一种糖尿病肾病预测模型的建构、判断方法及其试剂盒

本发明主要涉及一种疾病的预测模型建构及判断的，具体的是准确计数预测模型中的肾小球足细胞的丢失数量，以判断糖尿病肾病发展情况，并提供一种糖尿病肾病预测模型构建的试剂盒。

背景技术：

1、足细胞是附着在肾小球基底膜(gbm)外侧的脏层上皮细胞，其是无法被替换或再生的终末分化细胞，与基底膜和肾小球内皮细胞一起构成肾小球滤过屏障(gfb)。

2、足细胞是肾小球滤过屏障包括：机械屏障和电荷屏障的重要组成部分，参与合成肾小球基底膜的基质成分，并影响滤过膜静水压力，从而维持肾小球基底膜的代谢平衡。因此，足细胞在肾小球滤过屏障中起关键作用。当足细胞受到损伤时，例如足细胞丢失或结构改变，会破坏肾小球滤过屏障的完整性，导致蛋白渗漏，蛋白尿发生。

3、足细胞病是一种损伤足细胞的慢性肾脏疾病，以蛋白尿或肾病综合征为主要临床表现。糖尿病肾病(dn)是糖尿病的严重微血管并发症，也是终末期肾病(esrd)的最常见原因，蛋白尿是其最重要的临床症状之一。在糖尿病患者中，代谢紊乱和血流动力学异常会导致足细胞损伤，因此，糖尿病肾病是最常见的足细胞病之一。随着足细胞数量的减少，剩余的足细胞代偿性肥大以覆盖增加的肾小球基底膜，肥大足细胞中增宽的足突以及后期失代偿所致基膜裸露均会导致持续性的大量蛋白尿。

4、在dn患者中，蛋白尿可引起水肿和低蛋白血症，还可直接引起肾小管上皮细胞的坏死和脱落，是终末期肾病的重要危险因素。因此，足细胞数量可影响dn的发展和预后，计算足细胞数量变化对于足细胞病病程的判断具有重要意义。

5、评估足细胞丢失常用的方法是对组织切片中每个肾小球横截面的足细胞核进行计数。新近研究明确指出了这种方法的多重局限性，包括低保真度和准确性。鉴于此，一些学者开发了一种通过厚薄切片计数足细胞的方法。虽然这种方法提高了计数的准确性，但整个操作过程相当复杂；而且，这种方法的要求很严格，如切片过程中出现组织损失或切片位置偏移将不可避免地导致最终结果出现巨大误差。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是利用三维透明化技术由动物的肾小球足细胞的丢失数量来建构预测模型，用以判断糖尿病肾病预测模型是否构建成功，以及判断糖尿病肾病发展情况。

2、本发明的再一目的是利用三维透明技术应用于样本中荧光蛋白或免疫染色样本组织的多色成像以计数样本中足细胞的数量来判断糖尿病肾病预测模型是否构建成功，以及判断糖尿病肾病发展情况。

3、本发明的另一目的在于提供一种试剂盒可以用于处理样本组织并利用三维透明化技术及免疫荧光标记以计数样本的足细胞数量以提高计数足细胞的数量准确度及判断糖尿病肾病预测模型是否构建成功。

4、根据上述目的，本发明披露一种糖尿病肾病预测模型的构建、判断方法，其步骤包括：采集样本；进行第一清洗步骤，将样本利用第一洗剂进行清洗；对已进行第一清洗步骤的样本进行免疫荧光标记；进行第二清洗步骤，将已进行免疫荧光标记的样本利用第二洗剂进行清洗；以及成像步骤，对已清洗的免疫荧光标记的样本进行成像以得到相应的图像，由图像计算样本中的目标物的数量。

5、在本发明较优选的实施例中，第一清洗步骤包括：将样本浸入1/2第一洗剂中，振荡6小时；将浸有样本的1/2第一洗剂倒掉，添加新的第一洗剂并进行振荡，接着于所述振荡步骤之后更换新的第一洗剂；然后以48小时的时间为间隔更换浸有样本的第一洗剂3次。

6、在本发明较优选的实施例中，在将样本浸入第一洗剂之前还包括将样本利用pbs缓冲液进行清洗。

7、在本发明较优选的实施例中，第一洗剂由尿素、四羟丙基乙二胺、曲拉通x-100(triton x-100)及双蒸水(double distilled water，ddh2o)组成，1/2第一洗剂由第一洗剂和双蒸水按照1:1的体积比例配制而成。

8、在本发明较优选的实施例中，在对已进行第一清洗步骤的样本进行免疫荧光标记的步骤包括：利用第一缓冲液振荡清洗样本2小时之后，再利用新的第一缓冲液振荡清洗8小时以上，然后利用新的第一缓冲液振荡清洗样本2小时；将样本浸入一级抗体，并振荡72小时；利用第二缓冲液对样本每隔两小时进行振荡清洗且清洗四次，然后利用第二缓冲液将样本振荡清洗8小时以上；将样本浸入二级抗体，并进行振荡72小时；以及利用第三缓冲液对样本每隔两小时进行振荡清洗且清洗四次，然后利用第三缓冲液将样本振荡清洗8小时以上，以完成对样本进行所述免疫荧光标记。

9、在本发明较优选的实施例中，第一缓冲液、第二缓冲液及第三缓冲液为pbs缓冲液。

10、在本发明较优选的实施例中，一级抗体由足细胞核标记物wt-1抗体、足细胞浆标记物synaptopodin抗体与一级抗体稀释溶液按照1:1:100的体积比例配制而成；二级抗体由红色荧光耦合抗体和绿色荧光耦合抗体和二级抗体稀释溶液按照1:1:100的体积比例配制而成。

11、在本发明较优选的实施例中，一级抗体稀释溶液及二级抗体稀释溶液是由曲拉通x-100(triton x-100)、牛血清蛋白(bovine serum albumin)及含有叠氮化钠溶液(sodiumazide solution)的pbs缓冲液所配制而成。

12、在本发明较优选的实施例中，第二清洗步骤包括：将样本浸入1/2第二洗剂，并振荡24小时直至样本沉入容器的底部为止；将浸有样本的1/2第二洗剂倒掉，再添加第二洗剂，并振荡8小时以上；然后以24小时的时间为间隔更换浸有样本的第二洗剂3次。

13、在本发明较优选的实施例中，第二洗剂是由尿素、蔗糖、三乙醇胺(triethanolamine)以及双蒸水(double distilled water，ddh2o)所组成，1/2第二洗剂是由第二洗剂和pbs缓冲液按照1:1的体积比例配制而成。

14、在本发明较优选的实施例中，在进行所述成像步骤之前，将样本浸入成像液中静置匹配折光率，用以成像。

15、在本发明较优选的实施例中，成像液是由硅油和矿物油以1:1的体积比例配制而成。

16、在本发明较优选的实施例中，成像步骤包括：通过显微镜对成像液浸泡的样本进行三维透明化成像，以产生对应样本的三维图像。

17、本发明还另外披露一种糖尿病肾病预测模型的试剂盒，试剂盒包括清洗样本的第一洗剂及第二洗剂以及对所述样本进行免疫荧光标记的一级抗体及二级抗体，试剂盒用以处理样本，通过imaris软件计数在样本中于成像后的目标物数量，以判断糖尿病肾病预测模型是否建构成功。

18、在本发明较优选的实施例中，第一洗剂是由尿素、四羟丙基乙二胺、曲拉通x-100(triton x-100)及双蒸水(double distilled water，ddh2o)组成，1/2第一洗剂由第一洗剂和双蒸水配制而成。

19、在本发明较优选的实施例中，第二洗剂是由尿素、蔗糖、三乙醇胺(triethanolamine)及双蒸水(double distilled water，ddh2o)所组成，1/2第二洗剂是由第二洗剂和pbs缓冲液按照1:1的体积比例配制而成。

20、在本发明较优选的实施例中，一级抗体由足细胞核标记物wt-1抗体、足细胞浆标记物synaptopodin抗体与抗体稀释溶液配制而成，二级抗体由红色荧光耦合抗体、绿色荧光耦合抗体及抗体稀释溶液配制而成。

21、在本发明较优选的实施例中，一级抗体稀释溶液及二级抗体稀释溶液是由曲拉通x-100(triton x-100)、牛血清蛋白(bovine serum albumin)及含有叠氮化钠溶液(sodiumazide solution)的pbs缓冲液配制而成。

22、在本发明较优选的实施例中，试剂盒还包括缓冲液及成像液，缓冲液是用以清洗样本及成像液是用以将样本进行显微镜成像。

23、在本发明较优选的实施例中，缓冲液是pbs(phosphate buffered saline)。

24、在本发明较优选的实施例中，成像液是由硅油和矿物油以1:1的体积比例配制而成。