作为免疫原的广泛反应性病毒抗原、其组合物和使用方法

背景技术：

1、流感病毒感染是每年急性呼吸道疾病的重要就医原因，并且在美国和全世界均造成巨大的发病、死亡和经济负担。2009年流感大流行前不久，与流感相关的死亡每年造成超过611,000的生命损失，估计每年给社会造成870亿美元的损失。美国疾病控制与预防中心2017年估计，季节性流行性感冒疫苗的有效性仅为42％。这种有限的有效性是由于甲型流感h3n2疫苗毒株发生突变，从而导致感染个体的流行性感冒。此外，在2017年至2018年的时间段，乙型流感病毒引起的流行性感冒病例有所增加。由于严重的流行性感冒季节仅在美国就会导致约50,000人死亡，因此迫切需要新的和改进的提供针对病毒(特别是当前和未来流行的流感病毒毒株)的广泛保护的免疫原和疫苗。

2、其他病毒类型(诸如冠状病毒)的感染也会在人类和其他物种(例如，禽类物种，诸如家禽)中引起严重的疾病和病状。此类感染和疾病对产肉和产蛋禽类动物(例如，鸡)的健康和性能产生不利影响，从而导致行业的重大经济损失。因此，还需要新的和改进的提供针对当前和未来流行的其他病毒毒株(例如，禽病毒及其毒株)的广泛保护的免疫原和疫苗。

技术实现思路

1、如本文所述，提供了非天然存在的、广泛反应性的抗原和抗原序列，其源自流感病毒，诸如流感h1或h3病毒(也称为“h1或h3流感”、“h1或h3流感病毒”，或在本文简称为“h1或h3”)。在实施例中，非天然存在的广泛反应性抗原和抗原序列包含源自h1和h3流感病毒的ha的氨基酸序列，如本文seq id no:1-17中所提供的。在一个实施例中，ha抗原包含全长ha多肽。在一个实施例中，ha抗原包含可溶性ha(sha)，其缺少ha多肽的跨膜结构域和尾部结构域。

2、本文所述的流感病毒抗原可以是结构蛋白(多肽)或肽并且包括例如血凝素(ha)蛋白和/或包含ha蛋白的ha1(头部)或ha2(尾部或茎部)部分(结构域)，并且是有效的免疫原，其在受试者中引发针对ha蛋白并最终针对受试者中当前和未来病毒毒株的广泛反应性免疫应答。在一个实施例中，ha抗原构成全长ha蛋白，或缺少ha蛋白的跨膜(tm)和尾部结构域的可溶性ha(sha)。如本文所提及的，在受试者中引发免疫应答的病毒抗原或抗原序列(例如，流感病毒抗原)是免疫原性抗原(即，免疫原)。这些流感病毒免疫原被称为广泛反应性的，因为它们可以引发针对流感病毒的不同亚型或毒株的广泛反应性抗体的产生，这些亚型或毒株在它们的蛋白质抗原及其序列(特别是流感病毒的ha抗原)中具有序列相似性和变异性以及表位(抗原决定簇)多样性。

3、存在四种不同类型的流感病毒，其中三种(甲型、乙型和丙型流感)感染人类。在这三种传染性病毒中，甲型和乙型流感子集是最常见的类型，并且这些子集中的每一种都发展出不同的毒株或亚型。甲型和乙型流感病毒通常在人类中传播并引起季节性流行性感冒流行。作为非限制性示例，h1n1、h2n2、h3n2和h5n1毒株是甲型流感的亚型，其通常引起严重的流行性感冒疾病并且通过不断改变其表面蛋白(诸如血凝素(ha)蛋白)来调整以适合逃避被根除。流感病毒毒株的治疗尤其困难，因为其突变率异常高，并且无法生成有效对抗ha表面蛋白发生的相对快速变化的疫苗。

4、在一个实施例中，具有免疫原性的抗原(抗原序列)源自甲型流感病毒。在某些实施例中，免疫原源自h1或h3流感病毒毒株或类型。在一个实施例中，免疫原源自乙型流感病毒。在一个实施例中，抗原是病毒的结构蛋白。在一个特定实施例中，流感抗原是血凝素(ha)。在一个实施例中，ha抗原是全长ha。在一个实施例中，ha抗原是可溶性ha (sha)。在其他实施例中，流感抗原是神经氨酸酶(na)。

5、在一个方面，非天然存在的流感病毒氨基酸序列和包含本文所述序列的抗原(例如，结构抗原)含有反映过去、当前和未来流感病毒抗原的序列相似性和变异性的广泛反应性表位。因此，此类抗原序列和包含该序列的抗原是“非天然存在的、广泛反应性的”抗原。抗原具有免疫原性，并且当引入或施用于受试者时，在受试者中引发针对流感病毒(特别是h1或h3流感病毒蛋白抗原，诸如ha)或其抗体结合部分的广泛反应性抗体(诸如中和抗体)。在一个实施例中，引发的抗体还针对相关但不相同的h1或h3流感病毒类型具有反应性。在一个实施例中，此类流感病毒序列是氨基酸序列。在一个实施例中，流感病毒序列是多核苷酸序列，例如编码本文所述抗原的氨基酸序列的多核苷酸序列。为了便于参考，本文所述的流感病毒的“非天然存在的、广泛反应性的”抗原被称为“广泛反应性抗原”。

6、因此，本文所述的广泛反应性流感病毒抗原是免疫原，因为它们在受试者中引发广泛反应性免疫应答。免疫应答特别呈中和抗体应答的形式，例如，特异性针对流感病毒的ha抗原并中和ha蛋白的活性的中和抗体。因此，还提供了含有本文所述的广泛反应性流感病毒抗原的免疫原和免疫原性组合物，包括在受试者中诱导针对流感病毒、诸如针对流感病毒的ha蛋白的免疫应答的免疫原性组合物，诸如疫苗(例如，多肽或多核苷酸产物)。为了便于参考，本文所述的“非天然存在的、广泛反应性的流感病毒免疫原”将被称为“广泛反应性免疫原”。

7、还提供了使用本文所述的免疫原在受试者中诱导针对流感感染、疾病和/或其症状的免疫应答的方法。在一个特定实施例中，流感病毒抗原是流感病毒类型或亚型(诸如h1或h3流感病毒类型)或与其相关的病毒类型的ha、ha1或ha2蛋白，或其抗体结合部分。在其他实施例中，ha蛋白是全长或可溶性ha (sha)。还提供了使用免疫原在受试者中诱导免疫应答的方法。

8、在一个方面，ha免疫原性抗原与下文实例1中列出的seq id no:1-17的ha蛋白中的一种或多种的ha氨基酸序列至少或等于85％、至少或等于90％、至少或等于91％、至少或等于92％、至少或等于93％、至少或等于94％、至少或等于95％、至少或等于96％、至少或等于97％、至少或等于98％、或至少或等于99％相同。

9、在一个方面，提供了一种非天然存在的且免疫原性的流感病毒抗原，其包含与实例1中列出的seq id no:1-17中任一个的血凝素(ha)抗原的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列，或其免疫原性部分。在一个实施例中，流感病毒抗原包含与seq id no:1-17中任一个中列出的ha抗原的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，流感病毒抗原包含seq id no:1-17中任一个中列出的ha抗原的氨基酸序列。在一个实施例中，流感病毒抗原由seq id no:1-17中任一个中列出的ha抗原的氨基酸序列组成。在一个实施例中，ha抗原是全长ha蛋白。在一个实施例中，ha抗原是可溶性ha蛋白，其例如缺少ha蛋白的tm和尾部部分。在一个实施例中，流感病毒抗原包含seq id no:1-8中列出的全长ha (sha)蛋白抗原的氨基酸序列。在一个实施例中，流感病毒抗原包含seq id no:9-17中列出的可溶性ha(sha)蛋白抗原的氨基酸序列。在一个实施例中，流感病毒是h1或h3流感病毒。

10、另一方面提供了一种病毒样颗粒(vlp)，其包含根据前述方面中任一个的流感病毒免疫原性抗原。在一个实施例中，vlp包含编码流感病毒抗原的多核苷酸。在一个实施例中，vlp包含编码流感病毒ha或sha抗原的多核苷酸。在一个实施例中，vlp包含编码多肽的多核苷酸，该多肽包含下文实例1中提供的seq id no:1-17中任一个的氨基酸序列。在一个实施例中，流感病毒是h1或h3流感病毒。在一个实施例中，多核苷酸是rna或dna。在一个实施例中，rna是mrna。

11、另一方面，提供了一种非天然存在的免疫原，其能够生成针对当前和未来流感病毒毒株的免疫应答；其中该免疫原包含与实例1中提供的seq id no:1-17中列出的血凝素(ha)抗原或sha抗原的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。在一个实施例中，免疫原包含与实例1中提供的seq id no:1-17中列出的血凝素(ha)抗原或sha抗原的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列。

12、在本文上述方面中任一个的实施例中，病毒抗原、vlp或免疫原引发免疫应答，其包括中和抗体的产生。在一个实施例中，免疫应答包括具有血凝素抑制活性和/或神经氨酸酶抑制活性的抗体的产生。在一个实施例中，免疫应答进一步包括细胞免疫应答，例如抗原应答性t淋巴细胞的产生。

13、另一方面提供了一种免疫原性组合物或疫苗，其包含前述方面和/或实施例中任一个的流感病毒免疫原或vlp。在一个实施例中，免疫原性组合物或疫苗包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施例中，免疫原性组合物或疫苗进一步包含佐剂。

14、另一方面提供了一种药学上可接受的组合物，其包含前述方面和/或实施例中任一个的流感病毒抗原、免疫原或vlp，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施例中，组合物进一步包含佐剂。在一个实施例中，病毒或病毒抗原源自h1或h3流感病毒。在一个实施例中，ha抗原或免疫原是全长ha或可溶性流感ha抗原或免疫原。在实施例中，全长ha或可溶性ha流感抗原或免疫原包含实例1中提供的seq id no:1-17中列出的氨基酸序列。

15、另一方面提供了一种药学上可接受的组合物，其包含上述方面的免疫原性组合物或疫苗以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

16、另一方面提供了一种在受试者中生成免疫应答的方法，其中该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的前述方面和/或实施例中任一个的病毒抗原、vlp、免疫原、免疫原性组合物、疫苗或药物组合物。

17、另一方面提供了一种治疗由流感病毒感染引起的疾病和/或其症状或保护受试者免受该疾病和/或其症状的方法，该方法包括向受试者施用有效量的前述方面和/或实施例中任一个的病毒抗原、vlp、免疫原、免疫原性组合物、疫苗或药物组合物。在该方法的一个实施例中，受试者被流感病毒感染，或者处于被流感病毒感染的风险中或易被流感病毒感染。在该方法的一个实施例中，引发的免疫应答包括中和抗体的产生和/或细胞免疫应答，例如t淋巴细胞的产生。在该方法的一个实施例中，向受试者伴随施用佐剂。在该方法的一个实施例中，免疫应答是预防性的或治疗性的。在该方法的一个实施例中，向受试者施用佐剂或一种或多种抗病毒剂。在该方法的一个实施例中，受试者是人类受试者。在该方法的一个实施例中，受试者是非人类受试者或兽医受试者。

18、另一方面提供了一种多核苷酸，其编码前述方面和所述实施例中任一个的病毒抗原、特别是流感ha抗原(全长或可溶性ha)。在一个实施例中，多核苷酸是dna或rna。在一个实施例中，多核苷酸是mrna。在一个实施例中，病毒抗原是ha蛋白抗原。在一个特别的实施例中，ha蛋白抗原包含实例1中提供的seq id no:1-17中任一个的氨基酸序列。在实施例中，ha蛋白抗原是全长ha或可溶性ha。在一个实施例中，多核苷酸编码流感病毒抗原，其包含seq id no:1-8中列出的全长ha(sha)蛋白抗原的氨基酸序列。在一个实施例中，多核苷酸编码流感病毒抗原，其包含seq id no:9-17中列出的可溶性ha (sha)蛋白抗原的氨基酸序列。在一个实施例中，病毒是流感病毒。在一个实施例中，流感病毒是h1或h3流感病毒。在一个实施例中，上述多核苷酸含在组合物中，该组合物包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施例中，上述多核苷酸含在病毒样颗粒(vlp)中。

19、另一方面，提供了一种单价免疫原，其包含上述方面和/或其实施例的非天然存在的且免疫原性的流感病毒抗原。在一个实施例中，免疫原性流感病毒抗原包含本文所述的以下非天然存在的、广泛反应性的流感多肽免疫原：包含seq id no:15中列出的序列的y2；包含seq id no:3、7或9中列出的序列的j1；包含seq id no:4中列出的序列的j2；包含seqid no:5中列出的序列的j3；包含seq id no:6或8中列出的序列的j4；包含seq id no:11中列出的序列的ng1；包含seq id no:2或12中列出的序列的ng2；或包含seq id no:13中列出的序列的ng3。

20、另一方面，提供了一种多价免疫原，其包含上述方面和/或其实施例的非天然存在的且免疫原性的流感病毒抗原中的至少两种。在一个实施例中，免疫原包含非天然存在的且免疫原性的流感病毒抗原中的两种。在实施例中，免疫原是二价的并且包含：包含seq idno:15中列出的序列的y2和包含seq id no:6或8中列出的序列的j4的组合，或者包含seqid no:15中列出的序列的y2和包含seq id no:2或12中列出的序列的ng2的组合。在一个实施例中，多价免疫原包含本文所述的非天然存在的且免疫原性的流感病毒抗原中的八种。在前述单价或多价免疫原的实施例中，免疫原包含重组流感血凝素(rha)多肽。在前述单价或多价免疫原的实施例中，免疫原包含重组流感神经氨酸酶(rna)多肽。

21、另一方面，提供了一种病毒颗粒或病毒样颗粒(vlp)，其包含编码上述方面和/或其实施例中的任一个的免疫原性流感病毒抗原的一个或多个多核苷酸。

22、另一方面，提供了一种组合物，其包含上述方面和/或其实施例中任一个的单价或多价免疫原。在一个实施例中，组合物进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物，即药物组合物。

23、在一个方面，提供了一种组合物，其包含上述方面和/或其实施例的病毒颗粒或vlp。在一个实施例中，组合物进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物，即药物组合物。

24、在一个方面，提供了一种治疗或保护受试者免受由流感病毒感染引起的疾病和/或其症状的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的上述药学上可接受的组合物，该药学上可接受的组合物包含上述方面和/或其实施例中任一个的单价或多价免疫原。

25、在一个方面，提供了一种治疗或保护受试者免受由流感病毒感染引起的疾病和/或其症状的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的上述药学上可接受的组合物，该药学上可接受的组合物包含上述方面和/或其实施例的病毒颗粒或病毒样颗粒(vlp)。

26、在一个方面，提供了一种在受试者中生成免疫应答的方法，其中该方法包括向受试者施用有效量的药学上可接受的组合物，该药学上可接受的组合物包含上述方面和/或其实施例中任一个的单价、多价免疫原、或者病毒颗粒或病毒样颗粒。

27、定义

28、除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本文所述方面和实施例所属或所涉及领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。以下参考文献为本领域技术人员提供了本文所述方面和实施例中使用的许多术语的一般定义：singleton等人,dictionary of microbiology and molecular biology(第2版1994)；thecambridge dictionary of science and technology(walker编,1988)；the glossary ofgenetics,第5版,r.rieger等人(编),springer verlag(1991)；benjamin lewin,genes v,由oxford university press出版,1994(isbn 0-19-854287-9)；kendrew等人(编)；theencyclopedia of molecular biology,由blackwell science ltd.出版,1994(isbn 0-632-02182-9)；molecular biology and biotechnology:a comprehensive deskreference,robert a.meyers(编),由vch publishers,inc.出版,1995(isbn 1-56081-569-8)；以及hale&marham,the harper collins dictionary of biology(1991)。除非另有说明，否则如本文所用的以下术语具有以下赋予它们的含义。

29、“佐剂”是指非特异性增强针对抗原的免疫应答的物质或媒介物。佐剂可以包括其上吸附有抗原的矿物质悬浮液(例如，明矾、氢氧化铝或磷酸盐)；或油包水乳液，其中抗原溶液乳化在矿物油(例如，弗氏不完全佐剂)中，有时包含灭活的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。免疫刺激性寡核苷酸(诸如包含cpg基序的那些)也可用作佐剂(参见例如，美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705；和6,429,199)。佐剂还包括生物分子，诸如共刺激分子。示例性生物佐剂包括但不限于白细胞介素-1(il-2)、蛋白质记忆t细胞引诱剂“调节激活正常t细胞表达和分泌因子”(rantes)、粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(gm-csf)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、干扰素-γ(ifn-γ)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、淋巴细胞功能相关抗原3(lfa-3，也称为cd58)、簇分化抗原72(cd72)(b细胞响应性的负调节因子)、外周膜蛋白b7-1(b7-1，也称为cd80)、外周膜蛋白b7-2(b7-2，也称为cd86)、tnf配体超家族成员4配体(ox40l)或属于tnf超家族的2型跨膜糖蛋白受体(4-1bbl)。

30、“施用”意指向受试者给予、供应、分配、递送或施加组合物、药剂、治疗剂等，或者将或使组合物等与受试者接触。施用(administering/administration)可以通过多种途径中的任一种来完成，诸如但不限于局部、口服、皮下、肌内、腹膜内、静脉内(iv)、(注射)、鞘内、肌内、皮肤、皮内、颅内、吸入、直肠、阴道内或眼内。

31、“试剂”意指任何小分子、小分子化合物、抗体、核酸分子、肽、多肽或其片段。

32、“改变”意指基因或多肽的表达水平或活性的变化(增加或减少)，如通过标准领域已知的方法(诸如本文所述的那些方法)所检测的。如本文所用，改变包括表达水平的5％的变化、表达水平的10％的变化，优选25％的变化，更优选40％的变化，并且最优选表达水平的50％或更大的变化。

33、“改善”意指降低、减少、减小、抑制、减弱、阻止或稳定疾病或病理状况的发展或进展。

34、“类似物”意指不相同但具有类似功能或结构特征的分子。例如，多肽类似物保留相应天然存在的多肽的生物活性，同时具有相对于天然存在的多肽增强类似物功能的某些生化修饰。此类生化修饰可以增加类似物的蛋白酶抗性、膜通透性或半衰期，而不改变例如配体结合。类似物可以包括非天然氨基酸。

35、“抗体”意指由b淋巴细胞产生并具有特定氨基酸序列的免疫球蛋白(ig)分子。暴露于特定抗原(免疫原)后，在受试者(人或其他动物或哺乳动物)中诱发或引发抗体。能够生成针对特定抗原/免疫原的抗体/免疫球蛋白(即免疫应答)的受试者被认为具有免疫能力。抗体的特征在于以某种可证明的方式与抗原或免疫原特异性反应(例如，结合)，抗体和抗原/免疫原各自就彼此而言定义。

36、“引发抗体应答”是指抗原、免疫原或其他分子诱导抗体产生的能力。抗体具有不同类别(例如，igm、igg、iga、ige、igd)和亚型或亚类(例如，igg1、igg2、igg2a、igg2b、igg3、igg4)。在受试者中引发的抗体/免疫球蛋白应答可以通过与病原体(例如，传染性或致病性)上的表位(抗原决定簇)结合并阻断或抑制该病原体的活性，和/或通过与从受试者的系统(或身体)中清除(例如，经由肝脏)的该病原体形成结合复合物来中和该病原体。

37、如本文所用，“广泛反应性”意指在受试者中引发针对病原体衍生的抗原蛋白(例如，病毒蛋白序列，诸如ha或na)的免疫应答，该免疫应答足以阻断、抑制、阻碍、中和或预防广泛范围的相关病原体(诸如特定亚型内的大多数或所有流感病毒)的感染。在一个实施例中，受试者是哺乳动物受试者。在一个实施例中，受试者是禽类受试者。

38、“抗原”意指可以在动物中刺激产生抗体或t细胞应答的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物中的组合物。抗原与特定体液或细胞免疫的产物(包括由异源免疫原诱导的那些)发生反应。在所公开的组合物和方法的一些实施例中，抗原是流感血凝素(ha)蛋白。在一个实施例中，ha蛋白是全长ha。在一个实施例中，ha蛋白是sha，其被截短并且不包括跨膜结构域和尾部结构域。在许多情况下，在受试者中引发或刺激免疫应答的抗原被称为“免疫原”。在具体实施例中，ha蛋白包含seq id no:1-17(实例1)中提供的氨基酸序列。

39、术语“抗原漂移”是指生物体或微生物(诸如病毒)变异的机制，其涉及编码抗体结合位点(也称为抗原决定簇或表位)的基因内突变的积累。这个过程产生了新的病毒/病毒颗粒毒毒株，其不会被最初针对突变前病毒毒株抗原生成的抗体有效地抑制或阻断，从而使病毒更容易在整个部分免疫群体中传播。作为示例，抗原漂移发生在甲型流感病毒和乙型流感病毒二者中。

40、在活病毒的情况下，术语“减毒”反映了减毒病毒，条件是与野生型病毒在受试者中产生疾病的能力相比，该病毒感染细胞或受试者的能力和/或该病毒产生疾病的能力降低(例如，减小、消除或排除)。通常，减毒病毒在施用于具有免疫能力受试者后至少保留一些引发免疫应答的能力。在某些情况下，减毒病毒可以引发保护性免疫应答，而不会引起任何感染体征或症状。在一些实施例中，相对于野生型病毒在受试者中引起疾病或病状的能力，减毒病毒在受试者中引起疾病或病状的能力降低至少约或等于5％、或至少约或等于10％、或至少约或等于25％、至少约或等于50％、至少约或等于75％、或至少约或等于80％、或至少约或等于85％、或至少约或等于90％、或至少约或等于95％或更高。

41、术语“进化枝”是指已知流感病毒的不同分类(通常称为亚型)，诸如例如甲型流感h3n2病毒。作为示例，h3n2进化枝中的病毒在遗传上相关，但不共享确切的病毒基因组。如技术人员所理解的，存在本领域指定的h3n2病毒亚型的许多进化枝和亚进化枝。作为示例，一个进化枝是3c.2a；该进化枝的亚进化枝包括3c.2a.1、3c.2a.2、3c.2a.3和3c.2a.4。另外，存在本领域指定的h5n1病毒亚型的至少十个不同的进化枝：进化枝0、进化枝1、进化枝2、进化枝3、进化枝4、进化枝5、进化枝6、进化枝7、进化枝8和进化枝9(abdel-ghafar等人,nengl j med 358:261-273,2008)。进化枝2进一步分为亚进化枝(包括进化枝2.1、进化枝2.2、进化枝2.3、进化枝2.4和进化枝2.5)。

42、“密码子优化的”核酸是指已经改变的核酸序列，使得密码子对于在特定系统(诸如特定物种或物种组)中的表达而言是最佳的。例如，可以优化核酸序列以用于在哺乳动物细胞中表达。密码子优化不会改变所编码蛋白质的氨基酸序列。

43、在本公开中，“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(containing)”和“具有(having)”等可以具有美国专利法中赋予它们的含义，并且可以意指“包括(includes)”、“包括(including)”等；“基本上由……组成(consisting essentially of)”或“基本上由……组成(consists essentially)”同样具有美国专利法中规定的含义并且该术语是开放式的，允许存在多于所列举的那些，只要所列举的那些的基本或新颖特征不因存在多于所列举的那些而改变，但是排除现有技术实施例。

44、“检测”是指识别待检测的分析物、化合物、试剂或物质的存在、不存在或量。“可检测标记”是指当与目的分子连接时使后者可例如经由光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的组合物。有用的可检测标记的非限制性示例包括放射性同位素、磁珠、金属珠、胶体颗粒、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，如elisa中常用的)、生物素、地高辛或半抗原。

45、“疾病”意指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何病症、疾患或病状。疾病的示例包括由流感病毒感染引起的那些以及由身体感染h1或h3流感病毒引起的症状和副作用。流感病毒在感染个体中引起流行性感冒及其症状。

46、“有效量”意指相对于未经治疗的患者改善、降低、改进、消除、减小或排除疾病、病症或病状的症状和/或作用所需的活性治疗剂、组合物、化合物、生物制品(例如，疫苗或治疗性肽、多肽或多核苷酸)的量。在一个实施例中，有效量是引发免疫应答所需的抗原的量。当用于实施疾病、病症或病状的治疗性治疗方法时，免疫原或包含免疫原的组合物的有效量根据施用方式、受试者的年龄、体重和一般健康状况而变化。最终，主治医师或兽医将决定适当的量和剂量方案。此类量被称为“有效”量。

47、“治疗有效量”是指足以在用特定试剂治疗的受试者中实现期望效果的该试剂的量。例如，这可以是可用于在受试者中引发免疫应答和/或用于预防流感病毒感染的流感病毒免疫原或疫苗的量。理想地，在本公开的上下文中，流感疫苗或免疫原性组合物的治疗有效量是足以在受试者中增加对流感病毒引起的感染的抗性、预防、改善、降低和/或治疗由流感病毒引起的感染而不引起对受试者的实质细胞毒性作用的量。可用于在受试者中增加对感染的抗性、预防、改善、降低和/或治疗感染的免疫原性组合物(或疫苗)的有效量取决于例如所治疗的受试者、治疗组合物的施用方式以及其他因素，如上文所述。

48、“片段”意指多肽或核酸分子的一部分。该部分优选含有参考核酸分子或多肽全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可以含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。多肽的部分或片段可以是肽。在抗体或免疫球蛋白片段的情况下，片段通常与靶抗原结合。

49、“融合蛋白”意指通过表达由编码两种不同(异源)蛋白质或肽的至少一部分的核酸序列工程化的核酸(多核苷酸)序列而生成的蛋白质。为了创建融合蛋白，核酸序列必须位于相同的阅读框中并且不含内部终止密码子。例如，融合蛋白包括与异源蛋白融合的流感ha蛋白或na蛋白。

50、“基因疫苗”意指包含编码抗原的多核苷酸的免疫原性组合物。

51、“病毒多肽”，诸如h1或h3流感病毒，意指与抗原的氨基酸序列至少85％相同、或至少95％或更高相同的氨基酸序列，该抗原例如下文seq id no:1-17中列出的ha蛋白或其能够在免疫受试者中诱导针对病毒、病毒感染和/或其症状的免疫应答的片段。在实施例中，流感病毒多肽包含本文所述和下文seq id no:1-17中提供的氨基酸序列或其片段或由该氨基酸序列或其片段组成。

52、“病毒多核苷酸”意指编码流感病毒多肽(诸如h1或h3流感病毒(抗原或抗原蛋白))的核酸分子，如本文所述。在一个实施例中，多核苷酸是dna或rna多核苷酸。在一个实施例中，多核苷酸是mrna。

53、术语“血凝素(ha)”是指流感病毒表达的表面糖蛋白。ha介导病毒颗粒与宿主细胞的结合以及随后病毒进入宿主细胞。许多流感ha蛋白的核苷酸和氨基酸序列是本领域已知的并且是公众可获得的，诸如保存在公众可访问的genbank(ncbi)和uniprotkb数据库中的那些。作为非限制性示例，h5n1 ha序列的genbank登录号列表可以在美国专利申请公开us2015/0030628中找到。甲型流感病毒(毒株a/puerto rico/8/1934h1n1)的ha蛋白的氨基酸序列的非限制性示例在uniprotkb登录号p03452(hema_134a1)下提供。甲型流感h3n2病毒(a/hong kong/1-4/1968(h3n2))的ha蛋白的氨基酸序列的非限制性示例在登录号cy033017下提供。ha(与神经氨酸酶(na)一起)是两种主要流感病毒抗原蛋白中的一种，其具有被抗体/免疫球蛋白识别和结合的抗原决定簇(表位)。在实施例中，ha是ha1(h1)或ha2(h2)。

54、在实施例中，ha蛋白或其片段可以与代表性甲型流感病毒ha蛋白或其片段的氨基酸序列具有至少约或等于85％，或者至少约或等于90％、95％、98％、99％或更大的氨基酸序列同一性。

55、在一个实施例中，ha免疫原性抗原是h1或h3 ha蛋白，其可以是全长或其可溶形式，包含下文实例1中列出的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。

56、“杂交”意指互补核碱基之间的氢键键合，该氢键键合可以是沃森-克里克、霍氏或反向霍氏氢键键合。例如，在dna中，腺嘌呤和胸腺嘧啶以及胞嘧啶和鸟嘌呤分别是通过氢键的形成进行配对的互补核碱基。

57、术语“免疫应答”意指由免疫应答性细胞介导的任何应答。在免疫应答的一个示例中，响应于暴露于抗原(例如，外来实体)，白细胞被募集以实施多种不同的特定功能。免疫应答是多因素过程，根据所涉及的细胞类型而有所不同。免疫应答包括细胞介导的应答(例如，t细胞应答)、体液应答(b细胞/抗体应答)、先天应答及其组合。

58、“免疫原”意指在适当的条件下可以在动物中引发或刺激免疫应答(诸如产生抗体和/或t细胞应答)的化合物、组合物或物质，包括注射或以其他方式递送至动物的组合物。如本文所用，“免疫原性组合物”是包含免疫原(诸如ha多肽或肽(例如，ha多肽的全长或可溶形式)或编码此类免疫原的多核苷酸)或者包含ha多肽或肽(例如，ha多肽的全长或可溶形式)或编码此类免疫原的多核苷酸)的疫苗的组合物。如本领域技术人员将理解的，如果在受试者感染疾病或经历全面疾病之前向有需要的受试者施用，则免疫原性组合物可以是预防性的并引起受试者引发免疫应答，例如，中和抗体和/或细胞免疫应答，以防范疾病，或预防更严重的疾病或病症和/或其症状。如果在受试者感染疾病之后向有需要的受试者施用，则免疫原性组合物可以是治疗性的并引起受试者引发免疫应答，例如，中和抗体和/或细胞免疫应答，以例如通过降低、减小、消除、改善、缓和、缓解或根除疾病和/或其症状来治疗疾病。在一个实施例中，免疫应答是b细胞应答，其引起产生针对包含抗原或抗原序列的免疫原或免疫原性组合物的抗体，例如中和抗体。以与前述类似的方式，在一些实施例中，免疫原、免疫原性组合物或疫苗可以是预防性的。在一些实施例中，免疫原、免疫原性组合物或疫苗可以是治疗性的。在一个实施例中，疾病是流感(流行性感冒)。在一个实施例中，疾病是传染性支气管炎。在本文的一些情况下，术语免疫原和疫苗可互换使用。

59、“免疫原性组合物”意指包含抗原、抗原序列或免疫原的组合物，其中该组合物在免疫受试者中引发免疫应答。

60、术语“免疫(immunize/immunization)”是指诸如通过疫苗接种使受试者免受或在免疫学上响应由病原体引起的疾病或病状，例如由病毒(例如，流感病毒h1或h3)引起的传染病。在本文的一些情况下，术语“免疫”和“疫苗接种”可以互换使用(例如，免疫/疫苗接种)。

61、术语“流感病毒”是指属于病毒的正粘病毒(orthomyxoviridae)科的分节段的负链rna病毒。存在三种类型的流感病毒：甲型、乙型和丙型。甲型流感病毒感染多种鸟类和哺乳动物，包括人、马、海洋哺乳动物、猪、雪貂和鸡。在动物中，大多数甲型流感病毒会引起呼吸道和肠道的轻度局部感染。然而，高致病性甲型流感毒株，诸如但不限于h5n1、h5n2、h5n6、h5n8、h7n9、h9n2、h1n1、h1n2、h2n1、h2n2、h2n3、h7n3、h7n7、h3n2、h3n1和相关病毒，引起家禽的全身性流感，其中死亡率可能达到100％。h5n1也称为“禽流感”。

62、“抑制性核酸”意指双链rna、sirna、shrna或反义rna、或其部分、或其模拟物，当施用于哺乳动物细胞时该抑制性核酸会导致靶基因表达减少(例如，5％、10％、25％、50％、75％或甚至90-100％)。通常，核酸抑制剂包含靶核酸分子或其直系同源物的至少一部分，或包含靶核酸分子的互补链的至少一部分。例如，抑制性核酸分子包含本文描述的核酸中的任一种或全部的至少一部分。

63、术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指不同程度地不含在其天然状态中发现的正常伴随的组分的材料。“分离”表示与原始来源或周围环境的分离程度。“纯化”表示比分离更高的分离程度。“纯化的”或“生物纯的”蛋白质充分不含其它材料，使得任何杂质不会实质上影响蛋白质的生物学特性或引起其他不良后果。也就是说，如果核酸、蛋白质或肽在通过重组dna技术产生时实质上不含细胞材料、碎片、不相关病毒材料或培养基，或化学合成时实质上不含化学前体或其它化学品，则该核酸、蛋白质或肽是纯化的。纯度和均一性通常使用标准纯化方法和分析化学技术，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法确定。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一条条带。对于可以进行修饰(例如磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可以产生不同的分离的蛋白质，可以单独纯化该蛋白质。术语“分离的”还包括重组核酸、蛋白质或病毒，以及化学合成的核酸或肽。

64、“分离的多核苷酸”意指不含基因的核酸(例如，dna分子)，该基因在衍生所述方面和实施例的核酸分子的生物的天然存在的基因组中的基因的侧翼。因此，该术语包括例如掺入载体中；掺入自主复制的质粒或病毒中；或掺入原核生物或真核生物的基因组dna中的重组dna；或者作为独立于其他序列的单独分子(例如，通过pcr或限制性内切酶消化产生的cdna或基因组或cdna片段)存在的重组dna。此外，该术语包括从dna分子(例如，mrna)转录的rna分子，以及作为编码额外多肽序列的杂合基因的一部分的重组dna。

65、“分离的多肽”意指已与其天然伴随的组分分离的多肽，诸如本文所述的多肽。通常，当多肽按重量计至少30％、按重量计至少40％、按重量计至少50％、按重量计至少60％不含与该多肽天然相关的蛋白质和天然存在的有机分子时，该多肽是分离的。优选地，分离的多肽制剂按重量计至少75％、至少90％或至少99％不含与其天然相关的蛋白质和天然存在的有机分子。分离的多肽可以例如通过从天然来源提取；通过表达编码此类多肽的重组核酸；或通过化学合成蛋白质来获得。纯度可以通过任何标准的适当方法(例如，柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过hplc分析)来测量。分离的多肽可以指通过本文所述的方法生成的广泛活性的病毒免疫原多肽。

66、“接头”意指充当融合蛋白的两个多肽或肽之间的间隔物的一个或多个氨基酸。

67、“标记物”意指在与疾病、病症、病状或疾患相关的表达水平或活性上具有改变(例如，增加或减少)的任何蛋白质或多核苷酸。

68、“基质(m1)蛋白”是指在病毒包膜内发现的流感病毒结构蛋白。m1被认为在细胞感染后在病毒的组装和出芽中发挥作用。

69、如本文所用，“获得试剂”中的“获得”包括合成、分离、纯化、购买或以其他方式获取试剂。

70、术语“可操作地连接”是指本文所用的核酸序列。作为示例，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响(允许)编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。一般来说，可操作地连接的dna序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时位于相同的阅读框中。

71、编码具有广泛反应性的ha蛋白(使得针对该ha蛋白以及其他可能抗原漂移但相关的病毒生成免疫应答(例如，抗体应答))的核苷酸序列可以使用本领域实践的程序和技术经由密码子优化和rna优化(诸如以增加rna稳定性)来优化以在哺乳动物细胞中表达。

72、用于在受试者中引发免疫应答的(非天然存在的)广泛反应性免疫原性抗原(诸如流感(例如，h1或h3流感病毒)血凝素(ha)蛋白)具有共同的强免疫原性表位(也称为抗原决定簇)集。本文所述的流感病毒ha蛋白适合用作引发免疫应答的免疫原或疫苗，其在引入宿主受试者(特别是感染流感h1或h3病毒的人类受试者)时引发针对在病毒表面上表达ha蛋白的其他相关但不相同的病毒类型的广泛反应性免疫应答，例如，中和抗体应答。免疫原性抗原(或疫苗)有利于提供抗病毒免疫原(或疫苗)，其引发针对具有抗原变异性和相似性的其他流感病毒ha抗原(诸如h1或h3)的广泛活性免疫应答，并治疗或防范由超过一种的h1或h3流感病毒亚型引起的感染和疾病。

73、“开放阅读框(orf)”意指编码氨基酸而没有任何终止密码子的一系列核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可翻译成肽或多肽。

74、术语“药学上可接受的媒介物”是指用于特别在哺乳动物(例如，人类)受试者中以及其他动物或禽类受试者中使用的生理上和药学上可接受的常规载体(媒介物)和赋形剂。此类药学上可接受的媒介物是相关领域技术人员已知的并且可以容易地在remington'spharmaceutical sciences,e.w.martin,mack publishing co.,easton,pa.,第15版(1975)及其更新版本中找到，该参考文献描述了适合于药物递送一种或多种治疗组合物(诸如一种或多种流感ha免疫原(疫苗))和另外的药剂的组合物和制剂。通常，药学上可接受的载体的性质取决于所采用的特定施用模式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体/液体，其包括作为媒介物或稀释剂的药学和生理学可接受的流体，诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可以包括例如通常稳定和/或增加组合物或药物的半衰期的药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体之外，要施用的药物组合物可以含有少量无毒的辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等，例如，乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

75、“质粒”(或“载体”)意指能够在宿主细胞中自主复制的环状核酸分子。

76、“多肽”(或蛋白质)意指其中单体包含通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用l-光学异构体或d-光学异构体。如本文所用，术语“多肽”或“蛋白质”旨在涵盖任何氨基酸序列并且包括修饰的序列诸如糖蛋白。术语“多肽”具体旨在涵盖天然存在的蛋白质以及重组或合成产生的蛋白质。术语“残基”或“氨基酸残基”还指掺入蛋白质、多肽或肽中的氨基酸。

77、保守氨基酸取代是在进行时对原始蛋白质性质的干扰最小的那些取代，即，蛋白质的结构并且尤其是功能是保守的并且不会因此类取代而显著改变。保守氨基酸取代的示例是本领域已知的，例如，如美国公开号2015/0030628中列出的。保守取代通常维持(a)该取代区域中的多肽骨架的结构，例如作为片状或螺旋构象；(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，和/或(c)侧链的主体。

78、通常预期会产生蛋白质性质最大变化的取代是非保守的，例如以下改变，其中(a)亲水性残基(例如，丝氨酰基或苏氨酰基)用(或被)疏水性残基(例如，亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基)取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸用(或被)任何其他残基取代；(c)具有正电性侧链的残基(例如，赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)用(或被)负电性残基(例如，谷氨酰基或天冬氨酰基)取代；或(d)具有大侧链的残基(例如，苯丙氨酸)用(或被)不具有侧链的残基(例如，甘氨酸)取代。

79、“引物集”是指可以用于例如pcr的寡核苷酸集。引物集将由至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、80、100、200、250、300、400、500、600或更多个引物组成。

80、“启动子”意指引导核酸转录的核酸控制序列的阵列。启动子包括转录起始位点附近必需的核酸序列。启动子还任选地包括远端增强子或阻抑序列元件。“组成型启动子”是持续活性且不受外部信号或分子调节的启动子。相反，“诱导型启动子”的活性受到外部信号或分子(例如，转录因子)的调节。作为示例，启动子可以是cmv启动子。

81、如本领域技术人员所理解的，术语“纯化的”不需要绝对纯度；相反，它旨在作为相对术语。因此，例如，纯化的肽、蛋白质、病毒、多核苷酸或其他活性化合物是完全或部分与天然相关蛋白质和其他污染物分离的。在某些实施例中，术语“实质上纯化的”是指已从细胞、细胞培养基或其他粗制剂中分离并经受常规方法(诸如但不限于，分级、色谱法或电泳)以除去初始制剂的各种组分(诸如蛋白质、细胞碎片和其他组分)的肽、蛋白质、病毒、多核苷酸或其他活性化合物。

82、“重组”核酸、蛋白质或病毒是具有非天然存在的序列或具有通过人工组合两个以其他方式分离的序列区段而产生的序列的核酸、蛋白质或病毒。此类人工组合通常通过化学合成来实现，或者通过对分离的核酸区段进行人工操纵，例如通过基因工程技术来实现。“非天然存在的”核酸、蛋白质或病毒是可以经由重组技术、人工操纵、遗传或分子生物工程化或者分子合成程序和技术(诸如本领域通常实践的那些)来制备的核酸、蛋白质或病毒。

83、“降低”意指至少5％、10％、25％、30％、40％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％的负面改变(例如，减少或降低)。

84、“参考”意指标准或对照条件，例如，野生型或未突变的蛋白质或多核苷酸。在一些情况下，参考可以是健康的、未感染的受试者或细胞，例如，未感染流感病毒的受试者或细胞。

85、“参考序列”是用作序列比较的基础的定义序列。参考序列可以是特定序列的子集或全部；例如，全长cdna或基因序列的区段，或完整的cdna或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度通常为至少约16个氨基酸，优选至少约20个氨基酸，更优选至少约25个氨基酸，并且甚至更优选约35个氨基酸，约50个氨基酸，或约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度通常为至少约50个核苷酸，优选至少约60个核苷酸，更优选至少约75个核苷酸，并且甚至更优选约100个核苷酸或约300个核苷酸或其附近或其间的任何整数。

86、“特异性结合”的化合物或抗体是指识别并结合多肽，诸如病毒多肽、肽或疫苗产物，但实质上不识别和结合天然地包含多肽(诸如病毒多肽或肽)的样品(例如，生物样品)中的其他分子。

87、可用于本文所述的方法的核酸分子包括编码所述多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源性核酸序列100％相同，但通常将表现出实质同一性。与内源性序列具有“实质同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”意指在各种严格条件下在互补多核苷酸序列(例如，基因)或其部分之间形成双链分子。(参见例如，wahl,g.m.和s.l.berger,(1987),methods enzymol.,152:399；kimmel,a.r.,(1987),methods enzymol.152:507)。

88、作为示例，严格盐浓度通常小于约750mm nacl和75mm柠檬酸三钠，优选小于约500mm nacl和50mm柠檬酸三钠，并且更优选小于约250mm nacl和25mm柠檬酸三钠。低严格杂交可以在不存在有机溶剂例如甲酰胺的情况下获得，而高严格杂交可以在存在至少约35％甲酰胺并且更优选至少约50％甲酰胺的情况下获得。严格的温度条件通常包括至少约30℃、更优选至少约37℃、并且最优选至少约42℃的温度。改变另外的参数(诸如杂交时间、去污剂例如十二烷基硫酸钠(sds)的浓度以及载体dna的包含或排除)是本领域技术人员众所周知的。通过根据需要组合这些不同的条件来实现不同级别的严格度。在一个优选的实施例中，杂交将在30℃下在750mm nacl、75mm柠檬酸三钠和1％ sds中进行。在一个更优选的实施例中，杂交将在37℃下在500mm nacl、50mm柠檬酸三钠、1％ sds、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精dna(ssdna)中进行。在一个最优选的实施例中，杂交将在42℃下在250mmnacl、25mm柠檬酸三钠、1％ sds、50％甲酰胺和200μg/ml ssdna中进行。这些条件的可用修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。

89、对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤的严格度也会有所不同。洗涤严格度条件可以通过盐浓度和温度来定义。如上所述，可以通过降低盐浓度或提高温度来提高洗涤严格度。例如，洗涤步骤的严格盐浓度优选小于约30mm nacl和3mm柠檬酸三钠，并且最优选小于约15mm nacl和1.5mm柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常包括至少约25℃、更优选至少约42℃并且甚至更优选至少约68℃的温度。在一个优选的实施例中，洗涤步骤将在25℃下在30mm nacl、3mm柠檬酸三钠和0.1％ sds中进行。在一个更优选的实施例中，洗涤步骤将在42℃下在15mm nacl、1.5mm柠檬酸三钠和0.1％ sds中进行。在一个更优选的实施例中，洗涤步骤将在68℃下在15mm nacl、1.5mm柠檬酸三钠和0.1％ sds中进行。这些条件的其他修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员众所周知的并且描述于例如benton和davis(science 196:180,1977)；grunstein和hogness(proc.natl.acad.sci.,usa 72:3961,1975)；ausubel等人(current protocols inmolecular biology,wiley interscience,new york,2001)；berger和kimmel(guide tomolecular cloning techniques,1987,academic press,new york)；以及sambrook等人,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,newyork中。

90、“实质上相同”意指表现出与参考氨基酸序列(例如，本文描述的氨基酸序列中的任一种)或核酸序列(例如，本文描述的核酸序列中的任一种)至少50％同一性的多肽或核酸分子。优选地，此类序列在氨基酸水平或核酸上与用于比较的序列至少60％、或者至少80％或85％、或者至少或等于90％、93％、95％或甚至99％相同。

91、“序列同一性”是指氨基酸或核酸序列之间的相似性，其根据序列之间的相似性来表达。序列同一性经常根据同一性(或类似性或同源性)百分比来测量；百分比越高，序列越相似。当使用标准方法比对时，给定基因或蛋白质的同源物或变体将具有相对高程度的序列同一性。序列同一性通常使用序列分析软件(例如，genetics computer group的序列分析软件包,university of wisconsin biotechnology center,1710university avenue,madison,wis.53705，blast，bestfit，gap或pileup/prettybox程序)来测量。此类软件通过分配各种取代、缺失和/或其他修饰的同源性程度来匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可使用blast程序，其概率得分在e-3和e-100之间，指示紧密相关的序列。另外，其他程序和比对算法描述于例如smith和waterman,1981,adv.appl.math.2:482；needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.48:443；pearson和lipman,1988,proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:2444；higgins和sharp,1988,gene 73:237-244；higgins和sharp,1989,cabios 5:151-153；corpet等人,1988,nucleic acids research16:10881-10890；pearson和lipman,1988,proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:2444；以及altschul等人,1994,nature genet.6:119-129。ncbi基本局部比对搜索工具(blasttm)(altschul等人1990,j.mol.biol.215:403-410)可以从多个来源容易获得(包括国家生物技术信息中心(ncbi,bethesda,md.)和互联网)以与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx关联使用。

92、“受试者”意指脊椎动物，例如，哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物或者非人动物或哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊或猫科哺乳动物，或者绵羊、山羊、美洲驼、骆驼、雪貂或啮齿动物(大鼠、小鼠)、沙鼠或仓鼠。“受试者”还可以指非人类动物或禽类脊椎动物。非人类受试者或非人类动物受试者也可称为“兽医受试者”。在非限制性示例中，受试者被病原体(诸如流感病毒，例如h1或h3病毒)感染，或处于被此类病毒感染的风险中，或易受此类感染。在本文所述的一些方面，受试者是人类受试者，诸如患者。在本文所述的一些方面，受试者是非人类受试者，诸如非人类动物受试者或兽医受试者。

93、本文提供的范围应理解为该范围内的所有值的速记。例如，1至50的范围应理解为包括来自由以下项组成的组的任何数字、数字的组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更大，连续地诸如到100或更大，包括第一个和最后一个值以及其间的值。

94、如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”等是指降低、减小、减少、减轻、消除、缓解、改善或根除疾病、病症、疾患或病状和/或与之相关的症状。虽然不旨在限制，但“治疗”通常涉及在疾病、病症、疾患或病状和/或与之相关的症状已经开始发展之后发生以降低疾病等的严重程度以及相关的体征和症状的治疗干预。应当理解，尽管不排除，治疗疾患或病症并不需要完全根除疾病、病症、疾患、病状或与之相关的症状。

95、如本文所用，术语“防止(prevent/preventing/prevention)”、“预防性治疗(prophylactic treatment)”等是抑制或阻断受试者的疾病状态或者疾病的完全或全面发展，或者降低未患有疾病、疾患或病症但处于发展疾病、疾患或病症的风险中或者易于发展疾病、疾患或病症的受试者发展疾病、疾患或病症的可能性。

96、如本文所提及的，“转化的”细胞是已通过分子生物学技术将核酸分子或多核苷酸序列引入其中的细胞。如本文所用，术语“转化”涵盖可以将核酸分子或多核苷酸引入此类细胞中的所有技术，包括用病毒载体转染，用质粒载体转化以及通过电穿孔、脂转染、粒子枪加速或本领域已知和实践的其他方法引入裸核酸(dna或rna，例如，mrna)。

97、“疫苗”意指能够刺激(引发)免疫应答的免疫原性材料(例如，蛋白质或核酸)的制剂，诸如蛋白质或肽抗原，其施用于受试者以治疗疾病、病症或病状，或者预防或防范疾病、病症或病状，诸如传染病，例如，病毒感染。免疫原性材料可以包括例如减毒或灭活的微生物(例如，减毒病毒)，或源自此类微生物的抗原蛋白、肽、dna或rna。疫苗可能会在受试者中引发预防性(防止性)免疫应答；它们还可以在受试者中引发治疗应答免疫应答。如上所述，疫苗施用方法根据疫苗而变化，并且可以包括途径或手段，诸如接种(静脉内或皮下注射)、食入、吸入或医学领域已知和实践的其他施用形式。可以通过多种途径中的任一种来递送接种，包括肠胃外，诸如静脉内、皮下或肌内。疫苗也可以与佐剂一起施用以增强免疫应答。疫苗可以施用于人类受试者、非人类受试者或兽医受试者。术语疫苗和免疫原在本文中可互换使用。在一个实施例中，单价免疫原/疫苗含有一种本文所述的非天然存在的、广泛反应性的流感ha或na免疫原性多肽抗原，或者某些类型或亚型中的一种ha或na流感病毒抗原。在一个实施例中，二价免疫原/疫苗含有两种相同或不同的本文所述的非天然存在的、广泛反应性的流感ha或na免疫原性多肽抗原，和/或某些类型或亚型中的两种相同或不同的ha或na流感病毒抗原。在一个实施例中，多价免疫原/疫苗含有至少两种(或多于两种)本文所述的非天然存在的、广泛反应性的流感ha或na免疫原性多肽抗原，和/或某些类型或亚型中的至少两种ha或na流感病毒抗原。在一个实施例中，多价免疫原/疫苗含有2、3、4、5、6、7、8、9或10种本文所述和举例说明的流感多肽抗原，包括不同的本文所述和举例说明的流感免疫原性多肽抗原的混合物和/或某些类型或亚型中的ha或na流感病毒抗原。在一个实施例中，流感免疫原/疫苗制剂是二价的。在一个实施例中，流感免疫原疫苗制剂是多价的，例如八价的。

98、如本文所用，“载体”是指可以将外源核酸插入其中而不破坏载体在宿主细胞中复制和/或整合到宿主细胞中的能力的核酸(多核苷酸)分子。载体可以包括允许其在宿主细胞诸如复制起点中进行复制的核酸序列。插入载体可以将其自身插入宿主核酸中。载体还可以包括一种或多种可选择标记物基因和其他遗传元件。表达载体是含必要的调控序列以允许插入的一个或多个基因在宿主细胞中转录和翻译的载体。在本公开的一些实施例中，载体编码流感ha、na或m1蛋白。在一些实施例中，载体是ptr600表达载体(美国专利申请公开号2002/0106798；ross等人,2000,nat immunol.1(2):102-103；和green等人,2001,vaccine 20:242-248)。

99、“病毒样颗粒(vlp)”意指由多种病毒结构蛋白中的一种组成但缺少病毒基因组的病毒颗粒。由于vlp缺少病毒基因组，因此它们不具有传染性，并且产生更安全且可能更经济的疫苗和疫苗产物。此外，vlp通常可以通过异源表达产生，并且可能容易纯化。大多数vlp至少包含病毒核心蛋白，该蛋白驱动颗粒从宿主细胞出芽和释放。此类核心蛋白的一个示例是流感m1。在本文的一些实施例中，流感vlp包含ha、na和m1蛋白。在某些情况下，流感vlp可以通过用编码ha、na和m1蛋白的质粒转染宿主细胞来产生。将转染的细胞孵育适当的时间以允许蛋白质表达(诸如持续约72小时)后，可以从细胞培养物上清液中分离vlp。作为示例，从细胞上清液中纯化或分离流感vlp的方案涉及vlp的低速离心(以去除细胞碎片)、vlp的真空过滤和通过20％甘油对vlp进行超速离心。病毒样颗粒还可以包括亚病毒颗粒(svp)，其尺寸通常比病毒小并且构成没有病毒衣壳或基因组的颗粒。

100、如本文所用，术语“或”应理解为包含性的，除非特别说明或从上下文显而易见。如本文所用，术语“一”、“一个”和“该”应理解为单数或复数，除非特别说明或从上下文显而易见。同样，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。因此，“包含a或b”意指包括a、或b、或a和b。还应当理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值是近似的，并提供用于描述。

101、除非具体说明或从上下文显而易见，否则如本文所用，术语“约”被理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可以理解为在规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内开始。除非上下文另有说明，否则本文提供的所有数值都用术语约修饰。

102、在本文变量的任何定义中化学基团列表的记载包括将该变量定义为任何单个基团或所列基团的组合。本文针对变量或方面的实施例的记载包括作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分的组合的该实施例。

103、本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供的任何其他组合物和方法中的一种或多种组合。