靶向UPAR的CAR-T细胞及其用途的制作方法

本发明技术总体上涉及在有此需要的受试者中治疗covid相关的肺纤维化或直肠癌的方法。本文还公开了用于在有此需要的受试者中延迟或减轻衰老的影响的方法。本发明技术的方法包括向受试者施用有效量的包括表达upar特异性嵌合抗原受体的工程改造的免疫细胞的组合物。

背景技术：

1、以下对本发明技术背景的描述仅帮助理解本发明技术而提供，并且不承认描述或构成本发明技术的现有技术。

2、冠状病毒是大型有包膜的正链rna病毒家族，其导致人类和其他动物的上呼吸道、胃肠道和中枢神经系统疾病。冠状病毒刺突(s)糖蛋白(cov-s)是由病毒基因组编码的四种结构蛋白中的一种。它是一种i型跨膜糖蛋白，其在病毒体表面上形成突出的刺突，并且对结合至宿主受体和膜融合体至关重要。冠状病毒s糖蛋白被合成为由约1,300个氨基酸组成的前体蛋白，所述前体蛋白然后被裂解为氨基(n)末端s1亚基(约700个氨基酸)和羧基(c)末端s2亚基(约600个氨基酸)。将三个s1/s2异二聚体组装以形成从病毒包膜突出的三聚体刺突。s1亚基含有受体结合结构域(rbd)，而s2亚基含有疏水融合肽和两个七肽重复区。

3、严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)和中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)是人畜共患冠状病毒，其已经引起区域性和全球性疫情，其中死亡率分别为10％和35％。一种新型冠状病毒(sars-cov-2)引起了流行病和紧迫的全球公共卫生问题(zhou等人,《自然(nature)》,2020；holshue等人,《新英格兰医学杂志(nejm)》2020)。据报道，2019-ncov可能起源于蝙蝠，并且其与称为batcovratg13的蝙蝠冠状病毒共享96.2％的序列同一性(zhou等人,《自然》2020)。穿山甲很可能充当中间宿主。迫切需要开发针对这种病毒和与这种病毒相关的传染性疾病covid-19的治疗方法。

技术实现思路

1、在一个方面，本公开提供了一种用于在有此需要的受试者中治疗covid相关的肺纤维化的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的工程改造的免疫细胞，所述工程改造的免疫细胞包括包含upar抗原结合片段的受体和/或编码所述受体的核酸。

2、在一个方面，本公开提供了一种用于在已经接受或正在接受放射疗法或化学放射疗法的受试者中治疗直肠癌的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的工程改造的免疫细胞，所述工程改造的免疫细胞包括包含upar抗原结合片段的受体和/或编码所述受体的核酸。在另一方面，本公开提供了一种用于在被诊断患有直肠癌的受试者中提高过继细胞疗法的疗效的方法，其包含向受试者施用有效剂量的放射疗法或化学放射疗法和治疗有效量的工程改造的免疫细胞，所述工程改造的免疫细胞包括包含upar抗原结合片段的受体和/或编码所述受体的核酸。

3、在另一方面，本公开提供了一种用于在有此需要的受试者中减轻与年龄相关的体质下降的影响的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的工程改造的免疫细胞，所述工程改造的免疫细胞包括包含upar抗原结合片段的受体和/或编码所述受体的核酸。

4、在本文公开的方法的一些实施例中，upar抗原结合片段包含分别地gfslstsgm(seq id no:35)、wwddd(seq id no:36)和iggssgymdy(seq id no:37)的vhcdr1序列、vhcdr2序列和vhcdr3序列；和/或分别地rasesvdsygnsfmh(seq id no:41)、rasnlks(seq idno:42)和qqsnedpwt(seq id no:43)；或分别地kasenvvtyvs(seq id no:44)、gasnryt(seqid no:45)和gqgysypyt(seq id no:46)的vlcdr1序列、vlcdr2序列和vlcdr3序列。upar抗原结合片段可以包含seq id no:48的vh氨基酸序列和/或seq id no:50或seq id no:51的vl氨基酸序列。另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施例中，upar抗原结合片段包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：seq id no:52、seq id no:53和seq id no:54。

5、在本文公开的方法的其他实施例中，upar抗原结合片段包含：分别地gftfsny(seqid no:32)、stgggn(seq id no:33)和qgggysdsfdy(seq id no:34)的vhcdr1序列、vhcdr2序列和vhcdr3序列，以及分别地kasksiskyla(seq id no:38)、sgstlqs(seq id no:39)和qqhneyplt(seq id no:40)的vlcdr1序列、vlcdr2序列和vlcdr3序列，和/或编码所述受体的核酸。upar抗原结合片段可以包含seq id no:47的vh氨基酸序列和/或seq id no:49的vl氨基酸序列。

6、在本文公开的方法的实施例中的任一者中，受体是t细胞受体或结合至upar抗原的其他细胞表面配体。受体可以是非天然受体(例如，非天然t细胞受体)，例如，工程改造的受体，如嵌合抗原受体(car)。另外地或可替代地，在本发明技术的方法的一些实施例中，抗upar抗原结合片段是scfv、fab或(fab)2。另外地或可替代地，在本发明技术的方法的一些实施例中，受体可以连接至报告物或选择标志物(例如，gfp或lngfr)。在某些实施例中，受体经由自切割接头连接至报告物或选择标志物。在一些实施例中，自切割肽是p2a自切割肽。

7、在一些实施例中，本文提供的工程改造的免疫细胞表达t细胞受体(tcr)(例如，car)或其他细胞表面配体，所述细胞表面配体结合至在mhc分子的背景下呈递的upar抗原。在一些实施例中，本文提供的工程改造的免疫细胞表达t细胞受体(tcr)(例如，car)或其他细胞表面配体，所述细胞表面配体结合至在hla-a2分子的背景下呈递的upar抗原。另外地或可替代地，在一些实施例中，本文提供的靶向upar的工程改造的免疫细胞进一步表达一种或多种t细胞受体(tcr)(例如，car)或结合至另外的靶标的其他细胞表面配体。此类另外的靶标的实例包括但不限于gramd1a、kcnk3、rai2、npl、stc1、tom1、f3、slc6a8、slc22a4、serinc3、ddit4l、ly96、nfasc、ifngr1、dner、slc22a1、itgb3、lrp10、icam1、ulbp2、slc22a15、aplp1、abtb2、aff1、agpat2、agtrap、akap6、bfsp1、bhlhe40、card6、ccdc69、ccdc71l、fam219a、fam219b、fam43a、fam8a1、folr3、gsap、gys1、hecw2、hif1a、inhba、map3k8、mt-nd5、mt-nd6、prickle2、lrp12、slc6a8、itgb3、lrp10、btn2a2、icam1、abca1、slc22a23、tmem63b、slc37a1、slc22a4、enpp4、vnn1、serinc3、itga11、serinc2、ulbp2、slc22a15、aplp1、dpp4、abca3、tpcn1、abtb2、aff1、agpat2、agtrap、ahnak2、ak4、akap6、als2cl、ampd3、ankrd1、ankrd29、ankrd42、aox1、arhgef37、arrdc4、atp6v1h、bfsp1、bhlhe40、bhlhe41、btg2、c3、card6、casp4、ccdc69、ccdc71l、cdkn1a、chst15、coq10b、cpped1、ctsb、cyb5r1、cyba、cyfip2、cyp26b1、ddit4l、dirc3、dnajb9、dtx4、dynlt3、ell2、elovl7、eml1、fads3、fam210b、fam219a、fam219b、fam43a、fam8a1、filip1l、folr3、foxo1、gfpt2、gm2a、gpx3、gramd1a、grb10、gsap、gys1、hecw2、hif1a、hist2h2be、ids、igfn1、inhba、jun、kcnj15、kcnk3、kdm6b、kiaa1217、klhl21、lcp1、linc00862、ly96、lyplal1、lzts3、map1lc3b、map3k10、map3k8、map7、mapre3、mast3、moap1、msc、mt-nd3、mt-nd5、mt-nd6、mxd1、myo1d、nabp1、nov、npl、ogfrl1、p4ha2、pgm2l1、phyh、pla2g15、pla2g4c、pld1、plekhg5、plod2、ppargc1a、ppp2r5b、prickle2、psap、rab29、rab36、rab6b、rag1、rai2、retsat、riok3、rnf11、rnf14、rsph3、rusc2、sat1、scg5、sel1l3、serpini1、sesn2、siae、sod2、spata18、sptbn2、srpx2、st20-as1、stc1、stk38l、ston2、susd6、taf13、tap1、tbc1d2、tfec、tnfaip3、tnfaip8l3、tom1、tprg1l、tsku、ttc9、txnip、uba6-as1、vps18、wdr78、zfhx2和znfx1。

8、另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施例中，工程改造的免疫细胞是淋巴细胞，如t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞或任何其他源自诱导多能干细胞(ips)的免疫细胞。在一些实施例中，t细胞是cd4+t细胞或cd8+t细胞。在一些实施例中，工程改造的免疫细胞源自自体供体或同种异体供体。

9、另外地或可替代地，在本文公开的方法的某些实施例中，工程改造的免疫细胞包含嵌合抗原受体和/或编码嵌合抗原受体的核酸，其中嵌合抗原受体包含(i)细胞外抗原结合结构域；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内结构域。在一些实施例中，细胞外抗原结合结构域结合至upar抗原。

10、另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施例中，嵌合抗原受体的细胞外抗原结合结构域包含单链可变片段(scfv)。在一些实施例中，嵌合抗原受体的细胞外抗原结合结构域包含人scfv。另外地或可替代地，在一些实施例中，嵌合抗原受体的细胞外抗原结合结构域包含upar抗原结合片段(例如，scfv)，其包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：seq id no:52、seq id no:53和seq id no:54。另外地或可替代地，在一些实施例中，嵌合抗原受体的细胞外抗原结合结构域包含与seq id no:52-54中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的upar抗原结合片段(例如，scfv)。

11、另外地或可替代地，在一些实施例中，嵌合抗原受体的细胞外抗原结合结构域包含共价连接至细胞外抗原结合结构域的n末端的信号肽(例如，cd8信号肽)。另外地或可替代地，在一些实施例中，嵌合抗原受体的跨膜结构域包含cd8跨膜结构域或cd28跨膜结构域。另外地或可替代地，在一些实施例中，嵌合抗原受体的细胞内结构域包含一个或多个共刺激结构域。所述一个或多个共刺激结构域可以选自cd28共刺激结构域、4-1bb共刺激结构域、ox40共刺激结构域、icos共刺激结构域、dap-10共刺激结构域、pd-1共刺激结构域、ctla-4共刺激结构域、lag-3共刺激结构域、2b4共刺激结构域、btla共刺激结构域、cd3ζ链或其任何组合。

12、另外地或可替代地，在一些实施例中，编码受体的核酸可操作地连接至启动子。启动子可以是组成型启动子或条件型启动子。在一些实施例中，条件型启动子能通过受体(例如，car)与upar抗原的结合来诱导。

13、在另一方面，本公开提供了一种用于在有此需要的受试者中治疗covid相关的肺纤维化的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的工程改造的免疫细胞，其中所述工程改造的免疫细胞包括包含seq id no:59或seq id no:60的氨基酸序列的受体，和/或编码所述受体的核酸(例如seq id no:61或seq id no:62)。

14、在一个方面，本公开提供了一种用于在已经接受或正在接受放射疗法或化学放射疗法的受试者中治疗直肠癌的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的工程改造的免疫细胞，其中所述工程改造的免疫细胞包括包含seq id no:59或seq id no:60的氨基酸序列的受体，和/或编码所述受体的核酸。在另一方面，本公开提供了一种用于在被诊断患有直肠癌的受试者中提高过继细胞疗法的疗效的方法，其包含向所述受试者施用有效剂量的放射疗法或化学放射疗法和治疗有效量的工程改造的免疫细胞，其中所述工程改造的免疫细胞包括包含seq id no:59或seq id no:60的氨基酸序列的受体，和/或编码所述受体的核酸。

15、在另一方面，本公开提供了一种用于在有此需要的受试者中减轻与年龄相关的体质下降的影响的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的工程改造的免疫细胞，其中所述工程改造的免疫细胞包括包含seq id no:59或seq id no:60的氨基酸序列的受体，和/或编码所述受体的核酸。

16、在本文公开的方法的实施例中的任一者中，受体是t细胞受体。受体可以是非天然受体(例如，非天然t细胞受体)，例如，工程改造的受体，如嵌合抗原受体(car)。另外地或可替代地，在本发明技术的方法的一些实施例中，受体可以连接至报告物或选择标志物(例如，gfp或lngfr)。在某些实施例中，受体经由自切割接头连接至报告物或选择标志物。在一些实施例中，自切割肽是p2a自切割肽。

17、另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施例中，工程改造的免疫细胞是淋巴细胞，如t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞或任何其他源自诱导多能干细胞(ips)的免疫细胞。在一些实施例中，t细胞是cd4+t细胞或cd8+t细胞。在一些实施例中，工程改造的免疫细胞源自自体供体或同种异体供体。

18、另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施例中，嵌合抗原受体包含(i)被配置为结合至upar多肽的细胞外upa片段；(ii)跨膜结构域；和(iii)细胞内结构域。细胞外upa片段可以包含人upa片段。在某些实施例中，细胞外upa片段包含seq id no:59或seq idno:60的氨基酸序列。在其他实施例中，细胞外upa片段包含与seq id no:59或seq id no:60至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在本文公开的方法的前述实施例中的任一者和所有中，嵌合抗原受体的细胞外upa片段包含共价连接至细胞外upa片段的n末端的信号肽(例如，cd8信号肽)。

19、另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施例中，嵌合抗原受体的跨膜结构域包含cd8跨膜结构域或cd28跨膜结构域。另外地或可替代地，在一些实施例中，嵌合抗原受体的细胞内结构域包含一个或多个共刺激结构域。所述一个或多个共刺激结构域可以选自cd28共刺激结构域、4-1bb共刺激结构域、ox40共刺激结构域、icos共刺激结构域、dap-10共刺激结构域、pd-1共刺激结构域、ctla-4共刺激结构域、lag-3共刺激结构域、2b4共刺激结构域、btla共刺激结构域、cd3ζ链或其任何组合。

20、另外地或可替代地，在方法的一些实施例中，编码受体的核酸可操作地连接至启动子。启动子可以是组成型启动子或条件型启动子。在一些实施例中，条件型启动子能通过受体与upar多肽的结合来诱导。

21、在本文公开的方法的任何和所有实施例中，受试者被怀疑患有covid、处于患有covid的风险或被诊断为患有covid。在本文公开的方法的一些实施例中，受试者表现出选自由以下组成的群组的一种或多种体征或症状：肺纤维化病变、发热和咳嗽、胸闷、气短、肺异常、头痛、呼吸困难、疲劳、肌肉疼痛、肠道症状、腹泻、呕吐、双侧肺炎和胸腔积液。

22、另外地或可替代地，在本文公开的方法的一些实施例中，工程改造的免疫细胞通过全身、静脉内、皮下、腹膜内、皮内、离子电渗、经粘膜、鞘内、肌内、脑内、结节内、胸膜内或脑室内施用。

23、另外地或可替代地，在一些实施例中，本发明技术的方法进一步包含分别、依次或同时向受试者施用至少一种另外的治疗剂。另外的治疗剂的实例包括但不限于氧气疗法、抗病毒药物(洛匹那韦(lopinavir)、利托那韦(ritonavir)、利巴韦林(ribavirin)、法匹拉韦(favipiravir)(t-705)、雷地昔韦(remdesivir)、奥司他韦(oseltamivir)、氯喹(chloroquine)、美泊地布(merimepodib)和干扰素(interferon))、地塞米松(dexamethasone)、泼尼松(prednisone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、氢化可的松(hydrocortisone)、抗炎疗法、恢复期血浆疗法、巴尼韦单抗(bamlanivimab)、卡西瑞单抗(casirivimab)和伊德单抗(imdevimab)。

24、在一个方面，本公开提供了试剂盒，其包含工程改造的免疫细胞和使用所述工程改造的免疫细胞治疗covid相关的肺纤维化或直肠癌或减轻与年龄相关的体质下降的说明书，所述工程改造的免疫细胞包括包含upar抗原结合片段的受体和/或编码所述受体的核酸，其中所述upar抗原结合片段包含：分别地gfslstsgm(seq id no:35)、wwddd(seq idno:36)和iggssgymdy(seq id no:37)的vhcdr1序列、vhcdr2序列和vhcdr3序列；和/或分别地rasesvdsygnsfmh(seq id no:41)、rasnlks(seq id no:42)和qqsnedpwt(seq id no:43)；或分别地kasenvvtyvs(seq id no:44)、gasnryt(seq id no:45)和gqgysypyt(seq idno:46)的vlcdr1序列、vlcdr2序列和vlcdr3序列。upar抗原结合片段可以包含seq id no:48的vh氨基酸序列和/或seq id no:50或seq id no:51的vl氨基酸序列。另外地或可替代地，在本发明技术的试剂盒的一些实施例中，upar抗原结合片段包含选自由以下组成的群组的氨基酸序列：seq id no:52、seq id no:53和seq id no:54。

25、在另一方面，本公开提供了试剂盒，其包含工程改造的免疫细胞和使用所述工程改造的免疫细胞治疗covid相关的肺纤维化或直肠癌或减轻与年龄相关的体质下降的说明书，所述工程改造的免疫细胞包括包含upar抗原结合片段的受体和/或编码所述受体的核酸，其中所述upar抗原结合片段包含seq id no:59或seq id no:60的氨基酸序列。

26、本文还公开了试剂盒，其包含载体和使用用所述载体转导的免疫细胞来治疗covid相关的肺纤维化或直肠癌或减轻与年龄相关的体质下降的说明书，所述载体包括选自由以下组成的群组的核酸序列：seq id no:55、seq id no:56和seq id no:57。