一种羊胎盘提取液的一步水解制备方法与流程

1.本发明涉及生物制品技术领域，尤其涉及一种羊胎盘提取液的一步水解制备方法。


背景技术：

2.胎盘是哺乳动物生产后从胎儿剥离下来的包衣组织，富含丰富的血管和各种基质细胞，对哺乳动物胚胎的发育提供保护和营养支持的作用，胎盘提取液是胎盘组织经水解、酸解后的产物，含有很多氨基酸、免疫调节活性物质，可以作为化妆品的原液或者添加物。
3.目前，胎盘提取液的制备一般采用多次水解工艺，上述方法极易导致胎盘中的活性成分被破坏，从而使得制备得到的胎盘提取液活性较差。例如，文献号为cn 101721458 b的中国发明专利公开了一种人胎盘组织液的制备方法，该方法通过超声提取得到粗分胎盘组织液，然后再依次进行酸水解和碱水解，并在水解后进行精滤，从而得到精滤胎盘组织液，该方法需要进行多次水解，不仅操作繁琐，同时制备得到的胎盘提取液质量不易控制。因而，还需要进一步改进。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种羊胎盘提取液的一步水解制备方法，所述羊胎盘提取液的一步水解制备方法以羊胎盘为原料，制备方法简单，且制备所得的羊胎盘提取液安全有效，质量易于控制。
5.为达到上述技术效果，本发明采用了以下技术方案：一种羊胎盘提取液的一步水解制备方法，包括步骤：s1：对羊胎盘进行预处理以分离子叶：s2：将子叶制备为匀浆；s3：对上述匀浆进行反复冻融，直至细胞破碎率达95%；s4：对反复冻融后的匀浆进行离心，并在离心结束后收集上清液；s5：取s4获得的上清液进行过滤以得到澄清滤液，将上述澄清滤液于60～80℃下进行水解，得水解液；s6：将上述水解液进行离心，并取上清液进行灭菌，以获得羊胎盘提取液。
6.进一步地，所述s1的预处理包括：取新鲜羊胎盘或将冻存的羊胎盘解冻，分离子叶并进行漂洗，再将漂洗后的子叶剪切为直径为2～3 mm的块状组织。
7.进一步地，所述漂洗条件为：漂洗2～4次，每次漂洗均采用体积为100～2000ml的经4℃预冷的pbs溶液进行漂洗。
8.进一步地，所述s2具体包括：s21：对匀浆器进行预冲洗，且所述预冲洗包括先采用pbs冲洗，再使用生理盐水进行冲洗，具体为：先向匀浆器捣碎杯中加入150～200ml 4℃预冷的pbs，使匀浆器运转2～3min，然后倒去pbs，采用pbs重复清洗2～3次；再加入 4℃预冷的生理盐水100～200 ml，使
匀浆器运转2～3min，倒去生理盐水。
9.s22：将漂洗后的子叶放入匀浆器的捣碎杯中，按2～3ml/g加入4℃预冷的生理盐水，旋动调速旋钮，缓慢加速，至最高速度的2/3后捣碎2分钟，停机，将匀浆倒入容器中，再按2～3ml/g加入4℃预冷的生理盐水冲洗捣碎杯，将洗液一并倒入烧杯中。
10.进一步地，所述s3具体为：将s2制得的匀浆进行分装并将其置于-30～-20℃以下温度下冻存24～26h，然后取出化冻，反复冻融4～5次，然后可将其置于4℃冰箱中存放待用。优选地，冷冻温度为-30℃。
11.优选地，所述化冻过程具体为：先取出冷冻匀浆将其置于37℃以下室温化冻1/5～1/3体积，然后再将其置于37℃以下水浴直至化冻95%以上体积或完全化冻，且化冻过程中每5～10min对匀浆进行一次振摇，可选为手动振摇或机械振摇。
12.进一步地，所述澄清过滤采用滤膜进行过滤，且所选滤膜孔径为0.8μm，滤膜使用前先使用灭菌水浸泡20min，再使用生理盐水泡10min。
13.进一步地，所述s5中的水解具体为：将水浴锅提前预热至60～80℃，优选为80℃将滤液装入容器内并将其转移水浴锅内水浴从而进行水解，处理时长为20～40 min，优选为30 min。
14.进一步地，所述s6中的灭菌采用高压蒸汽灭菌方法，具体为：灭菌温度为121℃、灭菌2～3次，每次20～30min。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的一种羊胎盘提取液的一步水解制备方法以羊胎盘为原料，通过制匀浆、对匀浆进行反复冻融直至细胞破碎率达95%，然后再通过离心获取上清液并对上清液进行一步水解，再在水解后通过离心分离上清液，并对该上清液进行灭菌，可以获得质量稳定、活性较好的羊胎盘提取液，上述提取方式可以扩展至其他动物来源或是人源的胎盘提取液的制备方法，该种制备方法简单易行，且水解条件便于实施，制备得到的胎盘提取液活性较高，安全性好，质量可控，能够作为化妆品的原液或者添加物进行应用。
附图说明
16.图1为本发明的实施例5提供的1号志愿者（实验组一）在测试前后的皮肤斑点的检测对比图（左为测试前，右为测试后）；图2为本发明的实施例5提供的2号志愿者（实验组二）在测试前后的皮肤皱纹检测对比图（左为测试前，右为测试后）；图3为本发明的实施例5提供的3号志愿者（实验组三）在测试前后的皮肤紫质检测对比图（左为测试前，右为测试后）。
具体实施方式
17.下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂或仪器未注明生产厂商者，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料，且实施例中未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行。
18.实施例1本实施例为本发明的第一制备实施例，本实施例提供一种羊胎盘提取液的制备方法，该羊胎盘提取液通过以下方法进行制备：s1：对羊胎盘进行预处理以分离子叶：将冻存的羊胎盘从-20℃取出放入4℃冰箱或室温化冻，分离出子叶，对上述子叶进行采用提前配好并放4℃预冷的pbs漂洗，150～250ml每次，漂洗3～4次；然后用手术剪将胎盘子叶剪至直径为2～3 mm大小的块状组织，称重并记录重量为m1，然后放4℃保存，待匀浆。
19.s2：将子叶制备为匀浆，包括：s21：对匀浆器进行预冲洗：在匀浆器的捣碎杯中加入150～200ml 4℃预冷的pbs，开机运转1分钟后停机2分钟，倒去pbs，重复上述过程2次。
20.再加入 4℃预冷的生理盐水100ml，开机运转1分钟后停机2分钟，倒去生理盐水。
21.s22：将漂洗后的子叶放入匀浆器的捣碎杯中，制备匀浆，具体操作如下：将上述块状组织置捣碎杯中，按2ml/g加入4℃预冷的生理盐水，旋动调速旋钮，缓慢加速，至最高速度的2/3后捣碎2分钟，停机，将匀浆倒入烧杯中，再按2ml/g加入4℃预冷的生理盐水冲洗捣碎杯，将洗液一并倒入烧杯中。
22.s3：对上述匀浆进行反复冻融，直至细胞破碎率达95%，具体为：将匀浆分装至15ml离心管，每管10ml匀浆，置于-30～-20℃以下冰箱冻存24小时后化冻。匀浆化冻温度应先在37℃以下的室温放置化冻，待匀浆1/4部分化冻后，可置于37℃以下的水浴温度中快速化冻，促使细胞破裂，化冻过程中每5分钟振摇一次，幅度不宜过大，不可使匀浆触及瓶口。
23.待匀浆完全或90%化冻后，应立即送-30℃冰箱冻存,摆放整齐。每完成上述一个过程为一次冻融，冻融4次后备用，待离心。
24.s4：对反复冻融后的匀浆进行离心，并在离心结束后收集上清液，包括：在离心前，离心机转头采用蘸有新洁尔灭或酒精的纱布擦拭，并且使离心机在4℃下进行预冷，然后取出化冻后的匀浆，于4000～8000rpm下离心操作20分钟后，关停离心机，将离心获得的进行上清液进行收集。
25.s5：取s4获得的上清液进行过滤以得到澄清滤液，过滤时，上清液用事先准备好的500ml培养基滤器（连接真空泵）进行澄清过滤，滤膜孔径为0.8μm，收集滤液，取100ul小样冻存检测，滤膜使用前用灭菌水浸泡20min，生理盐水泡10min。
26.过滤后，将水浴锅提前预热至80℃，将滤液转移水浴锅内进行水解，处理时长为30 min。
27.s6：将上述水解液进行离心，离心条件为：4000rpm，时间15分钟；温度8℃，然后分离上清液，对上清液进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度为121℃、灭菌2～3次，每次20～30min，以获得羊胎盘提取液。
28.s7：对获得的羊胎盘提取液进行稀释过滤，根据m1计算稀释的体积，将其稀释为浓度为0.2g/ml（质量分数）的羊胎盘提取液，从而可直接用于制备护肤品。
29.s8：分装和检测，对每批次提取的羊胎盘提取液取样进行蛋白含量检测，渗透压检测，无菌检测，内毒素检测，然后对检测合格的羊胎盘提取采用棕色西林瓶进行分装。
30.检测结果为蛋白含量范围在0.1
±
0.03 mg/ml；渗透压为250
±
30osml/kg；无菌检
测应为阴性；内毒素检测应低于0.5eu，则认为制备所得的羊胎盘提取液合格，可用于进一步分装和使用。
31.实施例2本实施例为本发明的第二制备实施例，本实施例提供一种皮肤导入修复液及其制备方法，该皮肤导入修复液包括通过本发明方法制备得到的羊胎盘提取液以及透明质酸钠，具体为：该皮肤导入修复液包括上述实施例1制备得到的浓度为0.2g/ml（质量分数）的羊胎盘提取液，将上述0.2g/ml（质量分数）的羊胎盘提取液按照1:1的质量比添加至透明质酸钠溶液中，以将其制备为导入修复液，该导入修复液可通过皮肤导入仪导入，以起到美容效果。
32.实施例3本实施例为本发明的第三制备实施例，本实施例提供一种羊胎盘提取液面膜及其制备方法，该羊胎盘提取液面膜包括面膜基质以及面膜液，该面膜基质可以采用化妆棉或蚕丝进行制备，该面膜液包括第一组分和第二组分，其中，该第一组分和第二组分分别包括以下质量份数的组分：第一组分：12份聚乙烯醇、10份甘油、1份咪唑烷基脲、5份乙醇、7份月桂醇聚氧乙烯醚、适量香精、防腐剂，并用纯化水补足上述体系至100份。
33.第二组分：为通过实施例1制备得到的浓度为0.2g/ml（质量分数）的羊胎盘提取液，且添加量为第一组分体积的10%。
34.制备方法具体为：化妆棉或蚕丝制备面膜基质，然后将第一组分和第二组分混合均匀以制备面膜液，在4℃使上述面膜液被吸附于面膜基质，使用时可直接进行敷贴，长期面部敷贴可以起到皮肤美白、修复、抗衰老的作用。
35.实施例4本实施例为本发明的第四制备实施例，本实施例提供一种羊胎盘提取液保湿面霜及其制备方法，该羊胎盘提取液保湿面霜采用上述实施例1制备得到的浓度为0.2g/ml（质量分数）的羊胎盘提取液与透明质酸钠按照1:1的质量比作为原料，将其制备为面霜产品，以供使用。
36.实施例5本实施例为本发明的应用实施例，在本实施例中，照实施例2-4分别制备了皮肤护理产品，并组织了志愿者进行了使用测试。
37.在30名测试者中，按照不同的诉求，将测试者分为了3组，每组10人，实验组一的诉求是美白淡斑，实验组二的诉求是细致毛孔和减少皱纹，实验组三的诉求是紧致和增加皮肤弹性。
38.测试过程中，将实施例2制备得到的皮肤导入修复液采用导入仪进行导入，每周1次，连续3周为一个测试周期，导入后使用实施例3的面膜、实施例4的保湿面霜配合使用。在导入前对每个受试者的皮肤用visia医用皮肤检测仪进行检测并记录存档。
39.2个测试周期（6周）结束后，再用visia皮肤检测仪对各个实验组的志愿者进行检测，对相应的数据进行分析和统计学检测。测试结果为：实验组一美白淡斑的效果有效率达到40%，实验组二，对皱纹和毛孔的改善率为30 %，实验组三对紧致和增加皮肤弹性的有效
率为20%。
40.测试结果二：请参阅图1～3，本实施例还提供了部分志愿者在测试前后的visia检测对比图。
41.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。