用于生物体组织修复的细胞加工材料的制作方法

本发明涉及一种用于肌腱修复的生物体材料、该肌腱修复用生物体材料的制造方法、肌腱修复用试剂盒等，所述用于肌腱修复的生物体材料是以间充质干细胞作为交联点、水溶性聚合物进行化学结合而呈凝胶状、起到优异的肌腱修复效果的生物体材料。

背景技术：

1、水凝胶是高分子的三维网络在水中溶胀而成的软质材料，由于具有吸水性、物质保持性、物质释放性、物质分离性等特性，因此在食品、化妆品、生活用品、环境领域等中被广泛利用。进而，水凝胶由于具有柔软性、弹性、生物相容性、细胞保持特性等独特的特性，因此可期待在传感器或诊断设备、药物递送系统或再生医疗等要求高性能的医疗相关领域展开应用。

2、例如，在受到损伤的组织的修复中利用具有组织再生能力的细胞的技术受到关注，对于将细胞内含在凝胶中的复合材料进行了各种研究。在专利文献1中，报告了在含有具有水溶性且生物降解性的温度响应性聚合物和具有纳米片结构的粘土矿物的水凝胶中内含细胞的复合材料对损伤组织修复是有效的。但是，在使细胞内含在凝胶中的以往的复合材料中，由于只不过是将细胞物理性地担载于凝胶中，因此，当向受到损伤的组织施用时，细胞或细胞产生的增殖因子脱离到凝胶外，有时不能起到充分的组织再生效果，需要进一步的改善。

3、另外，近年来，随着老龄化，对肌肉组织萎缩的治疗方法的需求在变高。特别地，清楚的是下肢的肌肉决定了心力衰竭患者的运动耐受能力，肌肉力量的维持不仅对于健康预后是必须的，而且对于生命预后的延长也是必须的。作为这样的治疗方法，例如，提出了使用将成肌细胞或肌卫星细胞进行了化学交联的移植用凝胶材料的方法，报告了可得到肌肉组织的良好再生(参照非专利文献1～2、专利文献2～4)。另外，在非专利文献3中公开了使用了间充质干细胞的肌腱组织的修复方法。

4、现有技术文献

5、非专利文献

6、非专利文献1：nature communications，2018，vol.9，article no.2195，pp.1-11

7、非专利文献2：advanced biology，2021，vol.5，article no.2000106.

8、非专利文献3：journal of orthopaedic research，2017feb；35(2)：269-280

9、专利文献

10、专利文献1：日本特开2015-40276号公报

11、专利文献2：日本特开2020-192021号公报

12、专利文献3：美国公开公报第2020/0405914号

13、专利文献4：国际公开第2020/241904号小册子

技术实现思路

1、发明要解决的课题

2、在这样的状况下，希望提供新的用于肌腱修复的生物体材料等。

3、用于解决课题的方案

4、本发明人进行了深入研究，结果发现通过将间充质干细胞作为交联点、并使水溶性聚合物进行化学结合而形成的水凝胶在施用于受到损伤的肌腱组织时，该细胞在患处停留在水凝胶中，从而能够有效地修复肌腱组织。本发明是基于所述见解，通过进一步反复研究而完成的。

5、即，这里提供下述内容。

6、[1]用于肌腱修复的生物体材料，其包含通过反应性基团a和反应性基团b的交联反应而形成的水凝胶，其中，

7、所述水凝胶包含：

8、具有所述反应性基团a的水溶性聚合物、和

9、具有所述反应性基团b的间充质干细胞。

10、[2a]根据上述[1]所述的材料，其中，所述反应性基团a和反应性基团b的组合选自下述表中的组合。

11、[表1]

12、 反应性基团a 反应性基团b rg-1 炔基 叠氮基 rg-2 叠氮基 炔基 rg-3 羧基 氨基 rg-4 n-羟基珀酰亚胺酯基 氨基 rg-5 n-琥珀酰亚胺基 氨基 rg-6 氨基 羧基 rg-7 氨基 n-羟基珀酰亚胺酯基 rg-8 氨基 n-琥珀酰亚胺基 rg-9 巯基 巯基 rg-10 巯基 吡啶基二硫基 rg-11 巯基 马来酰亚胺基 rg-12 吡啶基二硫基 巯基 rg-13 马来酰亚胺基 巯基

13、[2b]根据上述[1]或[2a]所述的材料，其中，所述反应性基团a为炔基，所述反应性基团b为叠氮基。

14、[3]根据上述[1]至[2b]中任一项所述的材料，其中，所述反应性基团a为环状炔基，所述反应性基团b为叠氮基。

15、[4]根据上述[1]至[3]中任一项所述的材料，其中，所述水溶性聚合物包含与支链状化合物结合了的海藻酸。

16、[4a]根据上述[1]至[4]中任一项所述的材料，其中，所述水溶性聚合物包含与选自下述式(1-n)、式(1-n-1)、式(1-n-2-1)和式(1-n-2-2)中的支链状化合物结合了的海藻酸，

17、[表2]

18、

19、[4b]根据上述[1]至[4a]中任一项所述的材料，其中，所述水溶性聚合物包含下述式子：

20、[化1]

21、

22、所示的支链型海藻酸(balg)(式中，m＝1～10，n＝10～500，q＝1～10；

23、y1和y2为由下述计算式得到的值(该值为包含小数点的值时，可以是舍去小数点以下之后的整数值或将小数点以下进到个位之后的整数值)

24、(1)y1＝(mwalgn-18.01)/198.11(1+mg)、

25、(2)y2＝mg×y1

26、[式中，mwalgn为与支链状化合物结合的海藻酸钠的分子量(重均分子量)；mg为与支链状化合物结合的海藻酸钠的m/g比(＝y2/y1)]；

27、x3＝-nh(ch2)q-是其亚氨基(-nh-)与海藻酸的羧基形成为酰胺键的结合形式)。

28、[4b-1]在上述[4b]中，m优选为1～5，更优选为1。

29、[4b-2]在上述[4b]中，n优选为10～300，更优选为10～200，进一步优选为111。

30、[4b-3]在上述[4b]中，q优选为1～5，更优选为3。

31、[4b-4]在上述[4b]中，y1和y2为由下述计算式得到的值(该值为包含小数点的值时，可以是舍去小数点以下之后的整数值或将小数点以下进到个位之后的整数值)

32、(1)y1＝(mwalgn-18.01)/198.11(1+mg)、

33、(2)y2＝mg×y1

34、[式中，mwalgn为与支链状化合物结合的海藻酸钠的分子量(重均分子量)，例如为1万～1000万，优选为10万～500万，更优选为15万～300万的范围；

35、mg为与支链状化合物结合的海藻酸钠的m/g比，例如为0.1～4.0、0.1～3.0、0.1～2.0、0.5～1.8、0.8～1.2、或0.1～0.5的范围]；

36、优选为253。

37、[4b-5]在上述[4b-4]中，mwalgn和mg为表3中记载的、海藻酸钠的分子量(重均分子量)、海藻酸钠的m/g比。

38、[4c]根据上述[1]至[4a]中任一项所述的材料，其中，所述水溶性聚合物包含下述式子：

39、[化2]

40、

41、所示的支链型海藻酸(balg)(式中，x1＝-nhch2ch2ch2-是其亚氨基(-nh-)与海藻酸的羧基形成为酰胺键的结合形式)。

42、[4-1]根据上述[1]至[4c]中任一项所述的材料，其中，具有所述反应性基团a的水溶性聚合物包含下述式子：

43、[化3]

44、

45、所示的环辛炔化支链型海藻酸(balg-dbco)，

46、(式中，m＝1～10，n＝10～500，q＝1～10；

47、y1和y2为由下述计算式得到的值(该值为包含小数点的值时，可以是舍去小数点以下之后的整数值或将小数点以下进到个位之后的整数值)

48、(1)y1＝(mwalgn-18.01)/198.11(1+mg)、

49、(2)y2＝mgxy1

50、[式中，mwalgn为与支链状化合物结合的海藻酸钠的分子量(重均分子量)；mg为与支链状化合物结合的海藻酸钠的m/g比(＝y2/y1)]；x3＝-nh(ch2)q-是其亚氨基(-nh-)与海藻酸的羧基形成为酰胺键的结合形式)。

51、[4-1-1]在上述[4-1]中，m优选为1～5，更优选为1。

52、[4-1-2]在上述[4-1]中，n优选为10～300，更优选为10～200，进一步优选为111。

53、[4-1-3]在上述[4-1]中，q优选为1～5，更优选为3。

54、[4-1-4]在上述[4-1]中，y1和y2为由下述计算式得到的值(该值为包含小数点的值时，可以是舍去小数点以下之后的整数值或将小数点以下进到个位之后的整数值)

55、(1)y1＝(mwalgn-18.01)/198.11(1+mg)、

56、(2)y2＝mg×y1

57、[式中，mwalgn为与支链状化合物结合的海藻酸钠的分子量(重均分子量)，例如为1万～1000万，优选为10万～500万，更优选为15万～300万的范围；

58、mg为与支链状化合物结合的海藻酸钠的m/g比，例如为0.1～4.0、0.1～3.0、0.1～2.0、0.5～1.8、0.8～1.2、或0.1～0.5的范围]；

59、优选为253。

60、[4-1-5]在上述[4-1-4]中，mwalgn和mg为表3中记载的、海藻酸钠的分子量(重均分子量)、海藻酸钠的m/g比。

61、[4-2]根据上述[1]至[4c]中任一项所述的材料，其中，具有所述反应性基团a的水溶性聚合物包含下述式子：

62、[化4]

63、

64、所示的环辛炔化支链型海藻酸(balg-dbco)(式中，x1＝-nhch2ch2ch2-为其亚氨基(-nh-)与海藻酸的羧基形成为酰胺键的结合形式)。

65、[5]根据上述[1]至[4-2]中任一项所述的材料，其中，所述间充质干细胞为源于骨髓的物质。

66、[6]根据上述[1]至[5]中任一项所述的材料，其中，所述水凝胶中所含的细胞数为约1.0×105个细胞/ml以上。

67、[6-1]根据上述[1]至[5]中任一项所述的材料，其中，所述水凝胶中所含的细胞数为约1.0×107～约2.0×108个细胞/ml。

68、[7]根据上述[1]至[6-1]中任一项所述的材料，其中，所述水溶性聚合物的浓度相对于水凝胶的总量为约0.2～约8.0重量％。

69、[7-1]根据上述[1]至[6-1]中任一项所述的材料，其中，所述水溶性聚合物的浓度相对于水凝胶的总量为约2.0～约4.0重量％。

70、[8]根据上述[1]至[7-1]中任一项所述的材料，其中，所述水凝胶为注射用凝胶。

71、[9]根据上述[1]至[8]中任一项所述的材料，其用于修复选自膝盖肌腱、胫骨前肌肌腱、阿基里斯腱、胭肌肌腱、半腱肌肌腱、股薄肌肌腱、外展肌腱、内展肌腱、冈上肌肌腱、冈下肌肌腱、肩胛下肌腱、小圆肌肌腱、屈肌腱、股直肌肌腱、胫骨后肌肌腱、和股四头肌肌腱中的肌腱组织。

72、[9-1]根据上述[1]至[8]中任一项所述的材料，其用于修复选自膝盖肌腱、胫骨前肌肌腱、阿基里斯腱、胭肌肌腱、半腱肌肌腱、股薄肌肌腱、冈上肌肌腱、冈下肌肌腱、肩胛下肌腱、小圆肌肌腱、股直肌肌腱、胫骨后肌肌腱、和股四头肌肌腱中的肌腱组织。

73、[10]肌腱修复用生物体材料的制造方法，其中，包含使具有反应性基团a的水溶性聚合物、与具有反应性基团b的间充质干细胞进行交联反应的工序。

74、[10-1]根据上述[10]所述的肌腱修复用生物体材料的制造方法，其中，反应性基团a和反应性基团b的组合选自上述[2a]记载的表中的组合。

75、[10-2]根据上述[10]或[10-1]所述的肌腱修复用生物体材料的制造方法，其中，反应性基团a为炔基，反应性基团b为叠氮基。

76、[10-3]根据上述[10]至[10-2]中任一项所述的肌腱修复用生物体材料的制造方法，其中，反应性基团a为环状炔基，反应性基团b为叠氮基。

77、[10-4]根据上述[10]至[10-3]中任一项所述的肌腱修复用生物体材料的制造方法，其中，所述水溶性聚合物包含与支链状化合物结合了的海藻酸。

78、[10-5]根据上述[10]至[10-4]中任一项所述的肌腱修复用生物体材料的制造方法，其中，所述水溶性聚合物包含上述[4a]中记载的与选自式(1-n)、式(1-n-1)、式(1-n-2-1)和式(1-n-2-2)中的支链状化合物结合了的海藻酸。

79、[10-6]根据上述[10]至[10-5]中任一项所述的肌腱修复用生物体材料的制造方法，其中，所述水溶性聚合物包含如上述[4b]或[4c]中记载的支链型海藻酸(balg)。

80、[11]根据上述[10]至[10-6]中任一项所述的肌腱修复用生物体材料的制造方法，其中，具有反应性基团a的水溶性聚合物为如上述[4-1]或[4-2]中记载的环辛炔化支链型海藻酸(balg-dbco)，反应性基团b为叠氮基。

81、[12]肌腱修复用试剂盒，其中，包含：具有反应性基团a的水溶性聚合物、和具有反应性基团b的间充质干细胞，

82、所述试剂盒以应用水凝胶的方式被使用，所述水凝胶通过所述反应性基团a和所述反应性基团b进行交联反应而得到。

83、[12-1]根据上述[12]所述的肌腱修复用试剂盒，其中，反应性基团a和反应性基团b的组合选自上述[2a]记载的表中的组合。

84、[12-2]根据上述[12]或[12-1]所述的肌腱修复用试剂盒，其中，反应性基团a为炔基，反应性基团b为叠氮基。

85、[12-3]根据上述[12]至[12-2]中任一项所述的肌腱修复用试剂盒，其中，反应性基团a为环状炔基，反应性基团b为叠氮基。

86、[12-4]根据上述[12]至[12-3]中任一项所述的肌腱修复用试剂盒，其中，所述水溶性聚合物包含与支链状化合物结合了的海藻酸。

87、[12-5]根据上述[12]至[12-4]中任一项所述的肌腱修复用试剂盒，其中，所述水溶性聚合物包含上述[4a]中记载的与选自式(1-n)、式(1-n-1)、式(1-n-2-1)和式(1-n-2-2)中的支链状化合物结合了的海藻酸。

88、[12-6]根据上述[12]至[12-5]中任一项所述的肌腱修复用试剂盒，其中，所述水溶性聚合物包含上述[4b]或[4c]中记载的支链型海藻酸(balg)。

89、[12-7]根据上述[12]至[12-6]中任一项所述的肌腱修复用试剂盒，其中，具有反应性基团a的水溶性聚合物为上述[4-1]或[4-2]中记载的环辛炔化支链型海藻酸(balg-dbco)，反应性基团b为叠氮基。

90、[13]用于肌腱修复的组合物，其包含具有反应性基团a的水溶性聚合物。

91、[13-1]根据上述[13]所述的用于肌腱修复的组合物，其中，反应性基团a选自炔基、叠氮基、羧基、n-羟基琥珀酰亚胺酯基、n-琥珀酰亚胺基、氨基、巯基、吡啶基二硫基和马来酰亚胺基。

92、[13-2]根据上述[13]或[13-1]所述的用于肌腱修复的组合物，其中，反应性基团a为炔基。

93、[13-3]根据上述[13]至[13-2]中任一项所述的用于肌腱修复的组合物，其中，反应性基团a为环状炔基。

94、[13-4]根据上述[13]至[13-3]中任一项所述的用于肌腱修复的组合物，其中，所述水溶性聚合物包含与支链状化合物结合了的海藻酸。

95、[13-5]根据上述[13]至[13-4]中任一项所述的用于肌腱修复的组合物，其中，所述水溶性聚合物包含上述[4a]中记载的与选自式(1-n)、式(1-n-1)、式(1-n-2-1)和式(1-n-2-2)中的支链状化合物结合了的海藻酸。

96、[13-6]根据上述[13]至[13-5]中任一项所述的用于肌腱修复的组合物，其中，所述水溶性聚合物包含上述[4b]或[4c]中记载的支链型海藻酸(balg)。

97、[14]用于肌腱修复的组合物，其包含具有反应性基团a的水溶性聚合物和具有反应性基团b的间充质干细胞。

98、[15]用于肌腱修复的组合物，其包含通过具有反应性基团a的水溶性聚合物和具有反应性基团b的间充质干细胞的交联反应形成的水凝胶。

99、[16-1]根据上述[14]或[15]所述的用于肌腱修复的组合物，其中，反应性基团a和反应性基团b的组合选自上述[2a]记载的表中的组合。

100、[16-2]根据上述[14]至[16-1]中任一项所述的用于肌腱修复的组合物，其中，反应性基团a为炔基，反应性基团b为叠氮基。

101、[16-3]根据上述[14]至[16-2]中任一项所述的用于肌腱修复的组合物，其中，反应性基团a为环状炔基，反应性基团b为叠氮基。

102、[16-4]根据上述[14]至[16-3]中任一项所述的用于肌腱修复的组合物，其中，所述水溶性聚合物包含与支链状化合物结合了的海藻酸。

103、[16-5]根据上述[14]至[16-4]中任一项所述的用于肌腱修复的组合物，其中，所述水溶性聚合物包含上述[4a]中记载的与选自式(1-n)、式(1-n-1)、式(1-n-2-1)和式(1-n-2-2)中的支链状化合物结合了的海藻酸。

104、[16-6]根据上述[14]至[16-5]中任一项所述的用于肌腱修复的组合物，其中，所述水溶性聚合物包含上述[4b]或[4c]中记载的支链型海藻酸(balg)。

105、[16-7]根据上述[14]至[16-6]中任一项所述的用于肌腱修复的组合物，其中，具有反应性基团a的水溶性聚合物为上述[4-1]或[4-2]中记载的环辛炔化支链型海藻酸(balg-dbco)，反应性基团b为叠氮基。

106、发明的效果

107、本发明提供一种新的用于肌腱修复的生物材料等。本发明的一个实施方式中的生物体材料由于在水凝胶中，间充质干细胞以化学键结合水溶性聚合物，因此即使被施用于产生损伤的肌腱组织，也能够使细胞保持在水凝胶中并停留在患处，从而能够有效地进行受损的肌腱组织的修复。在优选的方式中，本发明的生物体材料在移植后的第4周，与未治疗组相比，基于modified watkins score的损伤部位的细胞和肌腱纤维的取向性显著良好。另外，本发明的生物体材料除了通过施加适当的力学负荷(拉伸刺激)而可进行适应环境的细胞分化/组织修复之外，还具有可进行低侵袭的经皮细胞移植的临床优点。进而，本发明的一个方式中的生物体材料由于使用海藻酸，因此可以期待从移植细胞释放合适的液性因子(例如细胞因子、趋化因子)、减轻免疫应答(纤维化、瘢痕化的预防)等的效果。

108、附图的简单说明

109、图1是制作细胞交联凝胶的工序的示意图。

110、图2是表示lewis大鼠的阿基里斯腱损伤制作部的示意图。

111、图3是各组术后2周及4周的阿基里斯腱损伤部的照片。

112、图4是表示各组术后2周的组织学评价的结果的图。

113、图5是表示各组术后2周的组织学评价的结果的图(plm)。

114、图6是示出各组术后2周的modified watkins score的图。

115、图7是表示各组术后4周的组织学评价的结果的图。

116、图8是表示各组术后4周的组织学评价的结果的图(plm)。

117、图9是表示各组术后4周的modified watkins score的图。

118、图10是表示各组的qpcr的结果的图。

119、图11是表示各组的拉伸试验的结果的图。