚烷基基团、支化c2-c24亚烷基基团、环状c3-c24亚烷基基团、c6-c24亚芳基基团、c7-c24亚烷芳基基团和c7-c24芳基亚烷基基团组成的组，其中所述亚烷基基团、亚芳基基团、亚烷芳基基团和芳基亚烷基基团任选地包含1-5个选自由o、n和s组成的组的杂原子；并且

43、·r4选自由直链或支化c2-c20亚烷基基团和环状c3-c24亚烷基基团组成的组；并且

44、(b)组合物(c2)是水性辅助制剂，其包含基于组合物(c2)的重量75.0-99.9重量％的水、0-5重量％的其它成分和0.1-20重量％的：

45、·一种或多种溶解的交联剂z，其具有两个或更多个反应性基团，所述两个或更多个反应性基团可以通过与两个或更多个基团e形成共价键来化学交联根据式(viii)的聚合物胶凝剂；或

46、·一种或多种溶解的化合物y，其选自由氧化剂、氧化酶、过氧化物酶及其组合组成的组，其引发或介导根据式(viii)的聚合物胶凝剂上的两个或更多个基团e的化学交联；

47、其中所述治疗包括在第一步骤中向所述脊椎动物的滑液或滑膜关节腔施用组合物(c1)或(c2)中的一种，优选组合物(c1)，并且在第二步骤中施用组合物(c1)或(c2)中的另一种，以在所述脊椎动物的所述滑膜关节腔中形成液体水凝胶组合物(c3)，其反应成交联水凝胶(c4)。

48、在第三方面，本发明涉及用于治疗或预防脊椎动物中的骨关节炎的试剂盒，其由可注射水凝胶(‘组合物c5’)组成，其中所述治疗包括将可注射水凝胶施用至脊椎动物的滑液或滑膜关节腔，之后其形成包含化学和/或物理交联的交联水凝胶，其中物理交联选自氢键合、离子相互作用、疏水相互作用和范德华力，其中化学交联是通过自缩合或通过不同官能团之间的反应而形成的共价键，并且其中可注射水凝胶包含50.0-99.7重量％的水和0.3-50.0重量％的亲水性聚合物，所述亲水性聚合物是交联水凝胶的前体。