施用树脂毒素以治疗前列腺癌的制作方法

施用树脂毒素以治疗前列腺癌
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于
2021
年2月
11
日提交的美国临时专利申请第
63/148,343
号的优先权，所述美国临时专利申请的内容和公开内容出于所有目的通过引用整体并入
。
3.本公开提供了治疗前列腺癌的方法以及用于在此类方法中使用的树脂毒素
(rtx)
，所述方法包括施用树脂毒素
。
4.

背景技术：
和

技术实现要素：

5.trpv-1
受体在整个人体中普遍表达
(velasco
等人
,《
实验药理学手册
(handb exp pharmacol.)》2015
；
231:449
–
72)。
比较患者活检正常组织和恶性组织，表明
trpv-1
在肿瘤组织中的表达升高
。
肿瘤相关的
trpv-1
过表达可以在活检免疫组织化学
(
图
la)
和蛋白质印迹分析
(
图
1b)
中看到
。
6.树脂毒素在本文中称为
rtx
，是目前用于疼痛管理的
trpv-1
受体激动剂
。
最近使用
rtx
的研究表明了
trpv-1
激动剂
(
包括
rtx
和
rtx
衍生物
)
在啮齿类动物异种移植肿瘤模型中对人膀胱癌的抗肿瘤活性
(rossi
等人
,《
国际分子科学杂志
(int j mol sci.)》2019apr 18
；
20(8))。
7.另外，
rtx
对胰腺
、
肺和前列腺癌细胞的细胞毒性活性已在体外得到证明
(ziglioli
等人
《
生物医学学报
(acta biomed.)80(2009)13
–
20》
；
hartel
等人
《
肠道
(gut)》55(2006)519
–
528
；
hail
等人
《
细胞凋亡
(apoptosis)》8(2003)251
–
262
；
athanasiou
等人
《
生物化学与生物物理研究通讯
(biochem.biophys.res.commun.)》354(2007)50
–
55)。
8.树脂毒素
(rtx)
充当红辣椒的主要辛辣成分辣椒素的超强效类似物
。rtx
是从大戟属
(euphorbia)
的某些物种中分离出来的三环二萜
。
高香草基是辣椒素的重要结构特征，并且是区分树脂毒素与典型佛波醇相关化合物的最突出特征
。
天然
rtx
具有以下结构：
[0009][0010]
rtx
和类似物化合物如亭牙毒素
(tinyatoxin)
和其它化合物
(
二萜的
20-高香草基酯，如
12-脱氧佛波醇
13-苯乙酸酯
20-高香草酸酯和密执毒素
20-高香草酸酯
)
在美国专利第
4,939,194
号；第
5,021,450
号；和第
5,232,684
号中进行了描述
。
还已经鉴定了其它树脂毒素类佛波香草素
(resiniferatoxin-type phorboid vanilloid)(szallasi
等人
(1999)《
英国药理学杂志
(brit.j.pharmacol.)》128:428-434)。
[0011]
rtx
被称为
trpv-1
激动剂
。trpv-1
，即瞬时受体电位阳离子通道亚家族v成员
1(
也称为香草素受体-1(vr1))
，是一种主要在伤害性初级传入神经元中表达的多聚体阳离子通道
(caterina
等人
(1997)《
自然
(nature)》389:816-824
；
tominaga
等人
(1998)《
神经元
(neuron)》21:531-543)。trpv-1
的激活通常通过施加疼痛的热量而发生在神经末梢，并且在某些类型的炎性刺激期间上调
。
化学激动剂对外周组织中
trpv-1
的激活导致钙通道的打开和痛觉的传导
(szalllasi
等人
(1999)《
分子药理学
(mol.pharmacol.)》56:581-587)。
然而，将某些
trpv-1
激动剂直接施加于表达
trpv-1
的神经元
(
神经节
)
的细胞体将打开钙通道并引发一连串导致程序性细胞死亡
(“凋亡”)
的事件
(karai
等人
(2004)《
临床研究杂志
(j.of clin.invest.)》113:1344-1352)。
[0012]
前列腺癌是癌症的一种常见形式，并且尽管有一些治疗方法，但根据前列腺癌基金会估计，在美国，每天有
91
人死于前列腺癌，所述基金会估计每9名美国男性中就有1人会在一生中的某个时候被诊断为患有前列腺癌
(
参见
www.pcf.org/about-prostate-cancer/what-is-prostate-cancer/prostate-cancer-survival-rates/)。
因此，需要用于治疗前列腺癌的改善的组合物
、
方法和用途
。
本公开示出了
rtx
可以有效地对抗其中可能存在
trpv-1
的前列腺癌细胞，并且旨在满足这一需要和
/
或提供其它益处
。
[0013]
因此，提供了以下示例性实施方式
。
[0014]
实施方式1是一种治疗前列腺癌的方法，所述方法包括向需要治疗前列腺癌的受试者施用树脂毒素
(rtx)。
[0015]
实施方式2是一种用于在治疗前列腺癌的方法中使用的组合物，所述组合物包含树脂毒素
(rtx)
，所述方法包括向需要治疗前列腺癌的受试者施用
rtx。
[0016]
实施方式3是根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述
rtx
是局部施用的
。
[0017]
实施方式4是根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述
rtx
是瘤周施用的
。
[0018]
实施方式5是根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者先前接受过前列腺手术
。
[0019]
实施方式6是根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述方法包括以
0.005mcg/ml-0.01mcg/ml、0.01mcg/ml-0.05mcg/ml、0.05mcg/ml-0.1mcg/ml、0.1mcg/ml-0.15mcg/ml、0.15mcg/ml-0.2mcg/ml、0.2mcg/ml-0.25mcg/ml、0.25mcg/ml-0.3mcg/ml、0.30mcg/ml-0.35mcg/ml、0.35mcg/ml-0.4mcg/ml、0.4mcg/ml-0.45mcg/ml、0.45mcg/ml-0.5mcg/ml、0.5mcg/ml
–
0.55mcg/ml、0.55mcg/ml-0.6mcg/ml、0.6mcg/ml-0.65mcg/ml、0.65mcg/ml-0.7mcg/ml、0.7mcg/ml-0.75mcg/ml、0.75mcg/ml-0.8mcg/ml、0.8mcg/ml-0.85mcg/ml、0.85mcg/ml-0.9mcg/ml、0.9mcg/ml-0.95mcg/ml、0.95mcg/ml
–
1.0mcg/ml、1.0mcg/ml-1.1mcg/ml
或
1.1mcg/ml-1.2mcg/ml
的浓度施用
rtx。
[0020]
实施方式7是根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中施用
0.05mcg
至
0.10mcg、
或
0.10mcg
至
0.15mcg、
或
0.15mcg
至
0.25mcg、
或
0.25mcg
至
0.50mcg、
或
0.50mcg
至
0.75mcg、
或
0.75mcg
至
1.0mcg、
或
1.0mcg
至
1.1mcg、
或
1.1mcg
至
1.5mcg
剂量的
rtx。
[0021]
实施方式8是根据实施方式7所述的方法或供使用的组合物，其中所述
rtx
以至少约
0.1mcg
的剂量施用
。
[0022]
实施方式9是根据实施方式7所述的方法或供使用的组合物，其中所述
rtx
以至少约
0.5mcg
的剂量施用
。
[0023]
实施方式
10
是根据实施方式7所述的方法或供使用的组合物，其中所述
rtx
以至少约
1.0mcg
的剂量施用
。
[0024]
实施方式
11
是根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述
rtx
以一个剂量施用
。
[0025]
实施方式
12
是根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述
rtx
以重复剂量施用
。
[0026]
实施方式
13
是根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述
rtx
每天施用
。
[0027]
实施方式
14
是根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述
rtx
每隔一天施用
。
[0028]
实施方式
15
是根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述受试者是哺乳动物
。
[0029]
实施方式
16
是根据实施方式
15
所述的方法或供使用的组合物，其中所述哺乳动物是人
。
[0030]
实施方式
17
是根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述前列腺癌是前列腺腺癌
。
[0031]
实施方式
18
是根据前述实施方式中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述方法包括施用包含所述
rtx
和药学上可接受的载体的药物制剂
。
[0032]
实施方式
19
是根据实施方式
18
所述的方法或供使用的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括水
。
[0033]
实施方式
20
是根据实施方式
18
或
19
所述的方法或供使用的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括聚山梨酯
80。
[0034]
实施方式
21
是根据实施方式
18
至
20
中任一项所述的方法或供使用的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括缓冲液，任选地，其中所述缓冲液是磷酸盐缓冲液和
/
或所述制剂的
ph
为约
7.0-7.5
或约
7.2。
附图说明
[0035]
图
1a
和
1b
示出了
rtx
受体
trpv-1
在前列腺癌中过表达
。
图
1a
示出了
trpv-1
在整个人体中的广泛表达
。
竖轴单位是
mrna
表达的增加倍数
。
图
1b
示出了如从患者活检所评估的，与邻近正常组织相比，
trpv-1
在前列腺癌中过表达
。
比例尺，
50
μ
m。
[0036]
图
2a、2b
和
2c
示出了
rtx
抑制
trpv-1
+
前列腺癌细胞系的增殖
。
在图
2a-b
中，通过流式细胞术显示人前列腺癌细胞系
du145
和
lncap
表达
trpv-1。
图
2a-b
中的横轴单位是任意的荧光单位
。
图
2c
示出了
rtx
处理以剂量依赖的方式降低前列腺癌细胞系的增殖
。
[0037]
图
3a、3b
和
3c
示出了
rtx
以细胞抑制的方式抑制前列腺癌的进展
。
图
3a
示出了皮下移植到小鼠中的人前列腺癌
du145
细胞的肿瘤体积随时间的变化，以评估
rtx
的抗肿瘤细胞抑制活性
。
从移植后
28
天开始，每隔一天以所指示剂量局部
(
瘤周
)
施用
rtx。
在
0.1-1
μ
g/
剂量的测试范围内，细胞抑制活性似乎与剂量无关
。
图
3b
示出了
rtx
施用使得肿瘤组织完整性丧失
(
上排
)
，
cd31
+
肿瘤血管系统显著减少
(
中排
)
，以及切割的胱天蛋白酶3+
肿瘤细胞凋亡显著增加
(
下排
)
，如通过肿瘤组织切片的共聚焦显微术分析的
。
比例尺，
100
μ
m。cd31+
血管
长度和切割的胱天蛋白酶3水平
(
以中值荧光强度
mfi
表示
)
在图
3c
中定量
。
[0038]
图
4a、4b
和
4c
示出了
rtx
处理不会诱导细胞因子释放综合征，但会降低
il-6
的表达
。
图
4a
示出了从按指示处理的肿瘤中分离的肿瘤
(tm)
匀浆
(wcl
：全细胞裂解物
)
，所述匀浆用于通过专门用于评估炎性细胞因子的细胞因子阵列来评估细胞因子表达
。
以剂量依赖性方式降低的
il-6
表达被放大示出
(
图
4a)。
图
4c
示出了图
4a
的阵列的每个位置的内容
。
具体实施方式
[0039]
现在将详细参考本发明的某些实施方式，附图中展示了这些实施方式的实例
。
尽管将结合所展示的实施方式描述本发明，但应当理解，其并不旨在将本发明限制于那些实施方式
。
相反，本发明旨在覆盖可以包括在由所附权利要求限定的本发明内的所有替代方案
、
修改和等效物
。
[0040]
在详细描述本发明的教导之前，应理解，本公开不限于具体的组合物或工艺步骤，因为此类组合物或工艺步骤可以变化
。
应注意的是，除非上下文另外明确指示，否则如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个
(a/an)”以及“所述
(the)”均包括复数指代物
。
因此，例如，对“缀合物”的引用包括多个缀合物，并且对“细胞”的引用包括多个细胞等
。
[0041]
数字范围包括限定范围的数字
。
考虑到有效数字和与测量相关的误差，测得值和可测量值被理解为近似值
。
而且，“包括
(comprise/comprises/comprising)”、“含有
(contain/contains/containing)”和“包含
(include/includes/including)”的使用不旨在是限制性的
。
应当理解，上述的一般描述和详细描述两者均仅是示例性和解释性的，并且不限制本教导
。
[0042]
除非在以上说明书中具体指出，否则在说明书中叙述“包括”各种组分的实施方式也被设想为“由所叙述组分组成”或“基本上由所叙述组分组成”；在说明书中叙述“由各种组分组成”的实施方式也被设想为“包括”所叙述组分或“基本上由所叙述组分组成”；并且在说明书中叙述“基本上由各种组分组成”的实施方式也被设想为“由所叙述组分组成”或“包括”所叙述组分
(
此互换性不适用于这些术语在权利要求书中的使用
)。
[0043]
本文所使用的章节标题仅仅是出于组织的目的并且不应被解释为以任何方式限制所期望的主题
。
在通过引用并入的任何文献与本说明书中所定义的任何术语相矛盾的情况下，以本说明书为准
。
虽然结合各个实施方式对本发明教导进行了描述，但是本发明教导不旨在受限于此类实施方式
。
相反，本发明教导涵盖各种替代方案
、
修改和等同物，如本领域的技术人员将理解的
。
[0044]
a.
定义
[0045]“前列腺癌”是指前列腺中存在恶性细胞的任何病状
。
[0046]
如本文所使用的，术语“或其组合
(or a combination thereof/or combinations thereof)”是指在所述术语之前所列出的术语的任何和所有排列以及组合
。
例如，“a、b、c
或其组合”旨在包括以下中的至少一种：
a、b、c、ab、ac、bc
或
abc
，并且如果顺序在特定背景下是重要的，则还包括
ba、ca、cb、acb、cba、bca、bac
或
cab。
继续此实例，明确地包括的是包括一个或多个项或术语的重复的组合，如
bb、aaa、aab、bbc、aaabcccc、cbbaaa、cababb
等
。
技术人员将理解，除非另外从上下文变得显而易见，否则通常不限制任何组合中的项或术语的
数量
。
[0047]
除非上下文另有要求，否则“或”以开放性意义使用，即等同于“和
/
或”。
[0048]
b.
示例性方法和供使用的组合物
[0049]
本文提供了用于治疗前列腺癌的方法，所述方法包括向需要治疗前列腺癌的受试者施用树脂毒素
(rtx)。
还提供了用于在治疗前列腺癌的方法中使用的组合物，所述组合物包含
rtx
，所述方法包括向需要治疗前列腺癌的受试者施用
rtx。
在一些实施方式中，所述受试者先前接受过前列腺手术
。
[0050]
在一些实施方式中，所述
rtx
是局部施用的
。
在一些实施方式中，所述
rtx
是瘤周施用的
。
[0051]
本文所述的组合物和方法适用于
rtx
对其有效
(
例如，能够结合并激活
trpv-1
或其同源物
)
并且需要治疗前列腺癌的任何受试者
。
在一些实施方式中，所述受试者是哺乳动物
。
在一些实施方式中，所述哺乳动物是人
。
在一些实施方式中，所述哺乳动物是猫
。
在一些实施方式中，所述哺乳动物是狗
。
[0052]
1.
剂量
[0053]
在一些实施方式中，
rtx
以
0.05mcg
至
0.10mcg、
或
0.10mcg
至
0.15mcg、
或
0.15mcg
至
0.25mcg、
或
0.25mcg
至
0.50mcg、
或
0.50mcg
至
0.75mcg、
或
0.75mcg
至
1.0mcg、
或
1.0mcg
至
1.1mcg、
或
1.1mcg
至
1.5mcg
的剂量施用
(
例如，瘤周
)。
在一些实施方式中，
rtx
以至少约
0.1mcg/kg
，如
0.1mcg/kg
–
0.2mcg/kg、0.2mcg/kg
–
0.3mcg/kg、0.3mcg/kg
–
0.4mcg/kg、0.4mcg/kg
–
0.5mcg/kg、0.5mcg/kg
–
0.6mcg/kg、0.6mcg/kg
–
0.7mcg/kg、0.7mcg/kg
–
0.8mcg/kg、0.8mcg/kg
–
0.9mcg/kg、0.9mcg/kg
–
1mcg/kg、1mcg/kg
–
1.2mcg/kg、1.2mcg/kg
–
1.4mcg/kg、1.4mcg/kg
–
1.6mcg/kg、1.6mcg/kg
–
1.8mcg/kg、1.8mcg/kg
–
2.0mcg/kg、2.0mcg/kg
–
2.2mcg/kg、2.2mcg/kg
–
2.4mcg/kg、2.4mcg/kg
–
2.6mcg/kg、2.6mcg/kg
–
2.8mcg/kg、2.8mcg/kg
–
3.0mcg/kg、3.0mcg/kg
–
3.2mcg/kg、3.2mcg/kg
–
3.4mcg/kg、3.4mcg/kg
–
3.6mcg/kg、3.6mcg/kg
–
3.8mcg/kg、4.0mcg/kg
–
4.2mcg/kg、4.2mcg/kg
–
4.4mcg/kg、4.4mcg/kg
–
4.6mcg/kg、4.6mcg/kg
–
4.8mcg/kg、4.8mcg/kg
–
5.0mcg/kg、5.0mcg/kg
–
5.2mcg/kg、5.2mcg/kg
–
5.4mcg/kg、5.4mcg/kg
–
5.6mcg/kg、5.6mcg/kg
–
5.8mcg/kg
或
5.8mcg/kg
–
6.0mcg/kg
的剂量施用
(
例如，全身
)。
[0054]
在一些实施方式中，
rtx
以约
0.1mcg、
或约
0.5mcg
或约
1.0mcg
的剂量施用
。
[0055]
在一些实施方式中，
rtx
以体积为
0.2ml-0.5ml、0.5ml-1.0ml、1ml-10ml、20ml-30ml、30ml-40ml、40ml-50ml、50ml-60ml、60ml-70ml、70ml-80ml、80ml-90ml
或
90ml-100ml
的组合物递送
。
[0056]
在一些实施方式中，
rtx
以一个剂量施用
。
在一些实施方式中，
rtx
以重复剂量施用
。
在一些实施方式中，
rtx
以
1、2、3、4
或5个剂量施用
。
[0057]
在一些实施方式中，
rtx
每天施用
。
在一些实施方式中，
rtx
每隔一天施用
。
在一些实施方式中，
rtx
每周施用
。
[0058]
2.
制剂
[0059]
文献中有许多
rtx
制剂的实例
。
参见例如
ueda
等人
(2008)《
心血管药理学杂志
(j.of cardiovasc.pharmacol.)》51:513-520
和
us 2015/0190509 a1。
可以使用任何适于施用的
rtx
制剂
。
在一些实施方式中，
rtx
通过在盐水中稀释来制备以供施用
。
[0060]
在一些实施方式中，
rtx
可以以上文所讨论的剂量与药学上可接受的载体一起施用
。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体包括水
。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体包括盐水
。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体包括聚山梨酯
80。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体包括聚乙二醇
。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体包括糖或糖醇
。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体包括甘露醇
。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体包括右旋糖
。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体包括药学上可接受的缓冲液
。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体包括磷酸盐缓冲液
。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体包括药学上可接受的盐
。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体包括
nacl。
在一些实施方式中，所述药学上可接受的载体包括有机溶剂，如乙醇或
dmso
，例如，作为在主要含水组合物中稀释之前辅助溶解
rtx
的少数或残留组分
。
[0061]
在一些实施方式中，制剂中
rtx
的浓度可以是用于递送预期剂量的任何合适的值
。
在一些实施方式中，制剂中
rtx
的浓度可以是任何适合储存的值，并且可以被稀释以获得适合递送预期剂量的浓度
。
[0062]
在一些实施方式中，药物制剂中
rtx
的浓度在
0.1
至
300mcg/ml
的范围内
。
[0063]
在一些实施方式中，药物制剂中
rtx
的浓度在
0.1-1mcg/ml、1-5mcg/ml、5-10mcg/ml、10-20mcg/ml、10-30mcg/ml、20-30mcg/ml、20-50mcg/ml、50-100mcg/ml、100-150mcg/ml、150-200mcg/ml、200-250mcg/ml
或
250-300mcg/ml
的范围内
。
在一些实施方式中，药物制剂中
rtx
的浓度为
0.005mcg/ml-0.01mcg/ml、0.01mcg/ml-0.05mcg/ml、0.05mcg/ml-0.1mcg/ml、0.1mcg/ml-0.15mcg/ml、0.15mcg/ml-0.2mcg/ml、0.2mcg/ml-0.25mcg/ml、0.25mcg/ml-0.3mcg/ml、0.30mcg/ml-0.35mcg/ml、0.35mcg/ml-0.4mcg/ml、0.4mcg/ml-0.45mcg/ml、0.45mcg/ml-0.5mcg/ml、0.5mcg/ml
–
0.55mcg/ml、0.55mcg/ml-0.6mcg/ml、0.6mcg/ml-0.65mcg/ml、0.65mcg/ml-0.7mcg/ml、0.7mcg/ml-0.75mcg/ml、0.75mcg/ml-0.8mcg/ml、0.8mcg/ml-0.85mcg/ml、0.85mcg/ml-0.9mcg/ml、0.9mcg/ml-0.95mcg/ml、0.95mcg/ml
–
1.0mcg/ml、1.0mcg/ml-1.1mcg/ml
或
1.1mcg/ml-1.2mcg/ml。
[0064]
制剂可以具有任何适于施用的
ph。
在一些实施方式中，包含
rtx
和药学上可接受的载体的药物制剂的
ph
在6至
7.6
的范围内
。
在一些实施方式中，包含
rtx
和药学上可接受的载体的药物制剂的
ph
在6至
6.4、6.3
至
6.7、6.4
至
6.8、6.8
至
7.2、7
至
7.4
或
7.2
至
7.6
的范围内
。
在一些实施方式中，包含
rtx
和药学上可接受的载体的药物制剂的
ph
为
6.5
或
7.2。
[0065]
在一些实施方式中，所述制剂包含聚山梨酯
80。
在一些实施方式中，聚山梨酯
80
的浓度为
0.03-7
％
w/v。
在一些实施方式中，聚山梨酯
80
的浓度为
2-4
％
w/v。
在一些实施方式中，聚山梨酯
80
的浓度为3％
w/v。
所述制剂可以进一步包含缓冲液，如磷酸盐缓冲液
(
例如，磷酸钠缓冲液
)。
在一些实施方式中，磷酸盐缓冲液的浓度为
10-50mm。
在一些实施方式中，磷酸盐缓冲液的浓度为
10-30mm。
在一些实施方式中，磷酸盐缓冲液的浓度为
10mm。
在一些实施方式中，磷酸盐缓冲液的浓度为
30mm。
所述制剂的
ph
可以在
7-7.5
的范围内，如约
7.2。
在一些实施方式中，在任何前述制剂中，
rtx
的浓度可以是
10-30mcg/ml
，如
10mcg/ml
或
25mcg/ml。
在一些实施方式中，所述制剂进一步包含例如表1中针对磷酸盐缓冲液所示的浓度和
ph
的磷酸盐缓冲液
。
在一些实施方式中，所述制剂进一步包含例如表1中针对
nacl
所示的浓度的
nacl。
当两者都存在时，磷酸盐缓冲液和
nacl
可以
(
但不一定
)
以针对单独制剂所
示的浓度和磷酸盐缓冲液
ph
的组合存在
。
[0066]
下表示出了
rtx
的示例性制剂
。
[0067]
表
1.
示例性
rtx
溶液制剂配方
[0068]
[0069]
[0070][0071]
在一些实施方式中，表1中的制剂包含右旋糖
。
在实施方式中，右旋糖的浓度为
0.05-5
％
w/v。
在一些实施方式中，右旋糖的浓度为
0.8-5
％
w/v。
在一些实施方式中，右旋糖的浓度为
0.05
％
w/v。
在一些实施方式中，右旋糖的浓度为
0.8
％
w/v。
在一些实施方式中，右旋糖的浓度为
3.0
％
w/v。
在一些实施方式中，右旋糖的浓度为
5.0
％
w/v。
[0072]
在一些实施方式中，表1中的制剂包含甘露醇
。
在一些实施方式中，甘露醇的浓度为
0.8-3.0
％
w/v。
在一些实施方式中，甘露醇的浓度为
0.8
％
w/v。
在一些实施方式中，甘露醇的浓度为
3.0
％
w/v。
[0073]
在一些实施方式中，表1所示出的制剂中省略了右旋糖或甘露醇
。
[0074]
在一些实施方式中，将表1所示出的制剂中
rtx
的浓度调整到本文公开的任何
rtx
浓度或浓度范围
。
例如，在一些实施方式中，将表1所示出的制剂中
rtx
的浓度调整到
0.3-200mcg/ml。
在一些实施方式中，表1所示出的制剂中
rtx
的浓度为
200mcg/ml。
在一些实施方式中，表1所示出的制剂中
rtx
的浓度为
0.3-100mcg/ml。
在一些实施方式中，表1所示出的制剂中
rtx
的浓度为
100mcg/ml。
在一些实施方式中，将表1所示出的制剂中
rtx
的浓度调整到
0.3-50mcg/ml。
在一些实施方式中，表1所示出的制剂中
rtx
的浓度为
25mcg/ml。
作为另一个实例，在一些实施方式中，将表1所示出的制剂中
rtx
的浓度调整到
0.3-15mcg/ml。
作为另一个实例，在一些实施方式中，将表1所示出的制剂中
rtx
的浓度调整到
0.5-10mcg/ml。
作为另一个实例，在一些实施方式中，将表1所示出的制剂中
rtx
的浓度调整到
0.6-1.5mcg/ml。
具有经调整的
rtx
浓度的任何此类制剂中省略了右旋糖或甘露醇
。
[0075]
表1中的制剂可以根据以下示例性方法制备，这些方法是针对制剂配方3和5而提供的，但可以由本领域技术人员修改以适用于其它制剂
。
制剂配方3可以通过向
100ml
容量瓶中添加
46mg
磷酸二氢钠一水合物
、94.7mg
无水磷酸氢二钠和
860mg nacl
来制备
。
添加
50ml
注射用水
(wfi)
以溶解容量瓶中的组分，然后添加
1.0g
聚山梨酯
80
，以形成含水组分
。
将
20mg rtx
添加到容量瓶内的含水组分中，并用盐酸
/
氢氧化钠将
ph
调整到
7.2。
然后添加
30ml peg 300
，并且对溶液进行超声处理以溶解固体
。
应注意的是，最初
rtx
有时会沉淀在水溶液和
peg
的界面处，但在超声处理后会回到溶液中
。
用水
(wfi)
将容量瓶中的全部混合
物稀释到定容体积
(100.00ml)
，并通过倒置过程进行混合
。
通过
0.2
μm聚四氟乙烯
(ptfe)
过滤器过滤完整制剂
。
[0076]
制剂配方5可以通过向
100ml
容量瓶中添加
138mg
磷酸二氢钠一水合物
、284.1mg
无水磷酸氢二钠和
540mg nacl
来制备
。
添加
50ml
注射用水
(wfi)
以溶解容量瓶中的组分，然后添加
3.0g
聚山梨酯
80
和
800mg
右旋糖，以形成含水组分
。
将
20mg rtx
添加到容量瓶内的含水组分中，并用盐酸
/
氢氧化钠将
ph
调整到
7.2。
然后对溶液进行超声处理，以溶解所有固体
。(
可替代地，最初可以将
rtx
溶解在少量乙醇或
dmso
中，然后将此溶液添加到含水组分中
。)
用水
(wfi)
将容量瓶中的全部混合物稀释到定容体积
(100.00ml)
，并通过倒置过程进行混合
。
通过
0.2
μ
m ptfe
过滤器过滤完整制剂
。
[0077]
根据制剂配方
11
的制剂可使用
200mcg rtx、300mcg
聚山梨酯
80(
使用可商购获得的聚山梨酯
80)、5.4mg
氯化钠
、500mcg
右旋糖
、1.38mg
磷酸二氢钠一水合物
、2.84mg
无水磷酸氢二钠和
1ml
水
(wfi)
制备，然后用盐酸
/
氢氧化钠将
ph
调整到
7.2。
如上所述，右旋糖可以省略
。
[0078]
根据制剂配方
13
的制剂可使用
25mcg rtx、30mg
聚山梨酯
80(
使用可商购获得的聚山梨酯
80)、5.4mg
氯化钠
、50mg
右旋糖
、1.38mg
磷酸二氢钠一水合物
、2.84mg
无水磷酸氢二钠
、1ml
水
(wfi)
制备，然后用盐酸
/
氢氧化钠将
ph
调整到
7.2。
如上所述，右旋糖可以省略
。
[0079]
关于用于制剂和施用的技术的更多细节可以在
gennaro,a.
编辑
,《
雷明顿氏药物科学
(remington's pharmaceutical sciences)》,
第
18
版
,(1990)(
宾夕法尼亚州伊斯顿马克出版公司
(mack publishing co.,easton,pa))
中找到
。
[0080]
实施例
[0081]
a.
树脂毒素在前列腺癌细胞系中的抗前列腺癌功效
[0082]
尽管
trpv-1
在整个人体中普遍表达
(
图
1a)
，但观察到
trpv-1
在前列腺癌
(pca)
中过表达
(
图
1b)。
具体地，通过共聚焦激光扫描显微术分析的免疫组织化学染色的前列腺腺癌患者活检揭示
trpv-1
在前列腺癌中过表达
。
[0083]
为了评估
rtx
的抗
pca
活性，通过流式细胞术验证了人前列腺癌细胞系
du145
和
lncap
的
trpv-1
表达
(
图
2a-b)
，其中两种细胞系都对
rtx
处理有应答并且其细胞增殖显示出剂量依赖性降低
(
图
2c)。
具体地，通过流式细胞术证明了人前列腺癌细胞系
du145
和
lncap
的
trpv-1
过表达
(
图
2a、2b)
，并且如增殖测定所示，两种细胞系通过减少的细胞分裂和
/
或癌细胞死亡以剂量依赖性的方式均对
rtx
处理有应答
(
图
2c)。
将细胞在存在不同量
rtx
的情况下在培养基中培养，如图
2c
所示
。
将增殖测量结果相对于未经处理的对照归一化
。
[0084]
据观察，前列腺腺癌由于
rtx
的受体
trpv-1
的过表达而可能具有对
rtx
的增加的敏感性
。
此外，在低剂量处理后前列腺癌细胞增殖减少表明
rtx
具有强大的抗肿瘤潜力
。
[0085]
b.
树脂毒素在小鼠异种移植肿瘤模型中的抗前列腺癌功效
[0086]
在皮下移植人
du145
前列腺癌细胞的小鼠异种移植肿瘤模型中，证明了
rtx
局部施用的细胞抑制功效
。
值得注意的是，每隔一天局部施用的低至
0.1
μ
g/
剂的
rtx
剂量在
0.1、0.5
和1μg的剂量范围内以剂量无关的方式发挥强大的细胞抑制功效
(
图
3a)。
[0087]
通过
h&e
染色并通过免疫荧光评估解剖的肿瘤组织的
cd31(
肿瘤血管标志物
)、draq7(
核标志物
)
和切割的胱天蛋白酶
3(
凋亡细胞标志物
)。1.0
μ
g/
剂
、0.5
μ
g/
剂和
0.1
μ
g/
剂的
rtx
施用引起肿瘤组织完整性丧失，这表明肿瘤细胞凋亡和坏死并且与细胞死亡一致
的组织特征性形态变化证明了这一点，包括相对于对照出现的大面积基本上未染色的区域
(
图
3b
，上排
)。
此外，用
rtx
处理人前列腺肿瘤可发挥抗肿瘤血管系统功效，如肿瘤组织中的连续
cd31+
染色结构减少所示，其显示出长径血管形态的丧失
(
图
3b
，中排
)。
此外，
rtx
施用后肿瘤细胞凋亡增加，如切割的胱天蛋白酶3报告基因染色的增加所证明的
(
图
3b
，下排；定量如图
3c
所示
)。
[0088]
c.
用树脂毒素处理后
il-6
产生减少
[0089]
一些
rtx
研究报告了诱导神经炎性反应的潜力
。
然而，在这项研究中，细胞因子表达没有显著升高，因为在
rtx
处理后没有细胞因子释放综合征
(crs)
的迹象
。
在坏死终点采集来自实施例b中描述的小鼠异种移植肿瘤模型的肿瘤组织匀浆样品，并且使用细胞因子阵列分析所述匀浆样品的肿瘤相关的炎性细胞因子水平
(
图
4a)。
[0090]
白细胞介素-6(il-6)
被认为是肿瘤炎症的主要介质之一，其在用较高剂量的
rtx
处理后的表达减少
(
图
4a-c)。rtx
处理后
il-6
产生减少表明肿瘤炎性反应减少
。
[0091]
d.
讨论和结果总结
[0092]
rtx
施用在与晚期肿瘤作斗争的患者的疼痛管理中显示出有希望的功效
。
现在已经证明
rtx
在人前列腺癌异种移植肿瘤模型中发挥直接的抗肿瘤活性
。rtx
处理以剂量无关的方式显著降低了肿瘤生长进展和生长
。
此外，
rtx
处理在体内显示出细胞抑制功效
。
[0093]
rtx
已知与细胞表面的其对应的受体
trpv-1
结合，从而诱导
ca2+
阳离子内流
。
已知癌细胞摄取
ca2+
阳离子可促进凋亡性细胞死亡
。
然而，
ca2+
阳离子内流是适应性免疫反应立即早期激活的标志
。
因此，
rtx
诱导的
ca2+
阳离子内流可以有助于由向
ifng+gr.b+
细胞毒性
t
淋巴细胞
(ctl)
进一步成熟的
cd8 t
细胞发挥的期望的抗肿瘤
t
细胞反应
。
[0094]
rtx
施用未诱导
crs
相关细胞因子的表达，并且相比之下，
rtx
处理显著降低了
il-6
的表达
。il-6
是与预后不良相关的肿瘤炎症的主要介质之一
。
[0095]
il-6
表达通常通过与病原体或应激相关的信号由广泛的细胞外配体触发的
nf
κb信号传导进行转录控制，所述信号如
lps、tnf
α
、il-1
β
和多种
toll
样受体
(tlr)
信号传导通路合并为
nf
κb的激活
。
然而，
il-6
产生减少表明
nf
κb信号传导减弱，从而表明肿瘤组织炎症减少
。
此外，在肿瘤组织中发现的
il-6
水平降低预期会降低
il-6
诱导的
jak/stat3
活性，所述
jak/stat3
表示炎症的分子调节中的关键节点
。
[0096]
尽管
il-6/ifn
γ
和其介质
stat3/stat1
已分别被证明是平衡的
(costa-pereira
等人
,《
美国国家科学院院刊
(pnas)》2002
年6月
11
日
99(12)8043-8047)
，
rtx
处理没有诱导
ifn
γ
的表达升高，这一结果指示了抗肿瘤适应性免疫反应
。
因此，除了本文证明的
rtx
所发挥的直接抗肿瘤活性外，
rtx
还可以触发具有强大抗肿瘤功效的适应性免疫反应
。