丙二醇单硝酸酯和柠檬烯用于减少所产生的甲烷的形成和用于提高消化率的用途的制作方法

丙二醇单硝酸酯和柠檬烯用于减少所产生的甲烷的形成和用于提高消化率的用途
1.本发明涉及减少反刍动物甲烷排放的领域
。
具体地，本发明涉及向反刍动物施用柠檬烯和丙二醇单硝酸酯以减少从所述反刍动物的消化活动引起的甲烷产生
。
2.本发明进一步涉及包含丙二醇单硝酸酯和柠檬烯的动物饲料组合物和饲料添加剂，以及所述饲料组合物或饲料添加剂用于减少从反刍动物的消化活动引起的甲烷产生的用途
。
3.地球周围空气的温度正在不断升高，这一过程被称为全球变暖
。
减少这种变暖效应的主要焦点之一是减少排放到大气中的温室气体的量
。
温室气体从几个不同的天然来源和人工来源排放；然而，最重要的两个来源是农业行业和化石燃料行业
。
在农业中，反刍动物，特别是牛，是生物甲烷形成的主要贡献者，并且据估计，阻止由反刍动物形成甲烷几乎会稳定大气中的甲烷浓度
。
4.来自反刍动物畜牧业的甲烷排放
—
来自反刍动物消化系统中植物生物质肠道发酵的副产物
—
是由产甲烷古细菌产生的
。
在过去的十年中，人们已经做出了各种尝试来减少反刍动物的甲烷产生
。
尽管方法各不相同，但迄今为止最流行的方法是饲料添加剂，所述饲料添加剂通过减少或抑制产甲烷古细菌的甲烷产生而在瘤胃液中发挥作用
。
5.具有式(i)的化学结构的丙二醇单硝酸酯
(
在本文中也被称为
pdmn
或
3-硝基氧基丙醇
(3-nop))
已被报道为显著减少反刍动物中的甲烷产生
(
参见例如
wo2012/084629)。
[0006][0007]
柠檬烯是一种天然存在的式
(ii)
化合物
[0008][0009]
例如，存在于柑橘类水果中
。
[0010]
令人惊奇的是，现已发现，柠檬烯和丙二醇单硝酸酯的组合使用导致协同减少的甲烷形成
。
[0011]
因此，丙二醇单硝酸酯和柠檬烯的组合使用通过显著减少在反刍动物的消化活动期间产生的甲烷排放而在缓解气候变化方面具有极大潜力
。
[0012]
因此，在第一实施方式中，本发明提供了柠檬烯和丙二醇单硝酸酯用于减少从反刍动物的消化活动引起的甲烷形成的用途
。
[0013]
在第二实施方式中，本发明进一步提供了一种用于减少从反刍动物的消化活动引起的甲烷产生的方法，所述方法包括向所述动物口服施用有效量的柠檬烯和丙二醇单硝酸酯
。
[0014]
在第三实施方式中，本发明涉及一种包含柠檬烯和丙二醇单硝酸酯的
(
反刍动物
)
饲料组合物或饲料添加剂
。
[0015]
众所周知，柠檬烯和丙二醇单硝酸酯可以混合在一起
(
即预混合
)
或单独地施用于反刍动物，而在后一种情况下，众所周知，丙二醇单硝酸酯和柠檬烯的施用发生在某个时间窗口内，即在至多
6h
内，优选地
3h
内，更优选地
1h
内，例如
0.5h
内
。
最优选地，如果单独施用，则将这两种成分同时施用于反刍动物，例如通过将它们同时添加到动物的饲料
(
日粮
)
中或添加到饲料架中
。
[0016]
优选地，在本发明的所有实施方式中，柠檬烯和丙二醇单硝酸酯以包含柠檬烯和丙二醇单硝酸酯的饲料组合物或饲料添加剂的形式一起施用
。
[0017]
众所周知的是，在本发明的所有实施方式中，柠檬烯和丙二醇单硝酸酯以有效量，即以导致当与对照
(
即未补充柠檬烯和丙二醇单硝酸酯的混合物的反刍动物
)
相比时甲烷减少优选地至少
10
％，更优选地至少
20
％，最优选地至少
30
％的量施用于反刍动物
。
[0018]
因此，本发明还涉及柠檬烯和丙二醇单硝酸酯的
(
组合
)
用途，其中当与对照
(
即，在不存在柠檬烯和丙二醇单硝酸酯的情况下
)
相比时，反刍动物中的甲烷产生减少了至少
10
％
。
优选地，甲烷减少至少
15
％，更优选地至少
20
％，甚至更优选地至少
25
％，最优选地至少
30
％
。
[0019]
丙二醇单硝酸酯
[cas
号：
100502-66-7]
是可以例如如
wo2004043898
或
wo2012084629
中概述的那样制造，并且可以商标在
dsm nutritional products ltd
获得的已知化合物
。
[0020]
柠檬烯
(cas
编号：
138-86-3
，非特异性
)
作为
d-柠檬烯
(5989-27-5)(
也称为
(r)-(+)-柠檬烯
)
和
l-柠檬烯
(5989-54-8)(
也称为
(s)-(-)-柠檬烯
)
以及它们的混合物出现
。
根据本发明，柠檬烯可以以相应的单一对映异构体的形式或作为其混合物使用
。
优选地，在本发明的所有实施方式中，柠檬烯以
d-异构体的形式或作为包含
d-异构体的对映体混合物，即作为
(
±
)
柠檬烯使用
。(r)-(+)-柠檬烯以及异构体混合物例如可从
sigma-aldrich
以
≥97
％
(hplc)
商购获得
。
[0021]
如本文所用的术语
‘
有效量’是指获得从反刍动物的消化活动产生的甲烷排放减少所需的量
。
众所周知，所述减少可以通过一个单一
(
每日
)
剂量或通过重复
(
每日
)
剂量来实现
。
此外，本领域技术人员应充分理解，根据本发明的用途
、
方法和组合物中柠檬烯和丙二醇单硝酸酯的有效量可以取决于已知因素而变化，所述已知因素为例如特定组合物及其施用方式和途径的特性
、
相应植物产品的柠檬烯含量
、
反刍动物的年龄
、
健康状况和体重
、
治疗频率，所有这些都可以由本领域的专家以正常试验或以有关摄入方案和
/
或制剂的通常考虑确定
。
[0022]
优选地，在本发明的所有实施方式中，待施用于反刍动物的丙二醇单硝酸酯的有效量选自
0.05g pdmn/
动物
/
天至
5g pdmn/
动物
/
天的范围，更优选地
0.1g pdmn/
动物
/
天至
4g pdmn/
动物
/
天的范围，最优选地
0.25g pdmn/
动物
/
天至
3g pdmn/
动物
/
天的范围
。
另外合适的有效量选自
0.5g pdmn/
动物
/
天至
3g pdmn/
动物
/
天或
1g pdmn/
动物
/
天至
3g pdmn/
动物
/
天的范围
。
[0023]
关于饲料，优选地，在本发明的所有实施方式中，饲料中丙二醇单硝酸酯的有效量选自
10mg pdmn/kg dm/
天至
300mg pdmn/kg dm/
天的范围，更优选地
25g pdmn/kg dm/
天至
150g pdmn/kg dm/
天的范围，最优选地
50g pdmn/kg dm/
天至
100g pdmn/kg dm/
天的范围
。
[0024]
优选地，在本发明的所有实施方式中，待施用于反刍动物的柠檬烯的有效量选自
0.05g
柠檬烯
/
动物
/
天至
100g
柠檬烯
/
动物
/
天的范围，更优选地
0.1g
柠檬烯
/
动物
/
天至
50g
柠檬烯
/
动物
/
天的范围，最优选地
0.5g
柠檬烯
/
动物
/
天至
25g
柠檬烯
/
动物
/
天
、1g
柠檬烯
/
动物
/
天至
25g
柠檬烯
/
动物
/
天
、5g
柠檬烯
/
动物
/
天至
25g
柠檬烯
/
动物
/
天
、10g
柠檬烯
/
动物
/
天至
25g
柠檬烯
/
动物
/
天
、
或
15g
柠檬烯
/
动物
/
天至
25
克柠檬烯
/
动物
/
天的范围
。
[0025]
关于饲料，在本发明的所有实施方式中，饲料中柠檬烯的有效量选自
5mg
柠檬烯
/kg dm/
天至
5g
柠檬烯
/kg dm/
天的范围，更优选地
5mg
柠檬烯
/kg dm/
天至
2.5g
柠檬烯
/kg dm/
天的范围，最优选地
5mg
柠檬烯
/kg dm/
天至
2g
柠檬烯
/kg dm/
天的范围，例如
10mg
柠檬烯
/kg dm/
天至
1.5g
柠檬烯
/kg dm/
天
、10mg
柠檬烯
/kg dm/
天至
1.25g
柠檬烯
/kg dm/
天或
10mg
柠檬烯
/kg dm/
天至
1g
柠檬烯
/kg dm/
天的范围
。
[0026]
在本发明的所有实施方式中，此外有利的是如果柠檬烯与丙二醇单硝酸酯的摩尔比
(
柠檬烯的摩尔数
/pdmn
的摩尔数
)
在
100
与
1(
例如
100
μm柠檬烯
/1
μ
m pdmn
至1μm柠檬烯
/1
μ
m pdmn)
之间，优选地在
75
至1之间，更优选地在
60
至5之间，例如在
50
至5之间
、40
至5之间
、30
至5之间或
25
至5之间
。
另外合适的范围涵盖
50:1
至
5:1、40:1
至
7.5:1、30:1
至
10:1、25:1
至
10:1
，以及
25:1
至
15:1。
[0027]
在本发明的所有实施方式中，丙二醇单硝酸酯优选以其粉末制剂的形式施用
。
[0028]
优选地，所述粉末制剂是包含
pdmn
和载体材料的粉末制剂
。
合适的载体包括食品和饲料行业中众所周知的任何载体，例如二氧化硅
(
硅石
)
，但不限于此
。
[0029]
包含
pdmn
和载体材料的粉末制剂通常通过以下方式制备：通过本领域中的标准方法将
pdmn
喷洒到载体材料上或与载体材料掺混，例如通过在适合于制备食品或饲料产品的有机溶剂
(
例如二氯甲烷
)
中稀释
pdmn
，将所述溶液喷洒到载体上或与载体掺混，之后蒸发有机溶剂
。
[0030]
或者，
pdmn
可以在喷洒到载体材料上或与载体材料掺混之前在合适的食用油中稀释
。
在后一种情况下，通常不去除相应的食用油
。
所述粉末制剂还可含有在用于饲料应用的粉末制剂的制备中使用的常用添加剂
。
[0031]
根据本发明的粉末制剂中的
pdmn
的量优选地选自基于组合物的总重量，1重量％至
20
重量％的范围，优选地2重量％至
15
重量％的范围，最优选地4重量％至
12
重量％的范围
。
[0032]
待在本发明的所有实施方式中使用的特别合适的粉末制剂基本上由如例如在
wo2018149756
和
wo2018149755
中概述并且可以作为
10
从
dsm nutritional products ltd
商购获得的
pdmn、
丙二醇和二氧化硅组成
。
[0033]
在本发明的另一优选实施方式中，将本发明的柠檬烯以单一饲料添加剂制剂
(
在本文中也称为柠檬烯添加剂制剂
)
的形式添加到动物的饲料
(
日粮
)
中
。
[0034]
如本文所用的术语饲料添加剂制剂是指
(
粉状
)
制剂，所述制剂可以直接添加到动物饲料
(
日粮
)
中或
(
优选地
)
用于制备饲料添加剂
。
[0035]
优选地，所述柠檬烯添加剂制剂包含如本文所定义的柠檬烯
、
至少一种载体和任选的抗氧化剂
。
[0036]
优选地，根据本发明的柠檬烯添加剂制剂中柠檬烯的
(
总
)
量选自
0.1
重量％至
10
重量％，优选地
0.25
重量％至5重量％，优选地
0.3
％至
2.5
％的范围
。
另外合适的范围包括
0.3
％至1％，但也包括
10
％至
50
％
、15
％至
50
％和
20
％至
30
％的范围
。
[0037]
在一个优选的实施方式中，在不存在六种或更多种酚类化合物的情况下，例如特别是在不存在选自由以下组成的组的六种或更多种酚类化合物的情况下补充
pdmn
和柠檬烯：
3-羟基苯酚
(cas
号：
108-46-3)、2-甲氧基苯酚
(cas
号：
90-05-1)、3-甲基苯酚
(cas
号：
108-39-4)、2-(1-甲基乙基
)-5-甲基-苯酚
(cas
号：
89-83-8)、4-烯丙基-2-甲氧基苯酚
(cas
号：
97-53-0)、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛
(cas
号：
121-33-5)、5-异丙基-2-甲基苯酚
(cas
号：
499-75-2)、2-羟基苯甲酸酯
(
水杨酸酯
)
和单宁酸
(cas
号：
1401-55-4)。
[0038]
在另一优选的实施方式中，在一种或多种，然而更优选地少于6种酚类物质的存在下，即在1种
、2
种
、3
种
、4
种或5种酚类化合物的存在下的补充
pdmn
和柠檬烯
。
优选地，所述酚类化合物选自由以下组成的组：
3-羟基苯酚
(cas
号：
108-46-3)、2-甲氧基苯酚
(cas
号：
90-05-1)、3-甲基苯酚
(cas
号：
108-39-4)、2-(1-甲基乙基
)-5-甲基-苯酚
(cas
号：
89-83-8)、4-烯丙基-2-甲氧基苯酚
(cas
号：
97-53-0)、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛
(cas
号：
121-33-5)、5-异丙基-2-甲基苯酚
(cas
号：
499-75-2)、2-羟基苯甲酸酯
(
水杨酸酯
)
和单宁酸
(cas
号：
1401-55-4)。
优选的水杨酸酯是水杨酸甲酯
、
水杨酸乙酯
、
水杨酸
3-甲基-2-丁酯
、
水杨酸异戊酯和水杨酸苄酯
。
在本发明的所有实施方式中最优选的是使用水杨酸苄酯
(cas
号：
118-58-1)、
水杨酸
3-甲基-2-丁酯和
/
或水杨酸异戊酯
(cas
号：
87-20-7)
，甚至更优选地水杨酸苄酯和
/
或水杨酸异戊酯，例如特别是两者的混合物
。
[0039]
在本发明的所有实施方式中，另外优选的是如果丙二醇单硝酸酯和柠檬烯在不存在任何抗生素
(
例如优选地莫能菌素
)
的情况下施用
(
即不与任何抗生素同时施用
)
，一种或多种对硝基苯胺衍生物
(
例如对硝基苯胺
)
和
/
或一种或多种脂肪酸衍生物
、
一种含有至少5个碳原子的脂肪酸
(
例如月桂酸
)。
[0040]
在根据本发明的所有用途和方法中，柠檬烯和丙二醇单硝酸酯优选地通过将它们预先掺混或者通过单独添加到反刍动物的日粮中而同时施用于所述动物
。
[0041]
在本发明的一个优选实施方式中，将丙二醇单硝酸酯和柠檬烯作为单一
(
未预混的
)
成分添加到饲料中
。
[0042]
在本发明的另一优选实施方式中，将丙二醇单硝酸酯和柠檬烯作为预混合的成分添加到饲料中
。
[0043]
柠檬烯和丙二醇单硝酸酯优选地经由
(
反刍动物
)
饲料组合物或饲料添加剂施用于反刍动物，例如通过将个别组分与反刍动物的饲料掺混
。
[0044]
因此，优选地，在根据本发明的所有用途和方法中，将具有如本文所给出的所有定义和优选项的丙二醇单硝酸酯以及柠檬烯掺入
(
反刍动物
)
饲料组合物或饲料添加剂中而施用于反刍动物
。
[0045]
如本文所用的术语饲料组合物或饲料添加剂意指适合于或旨在供动物口服摄入的任何制备物
、
混合物或组合物
。
用于反刍动物
(
例如奶牛
)
的示例性饲料包括草料
(
草
、
豆类
、
青贮料
)、
干草料
、
草
、
谷物以及大豆，但不限于此
。
[0046]
所述饲料组合物或饲料添加剂可以通过饲料配制和加工领域中本身已知的方法来制备
。
[0047]
所述饲料组合物和饲料添加剂仍然是新颖的
。
因此，本发明的另外方面是包含具
有如本文所给出的所有定义和优选项的柠檬烯和丙二醇单硝酸酯的
(
反刍动物
)
饲料组合物和饲料添加剂
。
[0048]
在一个优选实施方式中，所述饲料组合物和饲料添加剂是矿物质预混物
、
包含维生素和任选的矿物质的维生素预混物
、
或大丸药
。
[0049]
柠檬烯和丙二醇单硝酸酯可以与动物饲料组合物
(
日粮
)
中存在的常规成分组合使用，所述常规成分为例如草料
(
生料
、
草
、
干草料
、
青贮料
)、
来自工业的副产品
(
柑橘渣
、
大豆皮
、
含可溶物的干酒糟或湿酒糟
)、
矿物质
(
碳酸钙
、
电解质
(
例如氯化铵
)、
常量矿物质和微量矿物质以及所有形式的无机和有机矿物质
)、
蛋白质
(
例如大豆粉
、
葵籽饼粉
、
肉骨粉
、
鱼粉
、
氨基酸
)
以及其他能量成分，例如谷物
、
小麦
、
淀粉
、
大麦
、
小米
、
高粱
、
玉米
、
动植物脂肪或油
、
以及维生素，但不限于此
。
[0050]
本发明的饲料组合物的具体示例如下：
[0051]-动物饲料添加剂，所述动物饲料添加剂包含
(a)
丙二醇单硝酸酯和
(b)
柠檬烯以及
(c)
以下中的一种或多种：
(c-1)
脂溶性维生素
、(c-2)
水溶性维生素
、(c-3)
微量矿物质和
(c-4)
常量矿物质；
[0052]-动物饲料组合物，所述动物饲料组合物包含
(a)
丙二醇单硝酸酯和
(b)
柠檬烯以及
(c)
以下中的一种或多种：
(c-1)
含量为
50g/kg
饲料至
800g/kg
饲料
(50-80
％
)
的粗蛋白
、(c-2)5-100g/kg
饲料
(5-10
％
)
的脂肪
、(c-3)150-700g/kg
饲料
(15-70
％
)
的
ndf、(c-4)300-800(30-80
％
)
的
tdn、
和
(c-5)150-700g/kg
饲料
(15-70
％
)
的淀粉
。
[0053]
所谓的预混物是本发明的动物饲料添加剂的示例
。
预混物表示一种或多种微量成分与稀释剂和
/
或载体的优选均匀混合物
。
预混物用于促进微量成分在较大混合物中的均匀分散
。
[0054]
除了本发明的活性成分
(
即柠檬烯和丙二醇单硝酸酯
)
之外，本发明的预混物优选地含有至少一种脂溶性维生素，和
/
或至少一种水溶性维生素，和
/
或至少一种微量矿物质，和
/
或至少一种常量矿物质
。
换句话说，本发明的预混物包含丙二醇单硝酸酯和柠檬烯以及至少一种选自由以下组成的组的附加组分：脂溶性维生素
、
水溶性维生素
、
微量矿物质和常量矿物质
。
[0055]
常量矿物质可以单独添加到饲料中
。
因此，在具体实施方式中，预混物包含柠檬烯和丙二醇单硝酸酯与至少一种选自由脂溶性维生素
、
水溶性维生素和微量矿物质组成的组的附加组分的混合物
。
[0056]
以下是这些组分的示例的非排他性列表：
[0057]-脂溶性维生素的示例是维生素
a、
维生素
d3、
维生素e和维生素k，例如维生素
k3。
[0058]-水溶性维生素的示例是维生素
b12、
生物素和胆碱
、
维生素
b1、
维生素
b2、
维生素
b6、
烟酸
、
叶酸和泛酸盐
(
泛酸酯
)
，例如
d-泛酸钙
。
[0059]-微量矿物质的示例是锰
、
锌
、
铁
、
铜
、
碘
、
硒
、
锰和钴
。
[0060]-常量矿物质的示例是钙
、
磷
、
钾
、
镁和钠
。
[0061]
关于用于反刍动物
(
例如奶牛
)
的饲料组合物及其成分，反刍动物日粮通常由易降解级分
(
称为浓缩物
)
和富含纤维的不太易降解级分
(
称为干草料
、
草料或粗饲料
)
构成
。
[0062]
干草料由干草
、
豆类或全谷物制成
。
草类尤其包括温带或热带草类
、
梯牧草
、
黑麦草
、
羊茅草
、
臂形草属
(brachiaria)、
黍属
(panicum)、
百慕达草
。
豆类尤其包括三叶草
、
紫花
苜蓿或苜蓿
、
豌豆
、
菜豆和巢菜
。
全谷物尤其包括大麦
、
玉蜀黍
(
玉米
)、
燕麦
、
小麦
、
高粱
。
其他草料作物包括甘蔗
、
甘蔗渣
、
柑橘渣
、
羽衣甘蓝
、
芸苔和白菜
。
块根作物，例如萝卜
、
瑞典甘蓝
(swede)、
饲料甜菜
(mangles)、
饲用甜菜和糖用甜菜
(
包括甜菜粕和甜菜糖蜜
)
也被用来饲喂反刍动物
。
其他作物还有块茎，例如土豆
、
木薯和甘薯
。
青贮料是富含纤维的级分
(
例如来自草类
、
豆类或全谷物
)
和谷粒
(
例如高水分玉米青贮料
)
的青贮形式，其中将具有高含水量的材料用受控厌氧发酵过程
(
自然发酵或添加剂处理
)
进行处理，但不限于此
。
[0063]
精饲料主要由谷类谷粒
(
例如大麦，包括啤酒糟和蒸馏酒粕
、
玉蜀黍
、
小麦
、
高粱
)
构成，但也往往含有富含蛋白质的饲料成分，例如大豆粉
、
菜籽粕
、
棕榈仁和葵籽饼粉，但不限于此
。
[0064]
反刍动物
(
雄性
、
雌性以及所有生长阶段和成年的反刍动物
)
也可以饲喂全混合日粮
(total mixed ration,tmr)
，其中所有日粮猪粪，例如草料
、
青贮料
、
其他饲料成分和浓缩物，在使用前混合
。
[0065]
如上所述，预混物是可包含柠檬烯和丙二醇单硝酸酯的饲料添加剂的示例
。
应当理解，化合物可以以不同的其他形式施用于动物
。
例如，化合物还可包含在大丸药中，所述大丸药将被放置在瘤胃中并且将在特定的时间段内以明确限定的剂量连续释放限定量的活性化合物
。
[0066]
在特别有利的实施方式中，根据本发明的饲料组合物是反刍动物饲料
(
往往也称为反刍动物日粮
)
，其中包括所有日粮组分，例如常量成分和微量成分
、
草料
、
青贮料和精饲料以及添加剂
(
包括柠檬烯和丙二醇单硝酸酯
)。
此类反刍动物饲料或日粮通常也称为全混合日粮
(tmr)
或部分混合日粮
(pmr)
或用于放牧动物的营养补充剂
。
[0067]
优选地，在本发明的所有实施方式中，在所述反刍动物饲料中，丙二醇单硝酸酯的量选自
1mg/kg
干物质饲料至约
25g/kg
干物质饲料，优选地约
1mg/kg
干物质饲料至约
10g/kg
干物质饲料，更优选地约
10mg/kg
干物质饲料至约
1g/kg
干物质饲料，最优选地
20mg/kg
干物质饲料至
500mg/kg
干物质饲料，例如约
20mg/kg
干物质饲料至
250mg/kg
干物质饲料，或者甚至更优选地
10mg/kg
干物质饲料至
300mg/kg
干物质饲料的范围，例如
50mg/kg
干物质饲料至
150mg/kg
干物质饲料或
60mg/kg
干物质饲料至
100mg/kg
干物质饲料的范围
。
[0068]
优选地，在本发明的所有实施方式中，在所述反刍动物饲料中，柠檬烯的量选自
5mg
柠檬烯
/kg
干物质饲料至约
5g
柠檬烯
/kg
干物质饲料，优选地约
5mg
柠檬烯
/kg
干物质饲料至约
2.5g
柠檬烯
/kg
干物质饲料，更优选地
5mg
柠檬烯
/kg
干物质饲料至约
2g
柠檬烯
/kg
干物质饲料，最优选地
10mg
柠檬烯
/kg
干物质饲料至
1.5g
柠檬烯
/kg
干物质饲料的范围
。
另外特别合适的范围是
10mg
柠檬烯
/kg
干物质饲料至
1.25g
柠檬烯
/kg
干物质饲料或
10mg
柠檬烯
/kg
干物质饲料至
1g
柠檬烯
/kg
干物质饲料
。
[0069]
牛的每日干物质摄入量一般在1％干物质
/kg
活体重量至
3.5
％干物质
/kg
活体重量的范围内
。
奶牛的干物质摄入量
(dry matter intake,dmi)
的量为例如约
2-3
％干物质
/kg
活体重量，肉牛的干物质摄入量的量通在活体重量的
1.0-3
％之间，具体取决于作为饲育场或放牧的饲喂系统
。
[0070]
还应充分理解的是，在根据本发明的所有用途和方法中，柠檬烯和丙二醇单硝酸酯必须及时一起补充以发挥协同作用，然而柠檬烯和丙二醇单硝酸酯可以单独添加到动物的日粮中，例如可以单独添加到相应的饲喂架中
。
[0071]
因此，本发明涉及一种向反刍动物补充柠檬烯和丙二醇单硝酸酯的方法，所述方法涵盖将具有如本文所给出的所有定义和优选项的柠檬烯和丙二醇单硝酸酯同时添加至饲料架的步骤
。
[0072]
施用于反刍动物的反刍动物饲料的量可以取决于种类和年龄而变化
。
通常，饲喂给肉牛或奶牛的干物质的量选自活体重量的
1.5
％至
3.5
％的范围，例如对于活体重量为
500kg
的动物，其意指饲喂
7.5kg
干物质
/
天至
17.5kg
干物质
/
天
。
[0073]
在本发明的所有实施方式中，应理解为通过口服施用
、
简单饲喂或手动施用大丸药
。
还应充分理解的是，丙二醇单硝酸酯和柠檬烯可以在施用前预混合或者可以单独添加到动物饲料组合物和饲料添加剂中
。
[0074]
可以通过本领域已知的方法在代谢室中的个别动物中容易地测量反刍动物的甲烷排放
(grainger
等人
,2007j.dairy science
；
90:2755-2766)。
此外，还可以通过使用激光束的新兴技术
(mcginn
等人
2009,journal of environmental quality
；
38:1796-1802)
或六氟化硫或仅
sf6
或
greenfeed
系统在谷仓层面进行评定
。
或者，也可以根据
wo 2009/156453
通过测量乳汁中的脂肪酸谱来评定由产奶反刍动物产生的甲烷
。
[0075]
本发明还涉及根据本发明的饲料组合物或饲料添加剂的用途，所述饲料组合物或饲料添加剂包含一种或多种附加的活性物质，所述活性物质对于瘤胃中的甲烷形成显示出类似的效应并且选自由以下组成的组：二烯丙基二硫化物
、
大蒜油
、
异硫氰酸烯丙酯
、
去氧胆酸
、
鹅去氧胆酸以及它们的衍生物
。
[0076]
可以与柠檬烯和丙二醇单硝酸酯一起给予的另外组分是例如酵母
、
牛至提取物
、
单宁和单宁酸以及精油
(
例如百里酚
、3-甲基苯酚
、
香兰素
、
愈创木酚和丁子香酚
)。
[0077]
目前预期二烯丙基二硫化物
、
大蒜油
、
异硫氰酸烯丙酯
、
去氧胆酸
、
鹅去氧胆酸以及它们的衍生物以例如
0.01-500mg
活性物质
/kg
饲料
(ppm)
的剂量范围独立地施用
。
这些化合物是商购可得的或者可以由技术人员使用现有技术中众所周知的工艺和方法容易地制备
。
[0078]
根据本发明的反刍哺乳动物包括牛
、
山羊
、
绵羊
、
长颈鹿
、
美洲野牛
、
欧洲野牛
、
牦牛
、
水牛
、
鹿
、
骆驼
、
羊驼
、
美洲驼
、
角马
(wildebeest)、
羚羊
、
叉角羚和蓝牛羚
。
[0079]
对于本发明的所有实施方式，家牛
、
绵羊和山羊是更优选的物种
。
就本发明的目的而言，最优选的物种是家牛
。
该术语包括所有种族的家牛和所有生产品种的牛，特别是奶牛和肉牛
。
众所周知，术语奶牛和肉牛涵盖所有年龄和生命生理阶段的动物以及例如圈养
、
半圈养和放牧的生产系统
。
[0080]
在另外的实施方式中，本发明涉及柠檬烯用于在反刍动物中协同增强丙二醇单硝酸酯的甲烷减少性质的用途
。
众所周知，如本文所定义的所有定义和性质也适用于所述用途
。
[0081]
通过以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例不应被视为限制本发明的范围
。
实施例
[0082]
甲烷产生的体外测试：使用“霍恩海姆饲用价值测试
(hohenheim forage value test,hft)”的修改版本来测试特定化合物对由这种体外系统模拟的瘤胃功能的影响
。
[0083]
原则：将饲料与瘤胃液和适当的缓冲液混合物的组合物一起加入注射器中
。
将溶液在
39℃
下孵育
。
在8小时后，测量产生的气相的量
(
和组成
)
并代入换算公式中
。
[0084]
试剂：
[0085]
常量元素溶液：
[0086]-6.2g
的磷酸二氢钾
(kh2po4)
[0087]-0.6g
的七水合硫酸镁
(mgso4*7h2o)
[0088]-9ml
浓磷酸
(1mol/l)
[0089]-溶于蒸馏水中至
1l(ph
为约
1.6)
[0090]
缓冲液：
[0091]-35.0g
的碳酸氢钠
(nahco3)
[0092]-4.0g
的碳酸氢铵
((nh4)hco3)
[0093]-溶于蒸馏水中至
1l
[0094]
微量元素溶液：
[0095]-13.2g
的二水合氯化钙
(cacl2*2h2o)
[0096]-10.0g
的四水合氯化锰
(ii)(mncl2*4h2o)
[0097]-1.0g
的六水合氯化钴
(ii)(cocl2*6h2o)
[0098]-8.0g
的氯化铁
(iii)(fecl3*6h2o)
[0099]-溶解于蒸馏水至
100ml
[0100]
钠盐溶液：
[0101]-100mg
的钠盐
[0102]-溶解于蒸馏水至
100ml
[0103]
还原溶液：
[0104]-向
71.25ml
的
h2o
中首先添加
3ml
的氢氧化钠
(c
＝
1mol/l)
，然后添加
427.5mg
的硫化钠水合物
(na2s*h2o)
[0105]-溶液必须在添加到培养基溶液中之前不久制备
[0106]
工序：
[0107]
样品称重：将饲料原料
(
即
tmr(44
％浓缩物
、6
％干草料
、37
％玉米青贮料和
13
％草青贮料
)
过筛至
1mm
并精确称重到
64
个注射器中
。
这些注射器中的4个注射器是底物对照，所述底物对照显示未受测试化合物影响的气体产生
。4
个其他注射器是阳性对照
(3-nop
，
10
μ
m)。
在需要时，4个注射器包含载体对照
(
如果测试化合物需要载体
)。
其余注射器含有测试物质，每组4个注射器，量如表1所示
。
[0108]
培养基溶液的制备：
[0109]
将各组分按以下次序在
woulff
瓶中混合：
[0110]-711ml
的水
[0111]-0.18ml
的微量元素溶液
[0112]-355.5ml
的缓冲液
[0113]-355.5ml
的常量元素溶液
[0114]
将完成的溶液温热至
39℃
，之后添加
1.83ml
钠盐溶液并在
36℃
下添加还原溶液
。
当指示剂变成无色时，添加瘤胃液
。
[0115]
瘤胃液的提取：在持续搅动和
co2充气的情况下将
750ml
的瘤胃液添加至约
1400ml
的培养基溶液中
。
[0116]
填充注射器
、
孵育并确定气体体积和
vfa
值：将稀释的瘤胃液
(24ml)
添加到玻璃注射器中
。
然后将注射器在
39℃
下在温和搅动下孵育8小时
。
在8小时后，测量所产生的气体的体积，并通过气相色谱法测定气相中甲烷的百分比
。
[0117]
结果
[0118]
被发酵的饲料为人工
tmr(44
％浓缩物
、6
％干草料
、37
％玉米青贮料和
13
％草青贮料
)。d-柠檬烯获自
sigma-aldrich(g8761)
并且以如表1所示的浓度使用
。3-硝基氧基-丙醇
(pdmn)
以如表1所示的浓度使用
。
相应的体外数据与同体内相同甲烷减少相关的剂量方案相关联
。
[0119]
结果在下表中呈现
。
当丙二醇单硝酸酯与柠檬烯组合时，在甲烷减少方面获得了明显的协同效应，这也转化为动物的附加性能益处
。
[0120]
表1：平均四到八次的使用
d-柠檬烯
(dl)、
丙二醇单硝酸酯
(pdmn)
或两者的组合的实验导致的对甲烷产生的影响
。
[0121][0122][0123]
*
预期值＝柠檬烯和
pdmn
的个别贡献的总和
[0124]
#
协同作用＝实测值
/
预期值
*100
％
[0125]
表2：体外数据与相应剂量
/
饲喂方案的相关性
[0126][0127]
§
基于体外
/
体内数据的相关性
[0128]
°
基于相应的平均饲料摄入量
/
动物
/
天