用于低疏水性生物活性药物进入中枢神经系统的化学偶联转运体的制作方法

本发明总体涉及用作药物载体的化学偶联化合物。更具体地，本发明涉及用于治疗神经退行性疾病的此类化合物。具体而言，本发明涉及化合物，其包含通过接头与用于治疗神经退行性疾病的低疏水性生物活性分子共价偶联的经修饰的四环素衍生物。更具体地，本文公开的药物载体化合物已被证明在体外神经退行性疾病、特别是帕金森病(pd)的实验模型中是有用和有效的。

背景技术：

1、神经退行性疾病是一组异质性疾病，其特征是中枢或外周神经系统神经元的选择性易损群体的进行性丧失。由于患神经退行性疾病的主要风险因素是年龄，人类寿命的增加使这些疾病成为发达国家卫生保健系统的关键挑战。事实上，根据一项仅对阿尔茨海默病进行的系统研究，仅在美国就有770万人受到影响，预计到2050年，这一数字将上升到1350万。此外，英国痴呆症护理的实际支出几乎与癌症、心脏病和中风的综合成本相当。这突出了对有效的神经保护疗法的迫切需求，以避免在不久的将来医疗保健系统的崩溃。

2、尽管临床表现不同，但不同的神经退行性疾病在亚细胞水平上有许多相似之处，包括淀粉样蛋白聚集(stefani m,dobson cm.protein aggregation and aggregatetoxicity:new insights into protein folding,misfolding diseases and biologicalevolution.j mol med.2003；81(11):678-99；murphy rm.peptide aggregation inneurodegenerative disease.annu rev biomed eng.2002；4:155-74；duda je,lee vm,trojanowski jq.neuropathology of synuclein aggregates.j neurosci res.2000；61(2):121-7)、神经炎症(a,gallea ji,sarroukh r,celej ms,ruysschaert jm,raussensv.amyloid fibrils are the molecular trigger ofinflammation in parkinson'sdisease.biochem j.2015；471(3):323-33.doi:10.1042/bj20150617)、氧化应激((pukassk,richter-landsberg c.oxidative stress promotes uptake,accumulation,andoligomerization of extracellular alpha-synuclein in oligodendrocytes.j molneurosci.2014；52(3):339-52.doi:10.1007/s12031-013-0154-x；bieschke j,zhang q,powers et,lerner ra,kelly jw.oxidative metabolites accelerate alzheimer'samyloidogenesis by a two-step mechanism,eliminating the requirement fornucleation.biochemistry.2005；44(13):4977-83)和线粒体功能障碍(nakamurak.alpha-synuclein and mitochondria:partners in crime？neurotherapeutics.2013；10(3):391-9.doi:10.1007/s13311-013-0182-9；hsu lj,sagara y,arroyo a,rockenstein e,sisk a,mallory m,et al.alpha-synuclein promotes mitochondrialdeficit and oxidative stress.am j pathol.2000；157(2):401-10.epub 2000/08/10.doi:10.1016/s0002-9440(10)64553-1)，以及溶酶体失调(wallings rl,humble sw,ward me,wade-martins r.lysosomal dysfunction at the centre of parkinson'sdisease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis.trendsneurosci.2019dec；42(12):899-912.doi:10.1016/j.tins.2019.10.002.epub 2019nov5.pmid:31704179；pmcid:pmc6931156)。

3、理想的治疗应该直接针对潜在的疾病病因，作为改变这些疾病不可阻挡的临床进程的主要方法。人们普遍认为，特定蛋白质的聚集不仅是一种常见的分子特征，而且可能是随后的神经炎症、氧化应激、溶酶体失调和线粒体功能障碍的触发因素。此外，所有这些事件似乎都与神经毒性正反馈回路有关。因此，抑制异常蛋白聚集应该是治疗淀粉样蛋白相关疾病的主要目标。不幸的是，尽管在研究和药物开发方面进行了大量投资，但迄今为止，所有的尝试都失败了。

4、尽管有希望的化合物在体外或动物模型中表现出阻止或逆转蛋白质聚集的能力，但不幸的是，它们中的大多数在临床试验中失败了。此外，目前在临床试验注册数据库中达到第三阶段的大多数被描述为神经保护的药物主要针对神经递质释放调节或代谢，而不是抑制异常蛋白聚集过程(https://clinicaltrials.gov/)。因此，现有的治疗方法更多的是姑息性的而不是治愈性的。

5、由于血脑屏障(bbb)的保护性质阻碍了药物对神经元的靶向作用，因此治疗神经退行性疾病的治疗方法通常受到限制。血脑屏障(bbb)作为循环血液和中枢神经系统(cns)之间的有机屏障，控制体内平衡、分子和离子的运动、流入和流出运输的调节，并作为防止有害物质进入大脑的保护层。这种复杂的屏障还控制和限制治疗剂向cns的系统递送。高度选择性的渗透性血脑屏障构成了通过血液循环递送药物以治疗脑疾病的最大障碍。

6、属于神经退行性疾病组的有：阿尔茨海默病(ad)和其它痴呆、帕金森病(pd)和pd相关疾病、朊病毒病、运动神经元疾病(mnd)、亨廷顿病(hd)、脊髓小脑性共济失调(sca)、脊髓性肌萎缩症(sma)。

7、在上述疾病中，帕金森病是第二大神经退行性疾病，影响全球700-1000万人，以运动症状和中脑多巴胺能神经元进行性丧失为特征((collaborators gpsd.global,regional,and national burden of parkinson's disease,1990-2016:a systematicanalysis for the global burden of disease study 2016.lancet neurol.2018；17(11):939-53.epub 2018/10/01.doi:10.1016/s1474-4422(18)30295-3；fereshtehnejadsm,zeighami y,dagher a,postuma rb.clinical criteria for subtyping parkinson'sdisease:biomarkers and longitudinal progression.brain.2017；140(7):1959-76.doi:10.1093/brain/awx118)。帕金森病可用的药物干预，诸如左旋多巴和多巴胺激动剂，可改善运动症状。然而，随着时间的推移，这些治疗方法会失去疗效，并产生不良副作用(picconi b,lf,obeso ja,calabresi p.motor complications inparkinson's disease:striatal molecular and electrophysiological mechanisms ofdyskinesias.mov disord.2018；33(6):867-76.epub 2017/12/08.doi:10.1002/mds.27261)。在这种情况下，迫切需要开发改善疾病的疗法，以预防或延缓疾病进展。

8、尽管帕金森病神经退行性变的分子基础仍存在争议，但α-突触核蛋白(as)淀粉样蛋白聚集在病理发生和传播中的核心作用似乎是明确的(spillantini mg,schmidt ml,lee vm,trojanowski jq,jakes r,goedert m.alpha-synuclein in lewybodies.nature.1997；388(6645):839-40.epub1997/08/28.doi:10.1038/42166；araki k,yagi n,aoyama k,choong cj,hayakawa h,fujimura h,et al.parkinson's disease isa type of amyloidosis featuring accumulation of amyloid fibrils of alpha-synuclein.proc natl acad sci u s a.2019；116(36):17963-9.epub 2019/08/21.doi:10.1073/pnas.1906124116)。寡聚as物质已被证明通过不同的机制引起毒性作用，诸如伴随钙流入的膜渗透性改变(danzer km,haasen d,karow ar,moussaud s,habeck m,giesea,et al.different species of alpha-synuclein oligomers induce calciuminfluxand seeding.j neurosci.2007；27(34):9220-32.doi:10.1523/jneurosci.2617-07.2007)、线粒体损伤(hsu lj et al.)、溶酶体渗漏(nishino k,hsu ff,turk j,cromiemj,wosten mm,groisman ea.identification of the lipopolysaccharidemodifications controlled by the salmonella pmra/pmrb system mediatingresistance to fe(iii)and al(iii).mol microbiol.2006；61(3):645-54.)、微管破裂(alim ma,ma ql,takeda k,aizawa t,matsubara m,nakamura m,et al.demonstrationof a role for alpha-synuclein as a functional microtubule-associatedprotein.j alzheimers dis.2004；6(4):435-42；discussion 43-9.epub 2004/09/04)，以及对轴突运输的干扰(scott da,tabarean i,tang y,cartier a,masliah e,roy s.apathologic cascade leading to synaptic dysfunction in alpha-synuclein-inducedneurodegeneration.j neurosci.2010；30(24):8083-95.epub 2010/06/18.doi:10.1523/jneurosci.1091-10.2010)。另一方面，纤维物质主要通过触发炎症过程引起神经毒性(dos-santos-pereira m,l,hamadat s,rocca j,gonzález-lizárraga f,chehínr,et al.microglial glutamate release evoked byα-synuclein aggregates isprevented by dopamine.glia.2018；66(11):2353-65)，而且还通过催化它们自身的传播((bousset l,pieri l,ruiz-arlandis g,gath j,jensen ph,habenstein b,etal.structural and functional characterization of two alpha-synucleinstrains.nat commun.2013；4:2575.doi:10.1038/ncomms3575)，破坏蛋白内稳态网络的稳定(morimoto ri,driessen aj,hegde rs,langer t.the life of proteins:the good,the mostly good and the ugly.nat struct mol biol.2011；18(1):1-4.doi:10.1038/nsmb0111-1)，并影响胞质细胞器的完整性(flavin wp,bousset l,green zc,chu y,skarpathiotis s,chaney mj,et al.endocytic vesicle rupture is a conservedmechanism of cellular invasion by amyloid proteins.acta neuropathol.2017；134(4):629-53.epub 2017/05/19.doi:10.1007/s00401-017-1722-x)。考虑到氧化应激和促炎细胞因子也促进as的毒性聚集(pukass k et al.)，所有这些过程都被认为是导致神经元死亡的恶性循环，随后有毒物质扩散到邻近的健康神经元中(gonzalez-lizarraga f,socias sb,avila cl,torres-bugeau cm,barbosa lr,binolfi a,et al.repurposingdoxycycline for synucleinopathies:remodelling of alpha-synuclein oligomerstowards non-toxic parallel beta-sheet structured species.sci rep.2017；7:41755.epub 2017/02/06.doi:10.1038/srep41755)。因此，为了有效地改变帕金森病的神经退行性变过程，理想的药物应该能够干扰as聚集，阻止毒性物质的产生，分解预先形成的毒性聚集体，并抑制神经炎症过程。此外，这种多靶点化合物还应该具有穿过血脑屏障的能力，这通常是靶向中枢神经系统的药物开发中的主要障碍。多巴胺本身可以弥补这种神经递质的缺乏，但这种分子的极性太强，无法穿过血脑屏障。由于这个原因，自1960年以来，最有效和最广泛的多巴胺替代疗法是递送其前体左旋多巴(l-dopa或l-3,4-二羟基苯丙氨酸)(lewitt pa.levodopa therapy for parkinson's disease:pharmacokinetics andpharmacodynamics.mov disord.2015；30(1):64-72.epub 2014/12/03.doi:10.1002/mds.26082)。这种氨基酸只能利用大的氨基酸转运蛋白lat-1适度地穿过血脑屏障，一旦进入中枢神经系统，就会脱羧成为多巴胺。值得注意的是，到目前为止，多巴胺没有转运蛋白的报道，而且它是一种极性太强的化合物，不能溶解在脂质中并扩散通过血脑屏障。

9、1975年，外周脱羧酶抑制剂诸如卡比多巴或苄丝肼(benserazide)开始添加到l-dopa制剂中，减少了到达中枢神经系统所需的l-dopa剂量(rinne uk,birket-smith e,dupont e,hansen e,m,marttila r,et al.levodopa alone and incombination with a peripheral decarboxylase inhibitor benserazide(madopar)inthe treatment of parkinson's disease:a controlled clinical trial.jneurol.1975；211(1):1-9.doi:10.1007/bf00312459)。这些制剂能够控制重要的副作用，诸如恶心和呕吐。然而，长期使用l-dopa联合卡比多巴会带来新的副作用，诸如运动障碍、抑郁、直立性低血压、嗜睡、精神病和风险行为增加(hinz m,stein a,cole t.parkinson'sdisease:carbidopa,nausea,and dyskinesia.clin pharmacol.2014；6:189-94.epub2014/12/09.doi:10.2147/cpaa.s72234)。到目前为止，还没有其他批准的给药模式可用于减轻cns的黑质纹状体通路中的多巴胺缺乏。

10、向cns递送治疗剂可分为以下几类：

11、1-非结构化系统：向cns供应多巴胺的常规方式是通过包含左旋多巴+卡比多巴或苄丝肼的制剂。然而，长期使用l-dopa+卡比多巴会产生一些副作用。对病因学和不良反应的研究表明，卡比多巴是造成所述副作用的药物，因为它会导致维生素b6在全身不可逆的结合和失活。这引发了巨大的后果，因为它干扰了300多种酶和蛋白质的功能(hinz m etal.)。此外，思维的改变，包括幻觉和妄想的出现，与中脑边缘或中脑皮质系统中多巴胺的释放有关(rinne uk et al.)。

12、多巴胺激动剂(da)是左旋多巴的有效替代品，主要用于年轻患者，且5年后运动并发症的发生率较低。它们既可用于疾病早期的单一疗法，也可与左旋多巴联合用于晚期帕金森病患者。麦角衍生物是第一个可用的da，但由于心脏瓣膜纤维化的风险，其使用目前受到限制。

13、目前使用最多的是非麦角da。这些药物可以口服(普拉克索(pramipexole)和罗匹尼罗(ropinirole))、透皮(罗替戈汀(rotigotine))或皮下(阿朴吗啡(apomorphine))给药。最近，市场上推出了口服缓释制剂，允许每天一次给药。然而，新的da并不能免除严重的不良反应(reichmann h,bilsing a,ehret r,greulich w,schulz jb,schwartz a,etal.ergoline and non-ergoline derivatives in the treatment of parkinson'sdisease.j neurol.2006；253suppl 4:iv36-8.doi:10.1007/s00415-006-4009-z)。

14、2-纳米结构系统：

15、人们正在研究不同组成和结构的纳米颗粒，以将药物输送到中枢神经系统。通常，这些颗粒是尺寸在2和100nm之间变化的胶体固体。这些系统尚未进入注册或商业阶段，其中可以提及的有：

16、树枝状高分子(dendrimer)是聚酰胺(pamam)、聚丙烯-1-胺(dab-dendr-nh2)、聚醚、聚酯、聚链烷、聚亚苯基、聚苯乙炔等聚合物质的树枝状三维聚合物。药物可以被包封在树枝状高分子内，或者可以共价结合到其表面。树枝状高分子通过受体介导的内吞作用穿透血脑屏障。虽然将药物封装在树枝状高分子中是一种非常有前途的策略，但目前还没有对树枝状高分子的吸附、分布、代谢和排泄方面的毒代动力学进行系统评估，以解决与长期临床使用相关的安全性问题。

17、据本发明人所知，迄今为止，文献中没有关于在树枝状高分子中包封多巴胺或其它能够抑制或阻止细胞死亡的神经保护分子的公开内容((zhu y,liu c,pangz.dendrimer-based drug delivery systems for braintargeting.biomolecules.2019；9(12).epub 2019/11/27.doi:10.3390/biom9120790)。树枝状高分子具有非常低的包封率，并且不知道是否在特定区域(诸如黑质纹状体通路)中积累。

18、-量子点是通过转铁蛋白受体介导的内吞作用穿过血脑屏障的荧光半导体纳米颗粒。它们由金属芯和有机覆盖物组成。它们的亮度、光稳定性、可修改的尺寸和窄发射光谱使这些纳米系统成为一种革命性的技术。已经描述了在cns中的各种应用，包括灵敏的和选择性的多巴胺检测(zhao d,song h,hao l,liu x,zhang l,lv y.luminescent znoquantum dots for sensitive and selective detection of dopamine.talanta.2013；107:133-9.epub2013/01/11.doi:10.1016/j.talanta.2013.01.006)。然而，据本发明人所知，迄今为止尚未报道这些纳米颗粒的多巴胺载体功能。此外，对于长期治疗，它们存在固有毒性，其生物相容性尚未得到充分研究。它们目前的用途主要集中在诊断方面。

19、-脂质体是一种通常由脂质双层形成的纳米颗粒，其内部有一个包封药物的亲水性核。脂质体能够通过受体介导的内吞作用穿过血脑屏障。一旦进入中枢神经系统，包围它们的膜就会破裂并释放出其内容物。脂质体的半衰期是有限的，但当其表面被聚乙二醇(peg)包裹时，半衰期会增加。脂质双层有助于防止包封在其中的药物的水解和氧化降解。

20、脂质体已被用于包封阿朴吗啡(一种多巴胺激动剂)，以改善药物在中枢神经系统内的分布。此外，一个小组最近研究了一种基于脂质体的递送系统，用于将多巴胺靶向大脑，与标准左旋多巴给药相比，该系统在小鼠中产生的有效多巴胺剂量减少(kahana etal.liposome-based targeting of dopamine to the brain:a novel approach for thetreatment of parkinson's disease.mol psychiatry.2020may 5.doi:10.1038/s41380-020-0742-4)。

21、然而，作为缺点，脂质体具有较差的稳定性、较低的包封率、通过网状内皮系统的快速消除、细胞相互作用或吸附、以及高的生产成本。

22、-胶束是大小为5-100nm的胶体颗粒，由两部分组成：疏水性内部和亲水性外部。胶束通过血脑屏障的渗透是通过受体介导的内吞作用完成的。然而，它们不是很稳定，对氧化过程极其敏感，限制了它们将物质转运到cns的效率。

23、到目前为止，还没有关于在胶束中包封多巴胺或其他神经保护物质的研究工作。

24、-碳纳米管由碳的同素异形体组成，其由一个或几个石墨烯片自身缠绕并以同心方式排列以形成尺寸为1-50nm的圆柱体组成，具有特定的电学、机械和热学性质。碳纳米管穿透血脑屏障并允许药物释放。尽管扩散和吞噬作用等其他机制也是可行的，但碳纳米管穿透血脑屏障主要是通过受体介导的内吞作用进行的。尽管这些纳米结构是可商购的，但它们被金属催化剂和无定形碳严重污染，从而造成毒性(由于炎症)，导致肉芽肿的形成、生物相容性问题，并且对人类健康和环境都有危害。

25、据本发明人所知，迄今为止还没有涉及将多巴胺或其它神经保护物质包封在碳纳米管中的研究工作。

26、-聚合物纳米颗粒的尺寸范围很广，在1-1000nm之间。药物可以通过吸附或共价键与这些纳米颗粒结合，使它们与其表面结合。它们的主要特点是稳定性好。它们通过受体介导的内吞作用进入血脑屏障。esteves等人证明，将这些纳米颗粒与视黄酸一起给药对多巴胺能神经元产生神经保护作用(esteves m,ac,saraiva t,rocha sm,baltazarg,ferreira l,et al.retinoic acid-loaded polymeric nanoparticles induceneuroprotection in a mouse model for parkinson's disease.front agingneurosci.2015；7:20.epub2015/03/06.doi:10.3389/fnagi.2015.00020)。使用这种类型的纳米颗粒的优点之一是它们的化学性质是众所周知的，并且有大量关于其毒性的信息。

27、到目前为止，还没有关于在聚合物纳米颗粒中包封多巴胺或多巴胺激动剂的公开研究。

28、-固体脂质纳米颗粒是一种尺寸范围为100-400nm的纳米颗粒，其基质由在室温和体温下均保持固态的脂质组成。它们是可生物降解的、生物相容的并且具有低毒性。它们通过扩散穿过血脑屏障。esposito等人将多巴胺激动剂溴隐亭(bromocriptine)包封在这些纳米颗粒中(esposito e,mariani p,ravani l,contado c,volta m,bido s,etal.nanoparticulate lipid dispersions for bromocriptine delivery:characterization and in vivo study.eur j pharm biopharm.2012；80(2):306-14.epub 2011/11/09.doi:10.1016/j.ejpb.2011.10.015)。这种经鼻给药的制剂在小鼠pd实验模型中显示出僵硬的逆转。

29、另一方面，tsai等人将阿朴吗啡(一种多巴胺激动剂(da))配制在固体脂质纳米粒中，在动物模型中设法提高口服生物利用度和大脑中的区域分布(tsai mj,huang yb,wupc,fu ys,kao yr,fang jy,et al.oral apomorphine delivery from solid lipidnanoparticles with different monostearate emulsifiers:pharmacokinetic andbehavioral evaluations.j pharm sci.2011；100(2):547-57.epub 2010/08/27.doi:10.1002/jps.22285)。kondrasheva等人设计了一种新的l-dopa载体，该载体由固体脂质纳米颗粒与多酸(乳酸-共-乙醇酸)plga组成，当经鼻给药时，该载体可长期恢复运动功能，提高药物疗效(i.g.kondrasheva,p.e.gambaryan,e.s.severin,a.a.guseva,a.a.kamensky.the application of l-dopa-containing polymeric nanoparticlesprovides motor function recovery in 6-ohda-indused parkinson'sdiseasemodel.journal of the neurological sciences.2013,volume 333,supplement 1,pagee97.https://doi.org/10.1016/j.jns.2013.07.608)。

30、最近发表的研究涉及在固体脂质纳米颗粒中包封多巴胺(ortega et al.lipidnanoparticles for the transport of drugs like dopamine through the blood–brain barrier.beilstein archives.2020,202079.https://doi.org/10.3762/bxiv.2020.79.v1；tapeinos et al.advances in the design of solid lipidnanoparticles and nanostructured lipid carriers for targeting braindiseases.j control release.2017october 28；264:306–332.doi:10.1016/j.jconrel.2017.08.033)。该系统的缺点在于囊泡的强烈凝胶化倾向和药物掺入的低效率。此外，纯脂质的可获得性和制剂所需的保存程度使得该系统无法扩大规模并确保提供永久和长期治疗。

31、仍然需要开发稳定、廉价和可靠的转运方法，以允许亲水性药物通过血脑屏障向其在中枢神经系统的预期靶点转移。

技术实现思路

1、根据第一方面，本发明提供新化合物，其包含经修饰的四环素衍生物，该四环素衍生物通过接头与用于治疗神经退行性疾病的低疏水性生物活性分子共价偶联。

2、本发明的第二个方面是提供包含本发明化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

3、本发明的第三个方面是提供治疗神经退行性疾病的方法，其包括将治疗有效量的本发明化合物施用于有此需要的个体。

4、本发明的第四个方面是提供本发明的化合物在制备用于治疗神经退行性疾病的药物中的用途。

5、本发明的第五个方面是提供用于制备本发明化合物的方法。