细胞接种剂和细胞移植用基材的制作方法

本发明涉及一种细胞接种剂和细胞移植用基材，尤其涉及一种角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞的接种剂和移植用基材。

背景技术：

1、由于角膜内皮细胞减少等角膜内皮损伤，损害了角膜内皮细胞的功能，并导致角膜基质水肿。这会导致角膜的透明度降低并使视力下降。这种情况称为大泡性角膜病变。另一方面，已知人角膜内皮细胞一旦受到损害就几乎没有再生能力。因此，当角膜内皮细胞因某些损伤而减少时，角膜移植是唯一有效的治疗手段。实际上，由于角膜内皮功能障碍导致的大泡性角膜病变约占角膜移植病例的一半。

2、目前，角膜内皮损伤患者通过移植角膜的上皮、基质和内皮全部三层结构的全层角膜移植治疗。虽然全层角膜移植是一项成熟的技术，但目前日本角膜供给不足，并且存在排斥反应的问题。为了解决这些问题，仅移植受损组织的“部分移植”正在变得普及。已知有保留角膜内皮而仅移植供体的上皮和基质的深板层角膜移植(deep lamellarkeratoplasty：dlkp)、和仅移植包含内皮的一部分角膜的角膜内皮移植等。但是，例如在角膜内皮移植时，其移植材料的来源仍然是角膜内皮本身，鉴于角膜提供者数量有限，与全层角膜移植相同，无法克服供体不足的问题。此外，角膜内皮细胞难以培养，制备足够数量的培养细胞用于移植所需时间、费用的负担大。

3、为了解决供体不足的问题，人们正在尝试创造成为角膜内皮细胞或具有与角膜内皮细胞同等功能的替代角膜内皮细胞的细胞。

4、例如，已经报道了从ips细胞或es细胞诱导成为替代角膜内皮细胞的细胞的方法。关于从ips细胞或es细胞向角膜内皮细胞(实际上，由于目前尚未建立角膜内皮细胞特异性表面标志物等，因此为与角膜内皮细胞性质接近的细胞，即所谓的角膜内皮样细胞(corneal endothelial like cell))的诱导方法、细胞培养方法，在非专利文献1中进行了综述。另外，本技术发明人以前确立了成为与角膜内皮细胞具有同等功能的替代角膜内皮细胞的细胞的制造方法(专利文献1～3)，并将由该方法得到的角膜内皮样细胞命名为“角膜内皮替代细胞”。来自ips细胞的角膜内皮替代细胞的对大泡性角膜病变的临床研究也已经开始。

5、现有技术文献

6、专利文献

7、专利文献1：wo/2013/051722

8、专利文献2：wo/2016/093359

9、专利文献3：wo/2019/142833

10、非专利文献

11、非专利文献1：hatou s,shimmura s；inflamm regen.2019；39:19.

技术实现思路

1、发明要解决的技术问题

2、为了大量生产目标细胞，尤其是从ips细胞或es细胞诱导的角膜内皮替代细胞，并将其转化为最终产品，在制造过程中，不仅需要进行细胞增殖，在跨越各步骤的传代操作(从细胞培养容器中收集细胞并重新接种到新的细胞培养容器的操作)中需要尽可能有效地植入(engraftment)细胞。另外，为了在不引起细胞的转化(transformation)的情况下进行传代操作，传代操作时培养基中所含的成分很重要。另外，将细胞悬液施用于眼前房内并使其均匀植入于角膜后表面(内皮表面)的操作为体内传代操作，与细胞接种时的培养基相同，移植用基材所含的成分也很重要。

3、在ips细胞的扩增培养步骤的传代操作中，使用将以y-27632为代表的rock抑制剂暂时添加到培养基中的方法。然而，本技术发明人发现，在从ips细胞向角膜内皮替代细胞的分化诱导步骤中使用rock抑制剂时，细胞骨架和紧密连接(tight junction)的形成受到抑制，导致被认为是上皮间质转化(emt)的转化。当emt发生时，角膜上皮细胞作为上皮细胞的功能(例如，屏障功能)降低。

4、因此，本发明的目的在于提供一种细胞接种剂和细胞移植用基材，其可以在不引起细胞转化的情况下传代操作，并且可以有效地植入细胞。

5、解决技术问题的手段

6、鉴于上述问题，本技术发明人进行了深入研究，结果发现当从ips细胞或es细胞诱导角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞时的传代操作中，即使在没有rock抑制剂的情况下，通过包含酚酞衍生物也能够有效地促进细胞的植入，并且在细胞移植用基材中酚酞衍生物也能促进在角膜后表面均匀地植入，结果提高移植细胞的治疗效果，从而完成了本发明。

7、即，本发明提供以下内容。

8、[1]一种用于促进培养角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞植入的接种剂，其含有酚酞衍生物。

9、[2]一种用于促进角膜内皮替代细胞植入的接种剂，其含有酚酞衍生物。

10、[3]根据上述[2]所述的接种剂，其中，角膜内皮替代细胞来自干细胞。

11、[4]根据上述[3]所述的接种剂，其中，干细胞为多能干细胞。

12、[5]根据上述[4]所述的接种剂，其中，多能干细胞来自ips细胞(包含通过基因编辑或基因导入而被赋予附加功能的细胞)。

13、[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的接种剂，其中，酚酞衍生物选自酚磺酞(酚红)、异戊酰酚酞、乙酰基酚酞、酚酞二丁酸酯、酚酞二磷酸酯、酚酞二硫酸酯、酚酞葡萄糖醛酸、酚酞单-β-葡糖苷酸、酚酞单-β-葡萄糖醛酸、酚酞单磷酸酯、甲酚红、百里香酚蓝和溴甲酚紫。

14、[7]根据上述[1]～[6]中任一项所述的接种剂，其中，酚酞衍生物为酚红。

15、[8]根据上述[7]所述的接种剂，其中，酚红浓度为1～20mg/l。

16、[9]根据上述[1]～[6]中任一项所述的接种剂，其中，酚酞衍生物为甲酚红。

17、[10]根据上述[9]所述的接种剂，其中，甲酚红浓度为1～20mg/l。

18、[11]根据上述[1]～[10]中任一项所述的接种剂，其特征在于，不含rock抑制剂。

19、[12]酚酞衍生物在用于制造促进培养角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞植入的接种剂中的用途。

20、[13]酚酞衍生物用于制造促进角膜内皮替代细胞植入的接种剂中的用途。

21、[14]根据上述[12]或[13]所述的用途，其中，角膜内皮替代细胞来自干细胞。

22、[15]根据上述[14]所述的用途，其中，干细胞为多能干细胞。

23、[16]根据上述[15]所述的用途，其中，多能干细胞来自ips细胞(包含通过基因编辑或基因导入而被赋予附加功能的细胞)。

24、[17]根据上述[12]～[17]中任一项所述的用途，其中，酚酞衍生物选自酚磺酞(酚红)、异戊酰酚酞、乙酰基酚酞、酚酞二丁酸酯、酚酞二磷酸酯、酚酞二硫酸酯、酚酞葡萄糖醛酸、酚酞单-β-葡糖苷酸、酚酞单-β-葡萄糖醛酸、酚酞单磷酸酯、甲酚红、百里香酚蓝和溴甲酚紫。

25、[18]根据上述[12]～[17]中任一项所述的用途，其中，酚酞衍生物为酚红。

26、[19]根据上述[12]～[17]中任一项所述的用途，其中，酚酞衍生物为甲酚红。

27、[20]一种酚酞衍生物，其用于在接种培养角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞时，促进该细胞的植入。

28、[21]一种酚酞衍生物，其用于在接种角膜内皮替代细胞时，促进该细胞的植入。

29、[22]根据上述[20]或[21]所述的衍生物，其中，角膜内皮替代细胞来自干细胞。

30、[23]根据上述[22]所述的衍生物，其中，干细胞为多能干细胞。

31、[24]根据上述[23]所述的衍生物，其中，多能干细胞来自ips细胞(包含通过基因编辑或基因导入而被赋予附加功能的细胞)。

32、[25]根据上述[20]～[24]中任一项所述的衍生物，其中，酚酞衍生物选自酚磺酞(酚红)、异戊酰酚酞、乙酰基酚酞、酚酞二丁酸酯、酚酞二磷酸酯、酚酞二硫酸酯、酚酞葡萄糖醛酸、酚酞单-β-葡糖苷酸、酚酞单-β-葡萄糖醛酸、酚酞单磷酸酯、甲酚红、百里香酚蓝和溴甲酚紫。

33、[26]根据上述[20]～[25]中任一项所述的衍生物，其中，酚酞衍生物为酚红。

34、[27]根据上述[20]～[25]中任一项所述的衍生物，其中，酚酞衍生物为甲酚红。

35、[28]一种促进细胞植入的方法，其特征在于，在酚酞衍生物存在下，接种培养角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞。

36、[29]一种促进细胞植入的方法，其特征在于，在酚酞衍生物存在下，接种角膜内皮替代细胞。

37、[30]根据上述[28]或[29]所述的方法，其中，所述角膜内皮替代细胞来自干细胞。

38、[31]根据上述[30]所述的方法，其中，所述干细胞为多能干细胞。

39、[32]根据上述[31]所述的方法，其中，所述多能干细胞来自ips细胞，包含通过基因编辑或基因导入而被赋予了附加功能的细胞。

40、[33]根据上述[28]～[32]中任一项所述的方法，其中，所述酚酞衍生物选自酚磺酞(酚红)、异戊酰酚酞、乙酰基酚酞、酚酞二丁酸酯、酚酞二磷酸酯、酚酞二硫酸酯、酚酞葡萄糖醛酸、酚酞单-β-葡糖苷酸、酚酞单-β-葡萄糖醛酸、酚酞单磷酸酯、甲酚红、百里香酚蓝和溴甲酚紫。

41、[34]根据上述[28]～[33]中任一项所述的方法，其中，酚酞衍生物为酚红。

42、[35]根据上述[28]～[33]中任一项所述的方法，其中，酚酞衍生物为甲酚红。

43、[36]一种细胞悬液，其含有上述[2]～[11]中任一项所述的接种剂和角膜内皮替代细胞。

44、[37]根据上述[36]所述的细胞悬液，其中，细胞浓度为1.0～20×104个细胞/ml。

45、[38]根据上述[36]或[37]所述的细胞悬液，其特征在于，以1.04×103个细胞/cm2以上且小于1.04×104个细胞/cm2的接种密度接种。

46、[39]一种培养角膜内皮细胞或角膜内皮替代细胞的移植用基材，其含有酚酞衍生物。

47、[40]一种角膜内皮替代细胞的移植用基材，其含有酚酞衍生物。

48、[41]根据上述[39]或[40]所述的基材，其中，角膜内皮替代细胞来自干细胞。

49、[42]根据上述[41]所述的基材，其中，干细胞为多能干细胞。

50、[43]根据上述[42]所述的基材，其中，多能干细胞来自ips细胞，包含通过基因编辑或基因导入而被赋予了附加功能的细胞。

51、[44]根据上述[39]～[43]中任一项所述的基材，其中，酚酞衍生物选自酚磺酞(酚红)、酚酞、溴酚蓝、异戊酰酚酞、乙酰基酚酞、酚酞二丁酸酯、酚酞二磷酸酯、酚酞二硫酸酯、酚酞葡萄糖醛酸、酚酞单-β-葡糖苷酸、酚酞单-β-葡萄糖醛酸、酚酞单磷酸酯、甲酚红、百里香酚蓝和溴甲酚紫。

52、[45]根据上述[39]～[44]中任一项所述的基材，其中，酚酞衍生物为酚红。

53、[46]根据上述[45]所述的基材，其中，酚红浓度为1～20mg/l。

54、[47]根据上述[39]～[44]中任一项所述的基材，其中，酚酞衍生物为甲酚红。

55、[48]根据上述[47]所述的基材，其中，甲酚红浓度为1～20mg/l。

56、[49]根据上述[39]～[48]中任一项所述的基材，其特征在于，不含rock抑制剂。

57、[50]一种细胞悬液，其含有上述[39]～[49]中任一项所述的基材和角膜内皮替代细胞。

58、[51]根据上述[50]所述的细胞悬液，其中，其用于向前房内移植。

59、[52]根据上述[51]所述的细胞悬液，其中，细胞浓度为0.5～10×106个细胞/ml。

60、发明的效果

61、根据本发明，可以在不引起细胞转化的情况下传代操作，并且可以有效地植入细胞。可以大量生产培养角膜内皮细胞和角膜内皮替代细胞，并进一步提高移植细胞的植入率，因此，可以提高治疗效果。