衣壳变体及其使用方法与流程

背景技术：

1、依赖性细小病毒，例如腺相关依赖性细小病毒，例如腺相关病毒(aav)，作为用于将各种有效载荷递送至细胞(包括在人类受试者中)的载体而受到关注。

技术实现思路

1、本公开部分提供了改进的变体依赖性细小病毒衣壳蛋白(例如aav2)、如vp1，产生依赖性细小病毒的方法，用于其的组合物，以及由其产生的病毒颗粒。在一些实施例中，与衣壳蛋白中没有突变的病毒颗粒相比，所产生的病毒颗粒具有增加的眼部转导。

2、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含编码如本文所提供的变体衣壳蛋白的序列的核酸。在一些实施例中，依赖性细小病毒是腺相关依赖性细小病毒(aav)。在一些实施例中，aav是aav2。

3、在一些实施例中，本公开部分地涉及本文所述的衣壳多肽。

4、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的核酸的依赖性细小病毒颗粒。

5、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的核酸的载体，例如质粒。

6、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的核酸(例如，包含编码衣壳多肽，如vp1的序列的核酸)的依赖性细小病毒颗粒，其中编码序列包含如本文所提供的改变或突变。

7、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含变体衣壳多肽的依赖性细小病毒颗粒，该变体衣壳多肽包含与以下项的vp1、vp2或vp3序列具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％同一性的多肽：seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18或seq id no:19。

8、在一些实施例中，本公开部分地涉及核酸分子，其包含seq id no:20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37，其片段，或其与其具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的变体。

9、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的核酸(例如包含编码衣壳多肽(例如vp1多肽)的序列的核酸)的载体，其中编码序列包含如本文所提供的改变或突变。

10、在一些实施例中，本公开部分地涉及细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含本文所述的核酸或载体，该核酸或载体例如包含编码衣壳多肽(如vp1)的序列，其中衣壳多肽编码序列在编码序列中包含如本文所提供的改变或突变。在一些实施例中，细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含本文所述的依赖性细小病毒颗粒，例如，其中该颗粒包含核酸，该核酸包含编码衣壳多肽(如vp1多肽)的序列，其中编码序列包含如本文所提供的改变或突变。

11、在一些实施例中，本公开部分地涉及包含本文所述的多肽的细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其中多肽编码序列包含如本文所提供的改变或突变。在一些实施例中，细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含本文所述的依赖性细小病毒颗粒，例如，其中该颗粒包含核酸，该核酸包含编码vp1多肽的序列，其中vp1编码序列包含如本文所提供的相应的改变或突变。

12、在一些实施例中，本公开部分地涉及一种将有效载荷递送至细胞的方法，该方法包括使细胞与包含本文所述的核酸的依赖性细小病毒颗粒接触。在一些实施例中，本公开部分地涉及一种将有效载荷递送至细胞的方法，该方法包括使细胞与包含本文所述的衣壳多肽的依赖性细小病毒颗粒接触。

13、在一些实施例中，本公开部分地涉及一种制备依赖性细小病毒颗粒的方法，该方法包括：提供细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含本文所述的核酸(例如，包含编码如本文所提供的aav2衣壳变体的序列的核酸)；以及在适合于产生依赖性细小病毒颗粒的条件下培养细胞、无细胞体系或其他翻译体系，从而制备依赖性细小病毒颗粒。在一些实施例中，本公开部分地涉及一种制备本文所述的依赖性细小病毒颗粒的方法。

14、在一些实施例中，本公开部分地涉及一种制备依赖性细小病毒颗粒的方法，该方法包括：提供细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含本文所述的多肽；以及在适合于产生依赖性细小病毒颗粒的条件下培养细胞、无细胞体系或其他翻译体系，从而制备依赖性细小病毒颗粒。在一些实施例中，本公开部分地涉及一种制备本文所述的依赖性细小病毒颗粒的方法。

15、在一些实施例中，本公开部分地涉及在细胞、无细胞体系或其他翻译体系中制备的依赖性细小病毒颗粒，其中该细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含编码依赖性细小病毒的核酸，该依赖性细小病毒包含如本文所提供的衣壳变体。

16、在一些实施例中，本公开部分地涉及一种治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括以有效治疗疾病或病症的量向受试者施用本文所述的依赖性细小病毒颗粒。

17、进一步参考以下编号的实施例描述本发明。

技术特征：

1.一种变体衣壳多肽，其包含与以下项的vp1、vp2或vp3序列具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或100％同一性的多肽：seq id no:13、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seqid no:10、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seqid no:18或seq id no:19。

2.根据权利要求1所述的变体衣壳多肽，其中所述多肽包含seq id no:1的变体，其中所述变体衣壳多肽包含对应于以下项的突变：根据seq id no:1的位置447、449、450、452、453、454、455、456、457、458、459、461、586、587、598、597、600或616处的突变，位置181与182、450与451、584与585、586与587、或587与588之间的插入，任选地其中所述突变包括插入、缺失或取代。

3.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含插入，例如1个或多个氨基酸，例如1至10个氨基酸，例如10个氨基酸，例如9个氨基酸，例如8个氨基酸，例如6个氨基酸，例如5个氨基酸的插入，所述插入对应于在与seq id no:1相比的位置181与182、450与451、584与585、586与587、或587与588之间的插入。

4.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含对应于以下项的突变：

5.一种与seq id no:1的vp1、vp2或vp3序列具有至少90％同一性的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含在与seq id no:1相比的位置584与585之间、位置585与586之间、位置586与587之间、或位置587与588之间的插入，其中所述插入包含多肽lgettrp(seq id no:39)，或lgettrp(seq id no:39)的至少4个氨基酸、至少5个氨基酸或至少6个氨基酸的片段，以及至少一种选自以下的另外的突变：

6.一种与seq id no:1的vp1、vp2或vp3序列具有至少90％同一性的变体衣壳多肽，其包含在选自根据seq id no:1的582至560的任意两个氨基酸之间的插入，其中所述插入包含lalgettrpa(seq id no:40)或其至少5个、至少6个、至少7个、至少8个或至少9个氨基酸的片段，或由其组成(例如，包含lgettrp(seq id no:39)或由其组成，或者包含lagettr(seq id no:41)或由其组成，其中所述变体衣壳多肽进一步包含根据seq id no:1的编号的以下突变中的至少一者：

7.一种与seq id no:1的vp1、vp2或vp3序列具有至少90％序列同一性的变体衣壳多肽，其包含glpynaf(seq id no:42)或glpynaf(seq id no:42)的至少4个、至少5个或至少6个氨基酸的片段的插入，任选地其中所述插入在根据seq id no:1的位置170至190的任意两个连续氨基酸之间，例如在根据seq id no:1的位置181与182之间。

8.一种与seq id no:1的vp1、vp2或vp3序列具有至少90％同一性的变体衣壳多肽，其包含iehwgh(seq id no:43)或iehwgh(seq id no:43)的至少4个或至少5个氨基酸的片段的插入，任选地其中所述插入在根据seq id no:1的位置440至460的任意两个连续氨基酸之间，例如在根据seq id no:1的位置450与451之间。

9.一种与seq id no:1的vp1、vp2或vp3序列具有至少90％同一性的变体衣壳多肽，其包含根据seq id no:1的编号的以下突变中的至少一者：

10.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含对应于以下项的突变：

11.根据权利要求10所述的变体衣壳多肽，其中所述另外的突变是在所述插入多肽的n末端、c末端处或序列内的一个或多个氨基酸的另外的插入。

12.根据权利要求10所述的变体衣壳多肽，其中所述另外的插入如表1中所示。

13.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述衣壳多肽包含对应于以下项的突变：

14.一种变体衣壳多肽，其包含与seq id no:1的vp1、vp2或vp3序列具有至少90％同一性的序列，并且包含以下中的任一者：g586p、g586n、n587a、t597w、q598c、q598v、q598l、v600a、p616q及其组合。

15.根据权利要求14所述的变体衣壳多肽，其进一步包含在位置560与位置600之间(例如，位置584与位置589之间)的seq id no:1的任意两个连续氨基酸之间的3个与13个氨基酸之间的插入(例如，7个氨基酸的插入或10个氨基酸的插入)，任选地其中所述插入不包含序列lgettrp(seq id no:39)。

16.一种变体衣壳多肽，其包含(a)以下中任一者的多肽：seq id no:13、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seqid no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:15、seqid no:16、seq id no:17、seq id no:18或seq id no:19；(b)以下中任一者的vp2或vp3序列：seq id no:13、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18或seq id no:19；(c)含有与其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列的多肽，其中相对于seq id no:1，所述序列包含与seq id no:2至seq id no:19中任一者相关的突变差异中的至少一者(例如一者、两者、三者或更多者，例如全部)；或(d)相对于(a)或(b)的所述多肽，具有不超过20个、不超过19个、不超过18个、不超过17个、不超过16个、不超过15个、不超过14个、不超过13个、不超过12个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过3个、不超过2个或不超过1个氨基酸突变的多肽，其中相对于seq id no:1，所述多肽包含与seq id no:2至seq id no:19中任一者相关的突变差异中的至少一者(例如，一者、两者、三者或更多者，例如全部)。

17.根据前述权利要求中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述变体衣壳多肽为vp1多肽、vp2多肽或vp3多肽。

18.一种核酸分子，其包含编码根据权利要求1至17中任一项所述的变体衣壳多肽的序列。

19.根据权利要求18所述的核酸分子，其包含与编码所述变体衣壳多肽的所述序列可操作地连接的一个或多个调控元件。

20.根据权利要求18至19中任一项所述的核酸分子，其包含seq id no:20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37，或其片段，或其与其具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性的变体。

21.一种病毒颗粒(例如，腺相关病毒(“aav”)颗粒)，其包含根据权利要求1至17中任一项所述的变体衣壳多肽或包含由根据权利要求18至20中任一项所述的核酸分子编码的变体衣壳多肽。

22.根据权利要求21所述的病毒颗粒，其包含含有异源转基因和一个或多个调控元件的核酸，所述异源转基因包含有效载荷。

23.根据权利要求21至22中任一项所述的病毒颗粒，其包含根据权利要求1至17中任一项所述的变体衣壳多肽，其中所述病毒颗粒、或包含所述变体衣壳多肽的病毒颗粒、或包含由根据权利要求18至20中任一项所述的核酸分子编码的变体衣壳多肽的病毒颗粒相对于野生型aav2(例如，包含seq id no:1的或由seq id no:38编码的衣壳多肽的病毒颗粒)表现出增加的眼部转导，例如，如在小鼠或在nhp中测量的，例如，如本文所述。

24.根据权利要求18至20中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是双链或单链的，任选地其中所述核酸分子是线性或环状的，例如其中所述核酸分子为质粒。

25.一种产生包含变体aav2衣壳多肽的病毒颗粒的方法，所述方法包括将根据权利要求18至20或24中任一项所述的核酸分子引入细胞(例如hek293细胞)中，以及从中收获所述病毒颗粒。

26.一种将有效载荷(例如，核酸)递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与依赖性细小病毒颗粒接触，所述依赖性细小病毒颗粒包含根据权利要求1至17中任一项所述的变体衣壳多肽或根据权利要求21至23中任一项所述的病毒颗粒以及有效载荷。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述细胞为眼部细胞，并且其中所述眼部细胞位于视网膜、黄斑或小梁网中。

28.一种将有效载荷(例如，核酸)递送至受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含根据权利要求1至17中任一项所述的变体衣壳多肽以及所述有效载荷的依赖性细小病毒颗粒，或向所述受试者施用根据权利要求21至23中任一项所述的病毒颗粒。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述颗粒将所述有效载荷递送至眼睛，并且其中所述颗粒将所述有效载荷递送至视网膜、黄斑或小梁网。

30.根据权利要求1至17中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求21至23中任一项所述的病毒颗粒或根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述颗粒(例如，包含所述变体衣壳多肽的所述颗粒)与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在所述眼睛的一个或多个区域中以增加的转导将所述有效载荷递送至所述眼睛。

31.根据权利要求30所述的变体衣壳多肽、病毒颗粒或方法，其中所述眼睛的所述一个或多个区域选自视网膜、黄斑、小梁网或其任意组合。

32.根据权利要求31所述的变体衣壳多肽、病毒颗粒或方法，其中所述视网膜包括非黄斑视网膜。

33.根据权利要求1至17中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求21至23中任一项所述的病毒颗粒或根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述颗粒(例如，包含所述变体衣壳多肽的所述颗粒)与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在所述眼睛的一个或多个区域中以增加的转导将所述有效载荷递送至所述眼睛，并且其中与包含seqid no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，转导的增加是至少2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍或150倍。

34.根据权利要求1至17中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求21至23中任一项所述的病毒颗粒或根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述颗粒(例如，包含所述变体衣壳多肽的所述颗粒)与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在所述眼睛的一个或多个区域中以增加的转导特异性将所述有效载荷递送至所述眼睛，其中与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，转导的增加是至少2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、500倍或1000倍，并且其中转导的增加对于非黄斑视网膜是特异性的。

35.根据权利要求1至17中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求21至23中任一项所述的病毒颗粒或根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述颗粒(例如，包含所述变体衣壳多肽的所述颗粒)与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在所述眼睛的一个或多个区域中以增加的转导特异性将所述有效载荷递送至所述眼睛，其中与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，转导的增加是至少2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、500倍或1000倍，并且其中转导的增加对于黄斑是特异性的。

36.根据权利要求1至17中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求21至23中任一项所述的病毒颗粒或根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中所述颗粒(例如，包含所述变体衣壳多肽的所述颗粒)与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，在所述眼睛的一个或多个区域中以增加的转导特异性将所述有效载荷递送至所述眼睛，其中与包含seq id no:1的衣壳多肽的病毒颗粒相比，转导的增加是至少2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、100倍、200倍、500倍或1000倍，并且其中转导的增加对于小梁网是特异性的。

37.根据权利要求30至36中任一项所述的变体衣壳多肽、病毒颗粒或方法，其中向所述受试者的施用是经由玻璃体内注射或前房内注射进行的。

38.一种治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括以有效治疗所述疾病或病症的量向所述受试者施用依赖性细小病毒颗粒，其中所述依赖性细小病毒颗粒是包含根据权利要求1至17和30至36中任一项所述的或由根据权利要求18至20或24中任一项所述的核酸编码的衣壳多肽的颗粒，或是根据权利要求21至23和30至36中任一项所述的病毒颗粒。

39.一种细胞、无细胞体系或其他翻译体系，其包含根据权利要求1至23和30至36中任一项所述的衣壳多肽、核酸分子或病毒颗粒。

40.一种制备依赖性细小病毒(例如，腺相关依赖性细小病毒(aav)颗粒的方法，所述方法包括：

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述细胞、无细胞体系或其他翻译体系包含第二核酸分子，并且所述第二核酸分子被包装在所述依赖性细小病毒颗粒中。

42.根据权利要求40所述的方法，其中第二核酸包含有效载荷，例如编码治疗产品的异源核酸序列。

43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中根据权利要求18至20或24中任一项所述的核酸介导依赖性细小病毒颗粒的产生，所述依赖性细小病毒颗粒不包含根据权利要求18至20或24中任一项所述的核酸。

44.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，其中根据权利要求18至20或24中任一项所述的核酸相比seq id no:92的核酸介导的生产水平以至少10％、至少20％、至少50％、至少100％、至少200％或更高的水平介导依赖性细小病毒颗粒的产生。

45.一种组合物，例如药物组合物，其包含根据权利要求21至23和30至36中任一项所述的病毒颗粒或通过根据权利要求25或40至44中任一项所述的方法产生的病毒颗粒，以及药学上可接受的载体。

46.根据权利要求1至17和30至36中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求18至20或24中任一项所述的核酸分子、或根据权利要求21至23和30至36中任一项所述的病毒颗粒，其用于治疗受试者的疾病或病症。

47.根据权利要求1至17和30至36中任一项所述的变体衣壳多肽、根据权利要求18至20或24中任一项所述的核酸分子、或根据权利要求21至23和30至36中任一项所述的病毒颗粒，其用于制造用于治疗受试者的疾病或病症的药物。

48.一种将有效载荷递送至小梁网的方法，所述方法包括向受试者施用包含变体衣壳多肽和核酸分子的病毒颗粒，所述核酸分子包含有效载荷，其中所述变体衣壳多肽包含与seq id no:1具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列，并且包含在seq id no:1的位置560至位置610的两个连续氨基酸之间(例如，在seq id no:1的位置584至位置589，例如，在seq id no:1的位置586与587之间或在位置587与588之间的两个连续氨基酸之间)的插入，其中所述插入包含肽lgettrp(seq id no:39)，例如，包含lalgettrpa(seq id no:40)。

49.一种治疗涉及小梁网的细胞的眼睛疾患的方法，所述方法包括通过房内注射向受试者施用包含变体衣壳多肽和核酸分子的病毒颗粒，所述核酸分子包含有效载荷，其中所述变体衣壳多肽包含与seq id no:1具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列，并且包含在seq id no:1的位置560至位置610的两个连续氨基酸之间(例如，在seq id no:1的位置584至位置589，例如，在seq id no:1的位置586与587之间或位置587与588之间的两个连续氨基酸之间)的插入，其中所述插入包含肽lgettrp(seq idno:39)，例如，包含lalgettrpa(seq id no:40)。

技术总结
本公开部分地涉及可用于向受试者的眼睛递送有效载荷以用于治疗小梁网疾患的包含肽插入的变体序列定义的衣壳多肽。具体地公开了AAV衣壳，其中变体衣壳多肽包含对应于在根据SEQ ID NO:1的位置587处的突变和/或在位置587与588之间的插入的突变。

技术研发人员：S·拉潘,H·莱维汀,L·惠洛克
受保护的技术使用者：迪诺治疗公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/8