经由优化的接头和锚定部分与生物活性分子连接的细胞外囊泡的制作方法

本公开提供了细胞外囊泡(ev)(例如，外泌体)，其可以用作防治或治疗癌症和其他疾病的药剂，其包括至少一种经由优化的接头(linker)和锚定部分连接到细胞外囊泡(例如，外泌体)的生物活性分子。

背景技术：

1、很多生物活性化合物具有有治疗意义的有效生物活性。然而，这些化合物通常在非靶标器官中表现出毒性。限制非靶标组织暴露的一种方式是将小分子化学缀合至基于亲和力的试剂(例如抗体)，其可以将治疗性化合物引导至特定的细胞类型(dosio,f.et al.,toxins(basel)3(7):848-883(2011))，但这种方法受到可以连接到抗体上的感兴趣化合物的分子数量(通常每个抗体2-6个分子)的限制，以及受到特异性结合到被靶向的相关患病/效应细胞而不结合到非靶标细胞的抗体的可用性/存在的限制。这两个问题分别通过降低效力和增加全身毒性来限制抗体-药物缀合物(adc)的使用。因此，需要具有比adc更高的有效负载(payload)的递送系统，其可以选择性地靶向特定组织或器官，同时限制治疗性化合物的总体全身暴露。

2、ev(例如，外泌体)是细胞间通讯的重要介质。它们也是许多疾病(例如癌症)的诊断和预后的重要生物标志物。作为药物递送载体，ev(例如，外泌体)在许多治疗领域作为一种新的治疗模式，提供了许多优于传统药物递送方法(例如，肽免疫、dna疫苗)的优势。然而，尽管有其优点，许多ev(例如，外泌体)的临床效力有限。例如，在不能手术的非小细胞肺癌(nsclc)患者的一线化疗后，将树枝状细胞来源的外泌体(dex)在ii期临床试验中作为维持免疫疗法进行了研究。然而，由于未达到主要终点(至少50％的患者在化疗停止后具有4个月的无进展生存时间(pfs))，该试验被终止。besse,b.,et al.,oncoimmunology 5(4):e1071008(2015)。

3、因此，需要新的、更有效的工程化ev(例如，外泌体)，以更好地实现基于ev的技术的治疗用途和其他应用。

技术实现思路

1、本公开提供了一种细胞外囊泡(ev)，其包括经由根据式：[am]-l1-[sp1]-l2-[sp2]-l3-[bam](式1)的锚定部分(am)共价连接到ev的生物活性分子(bam)，其中：[am]是锚定部分；l1是可裂解或不可裂解的键联(linkage)；l2和l3是可选的可裂解或不可裂解的键联；sp1是可选的第一间隔子(spacer)；以及，sp2是可选的第二间隔子。

2、在一些方面，锚定部分[am]包含固醇(sterol)、脂质、维生素、肽、或其组合以及可选地间隔子。在一些方面，可选的间隔子是烷基间隔子。在一些方面，烷基间隔子是c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14或c15。在一些方面，烷基间隔子是c6或c8。在一些方面，可选的间隔子是甘醇间隔子。在一些方面，甘醇间隔子具有2(二甘醇)、3(三甘醇)、4(四甘醇；teg)、5(五甘醇)、6(六甘醇；heg)、7、8、9、10、11、12、13、14或15个甘醇单元。在一些方面，甘醇间隔子是四甘醇(teg)。

3、在一些方面，固醇选自由胆固醇、麦角固醇、7-脱氢胆固醇、24s-羟基胆固醇、羊毛固醇、环阿屯醇、岩藻固醇、大褐马尾藻固醇(saringosterol)、菜油固醇、β-谷固醇、谷甾烷醇、粪固醇、燕麦固醇和豆固醇组成的组。在一些方面，固醇是胆固醇。在一些方面，脂质是脂肪酸。在一些方面，脂肪酸是直链脂肪酸。在一些方面，脂肪酸是直链脂肪酸、支链脂肪酸、不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、羟基脂肪酸、多元羧酸、或其任何组合。在一些方面，直链脂肪酸是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸或硬脂酸。在一些方面，直链脂肪酸是棕榈酸。在一些方面，维生素是维生素e(生育酚或生育三烯酚)、维生素d、维生素k、核黄素(riboflavin)、烟酸或吡哆醇(pyridoxine)。在一些方面，维生素是维生素e(生育酚或生育三烯酚)。

4、在一些方面，l1是包含磷酸二酯键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。在一些方面，l2是可选的包含磷酸二酯酶键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。在一些方面，l3是可选的包含磷酸二酯酶键的可裂解的键联或包含硫代磷酸酯键的不可裂解的键联。在一些方面，sp1可选的第一间隔子和/或sp2可选的第二间隔子独立地包括烷基间隔子、甘醇间隔子、或其组合。在一些方面，烷基间隔子是c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c10、c11、c12、c13、c14或c15。在一些方面，烷基间隔子是c3或c6。在一些方面，甘醇间隔子具有2(二甘醇)、3(三甘醇)、4(四甘醇；teg)、5(五甘醇)、6(六甘醇；heg)、7、8、9、10、11、12、13、14或15个甘醇单元。在一些方面，甘醇间隔子是四甘醇(teg)或六甘醇(heg)。在一些方面，每个不可裂解的间隔子独立地选自烷基、二甘醇、三甘醇、四甘醇(teg)、六甘醇(heg)、五甘醇、聚乙二醇(peg)、甘油、二甘油、三甘油、四甘油(tg)、五甘油、六甘油(hg)、聚甘油(pg)、琥珀酰亚胺、马来酰亚胺、或其任何组合。在一些方面，聚乙二醇(peg)的特征在于式r1-(o-ch2-ch2)n-或r1-(o-ch2-ch2)n-o-，其中r1是氢、甲基或乙基，并且n是1至15之间的整数。在一些方面，聚甘油(pg)的特征在于式((r1—o—(ch2—choh—ch2o)n—)，其中r1是氢、甲基或乙基，并且n是1至15之间的整数。

5、在一些方面，l1、l2或l3可裂解的键联或其任何组合包括氧化还原可裂解的接头、活性氧可裂解的接头、ph依赖性可裂解的接头、酶可裂解的接头、蛋白酶可裂解的接头、酯酶可裂解的接头、磷酸酶可裂解的接头、光活化的可裂解的接头、自分解性的接头、或其任何组合。在一些方面，l1、l2或l3可裂解的键联或其任何组合包括自分解性的接头。在一些方面，l1、l2或l3可裂解的键联或其任何组合包括肉桂基、萘基、联苯基、杂环、同源芳族、香豆素、呋喃、噻吩、噻唑、噁唑、异噁唑、吡咯、吡唑、吡啶、咪唑酮、三唑、或其任何组合。

6、在一些方面，l1、l2或l3可裂解的键联或其任何组合具有式：-aa-yy-，其中每个–a-独立地是氨基酸单元或其组合，a独立地是1至15的整数；-y-是间隔子单元，并且y是0、1或2。在一些方面，-aa-是二肽、三肽、四肽、五肽或六肽、或其组合，其中组合中的每个二肽、三肽、四肽、五肽或六肽可以相同或不同。在一些方面，a是2，并且–aa-是选自由缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、n-甲基缬氨酸-瓜氨酸、环己基丙氨酸-赖氨酸、谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸、和β-丙氨酸-赖氨酸组成的组。在一些方面，–aa-是缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、或谷氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些方面，y是1。在一些方面，-y-是自分解性的间隔子。在一些方面，–yy-具有下式：

7、

8、其中每个r2独立地是c1-8烷基、-o-(c1-8烷基)、卤素、硝基或氰基；并且m是0至4的整数。在一些方面，m是0、1或2。在一些方面，m是0。

9、在一些方面，l1、l2或l3可裂解的键联或其任何组合包括缬氨酸-丙氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯、或缬氨酸-瓜氨酸-氨基甲酸对氨基苄酯。在一些方面，-y-是非自分解性的间隔子。在一些方面，非自分解性的间隔子是–gly-或–gly-gly-。

10、在一些方面，锚定部分[am]包含支架蛋白。在一些方面，锚定部分[am]和/或支架部分是支架x。在一些方面，支架x选自由前列腺素f2受体负调节因子(ptgfrn蛋白)；basigin(bsg蛋白)；免疫球蛋白超家族成员2(igsf2蛋白)；免疫球蛋白超家族成员3(igsf3蛋白)；免疫球蛋白超家族成员8(igsf8蛋白)；整联蛋白β-1(itgb1蛋白)；整联蛋白α-4(itga4蛋白)；4f2细胞表面抗原重链(slc3a2蛋白)；atp转运蛋白的类型(atp1a1、atp1a2、atp1a3、atp1a4、atp1b3、atp2b1、atp2b2、atp2b3和atp2b4蛋白)；其功能性片段；及其任何组合组成的组。在一些方面，支架x是ptgfrn蛋白或其功能性片段。在一些方面，支架x包含如seq id no:302中列出的氨基酸序列。在一些方面，支架x包含与seq id no:302至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％同一的氨基酸序列。在一些方面，生物活性分子[bam]经由锚定部分[am]连接到ev的外表面。在一些方面，生物活性分子[bam]是多肽、肽、多核苷酸(dna和/或rna)、化学化合物、或其任何组合。在一些方面，生物活性分子[bam]是化学化合物。在一些方面，化学化合物是小分子。

11、在一些方面，生物活性分子[bam]包含反义寡核苷酸(aso)、sirna、mirna、shrna、mrna、核酸、或其任何组合。在一些方面，生物活性分子[bam]包含肽、蛋白质、抗体或其抗原结合片段、或其任何组合。在一些方面，其抗原结合片段包含scfv、(scfv)2、fab、fab'、f(ab')2、f(ab1)2、fv、dab和fd片段、双功能抗体(diabody)、抗体相关多肽、或其任何片段。在一些方面，生物活性分子[bam]包含aso。在一些方面，aso靶向转录物。在一些方面，转录物是stat6转录物、cebp/β转录物、stat3转录物、kras转录物、nras转录物、nlpr3转录物、或其任何组合。在一些方面，ev是外泌体。在一些方面，外泌体是天然外泌体。在一些方面，外泌体是过表达ptgfrn的外泌体或其功能性片段。

12、本公开提供了一种药物组合物，其包含本文所公开的细胞外囊泡和药学上可接受的载剂。

13、本公开提供了一种试剂盒，其包含本文所公开的ev或药物组合物和使用说明书。

14、本公开提供了在有需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，其包括向受试者施用本文所公开的ev或药物组合物。在一些方面，该疾病或病症是癌症、炎症性病症、神经退行性疾病、中枢神经疾病或代谢性疾病。在一些方面，ev通过静脉内、腹膜内、鼻内、经口、肌内、皮下、胃肠外或瘤内施用。

15、本公开提供了将生物活性分子(bam)连接到ev的方法，其包括将锚定部分(am)连接到ev，其中根据式：[am]-l1-[sp1]-l2-[sp2]-l3-[bam]将锚定部分连接到生物活性部分(bam)，其中：[am]是锚定部分；l1是可裂解或不可裂解的键联；l2和l3是可选的可裂解或不可裂解的键联；sp1是可选的第一间隔子；以及，sp2是可选的第二间隔子。

16、在一些方面，[am]是胆固醇-c6、胆固醇-teg、生育酚-c8、生育酚、或棕榈酸酯-c6。在一些方面，l1、l2或l3或其组合是磷酸二酯键。在一些方面，sp1是c3、c6、teg或heg。在一些方面，l1、l2或l3或其组合是硫代磷酸酯键。在一些方面，sp2是c3、c6、teg或heg。在一些方面，l1、l2或l3或其组合是硫代磷酸酯键。在一些方面，[bam]是反义寡核苷酸(aso)。

17、本公开提供了增加连接到ev的生物活性分子(bam)的负载密度的方法，其包括筛选根据式：[am]-l1-[sp1]-l2-[sp2]-l3-[bam]连接到生物活性部分(bam)的大量的锚定部分(am)，其中：[am]是锚定部分；l1是可裂解或不可裂解的键联；l2和l3是可选的可裂解或不可裂解的键联；sp1是可选的第一间隔子；以及，sp2是可选的第二间隔子。

18、在一些方面，[am]是胆固醇-c6、胆固醇-teg、生育酚-c8、生育酚、或棕榈酸酯-c6。在一些方面，l1、l2或l3或其组合是磷酸二酯键。在一些方面，sp1是c3、c6、teg或heg。在一些方面，l1、l2或l3或其组合是硫代磷酸酯键。在一些方面，sp2是c3、c6、teg或heg。在一些方面，l1、l2或l3或其组合是硫代磷酸酯键。在一些方面，[bam]是反义寡核苷酸(aso)。在一些方面，连接到ev的生物活性分子(bam)的负载密度增加至少约1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少8倍、至少约9倍、或至少约10倍。

19、本公开提供了一种细胞外囊泡(ev)，其包括根据式：[am]-l1-[sp1]-l2-[sp2]-l3-[aso]经由锚定部分[am]共价连接到ev的反义寡核苷酸[aso]，其中：[am]是选自由胆固醇-c6、胆固醇-teg、生育酚-c8、生育酚和棕榈酸酯-c6组成的组的锚定部分；l1是磷酸二酯酶可裂解的键联；sp1是选自由c3、c6、teg和heg组成的组的可选的第一间隔子；l2是可选的硫代磷酸酯不可裂解的键联；sp2是选自由c3、c6、teg和heg组成的组的可选的第二间隔子；以及，l3是可选的硫代磷酸酯不可裂解的键联。

20、在一些方面，ev是外泌体。在一些方面，外泌体是天然外泌体。在一些方面，连接到外泌体的aso的负载密度增加了至少约1.5倍。在一些方面，锚定部分[am]是胆固醇-c6。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为5032+/-386。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量在约4500至约5500之间。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量在约4500至约4600之间、约4600至约4700之间、约4700至约4800之间、约4800至约4900之间、约4900至约5000之间、约5000至约5100之间、约5100至约5200之间、约5200至约5300之间、约5300至约5400之间、或约5400至约5500之间。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为至少约4500、至少约4600、至少约4700、至少约4800、至少约4900、至少约5000、至少约5100、至少约5200、至少约5300、至少约5400、或至少约5500。在一些方面，负载效率为73％至93％。在一些方面，负载效率在约70％至约95％之间。在一些方面，负载效率在约70％至约75％之间、约75％至约80％之间、约80％至约85％之间、约85％至约90％之间、或约90％至约95％之间。在一些方面，负载效率为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％。在一些方面，锚定部分[am]是胆固醇-teg。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为3991+/-490。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量在约3500至约4500之间。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量在约3500至约3600之间、约3600至约3700之间、约3700至约3800之间、约3800至约3900之间、约3900至约4000之间、约4000至约4100之间、约4100至约4200之间、约4200至约4300之间、约4300至约4400之间、或约4400至约4500之间。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为至少约3500、至少约3600、至少约3700、至少约3800、至少约3900、至少约4000、至少约4100、至少约4200、至少约4300、至少约4400、或至少约4500。在一些方面，负载效率为56％至79％。在一些方面，负载效率在约50％至约85％之间。在一些方面，负载效率在约50％至约55％之间、约55％至约60％之间、约60％至约65％之间、约65％至约70％之间、约70％至约75％之间、约75％至约80％之间、或约80％至约85％之间。在一些方面，负载效率为至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、或至少约85％。在一些方面，锚定部分[am]是生育酚-c8、生育酚或棕榈酸酯-c6。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为4241+/-722。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量在约3500至约5000之间。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量在约3500至约3600之间、约3600至约3700之间、约3700至约3800之间、约3800至约3900之间、约3900至约4000之间、约4000至约4100之间、约4100至约4200之间、约4200至约4300之间、约4300至约4400之间、约4400至约4500之间、约4500至约4600之间、约4600至约4700之间、约4700至约4800之间、约4800至约4900之间、或约4900至约5000之间。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为至少约3500、至少约3600、至少约3700、至少约3800、至少约3900、至少约4000、至少约4100、至少约4200、至少约4300、至少约4400、至少约4500、至少约4600、至少约4700、至少约4800、至少约4900、或至少约5000。在一些方面，负载效率为57％至73％。在一些方面，负载效率在约50％至约80％之间。在一些方面，负载效率在约50％至约55％之间、约55％至约60％之间、约60％至约65％之间、约65％至约70％之间、约70％至约75％之间、或约75％至约80％之间。在一些方面，负载效率为至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、或至少约80％。在一些方面，外泌体是过表达ptgfrn的外泌体。在一些方面，连接到外泌体的aso的负载密度增加了至少约2倍。在一些方面，锚定部分[am]是胆固醇-c6。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为2442+/-339。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量在约2000至约3000之间。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量在约2000至约2100之间、约2100至约2200之间、约2200至约2300之间、约2300至约2400之间、约2400至约2500之间、约2500至约2600之间、约2600至约2700之间、约2700至约2800之间、约2800至约2900之间、或约2900至约3000之间。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为至少约2000、至少约2100、至少约2200、至少约2300、至少约2400、至少约2500、至少约2600、至少约2700、至少约2800、至少约2900、或至少约3000。在一些方面，负载效率为27％至46％。在一些方面，负载效率在约25％至约50％之间。在一些方面，负载效率在约25％至约30％之间、约30％至约35％之间、约35％至约40％之间、约40％至约45％之间、或约45％至约50％之间。在一些方面，负载效率为至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、或至少约50％。在一些方面，锚定部分[am]是胆固醇-teg。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为1728+/-264。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量在约1400至约2100之间。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量在约1400至约1500之间、约1500至约1600之间、约1600至约1700之间、约1700至约1800之间、约1800至约1900之间、约1900至约2000之间、或约2000至约2100之间。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为至少约1400、至少约1500、至少约1600、至少约1700、至少约1800、至少约1900、至少约2000、或至少约2100。在一些方面，负载效率为19％至33％。在一些方面，负载效率在约15％至约35％之间。在一些方面，负载效率在约15％至约20％之间、约20％至约25％之间、约25％至约30％之间、或约30％至约35％之间。在一些方面，负载效率为至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、或至少约35％。在一些方面，锚定部分[am]是生育酚-c8、生育酚或棕榈酸酯-c6。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为2979+/-1006。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量在约1900至约4000之间。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量在约1900至约2000之间、约2000至约2100之间、约2100至约2200之间、约2200至约2300之间、约2300至约2400之间、约2400至约2500之间、约2500至约2600之间、约2600至约2700之间、约2700至约2800之间、约2800至约2900之间、约2900至约3000之间、约3000至约3100之间、约3100至约3200之间、约3200至约3300之间、约3300至约3400之间、约3400至约3500之间、约3500至约3600之间、约3600至约3700之间、约3700至约3800之间、约3800至约3900之间、或约3900至约4000之间。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为至少约1900、至少约2000、至少约2100、至少约2200、至少约2300、至少约2400、至少约2500、至少约2600、至少约2700、至少约2800、至少约2900、至少约3000、至少约3100、至少约3200、至少约3300、至少约3400、至少约3500、至少约3600、至少约3700、至少约3800、至少约3900、或至少约4000。在一些方面，负载效率为37％至68％。在一些方面，负载效率在约30％至约75％之间。在一些方面，负载效率在约30％至约35％之间、约35％至约40％之间、约40％至约45％之间、约45％至约50％之间、约50％至约55％之间、约55％至约60％之间、约60％至约65％之间、约65％至约70％之间、或约70％至约75％之间。在一些方面，负载效率为至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、或至少约75％。

21、本公开提供了一种外泌体，其包括根据式：[am]-l1-[sp1]-l2-[sp2]-l3-[bam]经由锚定部分[am]共价连接到外泌体的反义寡核苷酸[aso]，其中：[am]是胆固醇-teg；l1是磷酸二酯酶可裂解的键；sp1是c3；l2是硫代磷酸酯不可裂解的键；sp2是teg；以及，l3是硫代磷酸酯不可裂解的键。

22、在一些方面，外泌体是天然外泌体。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为约4780。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量在约4500至约5000之间。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为至少4500。在一些方面，负载效率为约80％。在一些方面，负载效率在约70％至约90％之间。在一些方面，负载效率为至少约70％。在一些方面，外泌体是过表达ptgfrn的外泌体。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为约1659。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量在约1500至约2000之间。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为至少约1500。在一些方面，负载效率为约28％。在一些方面，负载效率在约20％至约35％之间。在一些方面，负载效率为至少约20％。

23、本公开还提供了一种外泌体，其包括根据式：[am]-l1-[sp1]-l2-[bam]经由锚定部分[am]共价连接到外泌体的反义寡核苷酸[aso]，其中：[am]是胆固醇-teg；l1是磷酸二酯酶可裂解的键；sp1是teg；以及l2是硫代磷酸酯不可裂解的键。

24、在一些方面，外泌体是天然外泌体。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为约4090。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量在约3500至约4500之间。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为至少3500。在一些方面，负载效率为约68％。在一些方面，负载效率为至少约60％。在一些方面，负载效率在约60％至约70％之间。在一些方面，外泌体是过表达ptgfrn的外泌体。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为约1890。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量在约1400至约2400之间。在一些方面，每个外泌体的aso分子的平均数量为至少约1400。在一些方面，负载效率为约31％。在一些方面，负载效率在约20％至约40％之间。在一些方面，负载效率为至少约20％。