PYCR1siRNA在增强肺癌细胞对TRAIL敏感性中的应用及方法

本发明属于生物医药研究，具体涉及pycr1 sirna在增强肺癌细胞对trail敏感性中的应用及方法。

背景技术：

1、吡咯啉-5-羧酸还原酶1(pyrroline-5-carboxylate reductase 1，pycr1)位于染色体17q2.3，含319个氨基酸，编码33.4kda的蛋白。pycr1是参与脯氨酸合成的关键酶，可以nad(p)h为辅助因子催化5-吡咯啉羧酸还原为脯氨酸。研究发现79％的癌症中pycr1基因的表达量增加，发挥着癌基因的作用，pycr1基因表达量的增高可促进肿瘤细胞增殖，抑制细胞凋亡。研究表明，pycr1在肺腺癌组织中表达明显增高，并与病理分级相关；非小细胞肺癌患者中pycr1基因呈现高表达，高表达pycr1基因与整体生存不良以及较高的tnm分期有关并介导了顺铂的耐药；将pycr1 sirna转染至肺癌细胞系a549，nci-h1299中构建pycr1表达下调的肺癌细胞系，发现当pycr1表达抑制后，细胞的自噬过程可能增强(杨兴玲，pycr1在肺癌中的表达与预后价值分子及其生物学功能研究，海军军医大学，2021)。

2、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tnf related apoptosis inducing ligand，trail)是tnf家族的成员之一。研究发现其受体分为两类：一类是死亡受体(deathreceptor，dr)，如dr4和dr5；另一类是“引诱”受体，如dcr1和dcr2。死亡受体可以诱导细胞凋亡，“引诱”受体存在于正常细胞中保护细胞不受trail诱导的凋亡作用。体外实验表明，trail对hela宫颈癌细胞、u973、a549肺癌细胞、人肝癌细胞7402和7721等肿瘤细胞呈特异性的杀伤作用，这种杀伤作用呈时间和计量依赖性，且不造成机体的广泛损伤。但是trail诱导肿瘤细胞的凋亡取决于肿瘤细胞表面dr的表达强度，因此如何上调dr的表达强度，增加肿瘤细胞对trail的敏感度，已经成为了肿瘤治疗过程中的关键问题。同时利用trail蛋白作为抗肿瘤药物还存在一个很实际的缺陷，即大剂量的trail蛋白才能抑制肿瘤细胞在体内的增殖，使治疗成本高，因此增强肿瘤细胞对trail的敏感性，具有十分重要的现实意义。

3、中国专利cn102821778b公开了含有tip41表达或活性抑制剂作为靶基因或trail敏化剂的用于增强trail敏感性的组合物，其发现用tip41 sirna和trail处理对trail耐药的肝癌细胞后，有诱导癌细胞特异性细胞凋亡的作用。中国专利cn115161394a公开了tp53inp2在增强急性髓系白血病细胞对trail敏感性方面的应用。中国专利cn105194671b公开了cabyr-a/b在促进肿瘤细胞对vp16和trail的敏感性中的应用。但目前尚未发现pycr1基因能否增强肺癌细胞对trail敏感性的相关应用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供pycr1 sirna在增强肺癌细胞对trail敏感性中的应用及方法，为制备治疗肺癌的药物提供参考。

2、为实现上述目的，本发明提供了pycr1表达或活性抑制剂在以下a-c至少一种中的应用：

3、a：制备用于促进癌症细胞对trail敏感性的药物；

4、b：制备用于协同trail治疗癌症的药物；

5、c：制备用于增强trail诱导所导致癌症细胞凋亡的药物。

6、优选的，pycr1表达或活性抑制剂为sirna，sirna的序列为seq id no:3和seq idno:4。

7、优选的，癌症细胞为肺癌nci-h1299细胞，所述癌症为肺癌。

8、本发明还提供pycr1表达或活性抑制剂增强trail敏感性的方法，包括如下步骤：

9、(1)根据人pycr1基因序列，设计、合成sirna；

10、(2)将sirna转染至癌症细胞中，培养得到转染细胞；

11、(3)收集转染细胞，并加入trail处理，培养并检测癌症细胞的凋亡情况和表达情况。

12、优选的，步骤(1)所述的sirna的序列为seq id no:3和seq id no:4。

13、优选的，步骤(2)所述的癌症细胞为肺癌nci-h1299细胞，转染前将细胞培养至对数生长期，转染时细胞密度为60％-70％。

14、优选的，步骤(2)所述的sirna浓度为50-100nm，转染时间为48h；进一步优选的，sirna的浓度为50nm。

15、优选的，步骤(3)所述的trail的处理浓度为50-200ng/ml，trail处理的时间为48h；进一步优选的，trail的处理浓度为50ng/ml。

16、优选的，步骤(2)和(3)所述的培养条件为5％co2，37℃湿化孵箱。

17、本发明获得的有益效果为设计并获得了pycr1表达或活性抑制剂sirna1，其可以抑制肺癌nci-h1299细胞中pycr1 mrna及蛋白的表达，mrna的抑制率可以达到95％，并抑制nci-h1299细胞的活力，抑制其增殖。同时本发明还发现pycr1的sirna1可以增强肺癌nci-h1299细胞对trail的敏感性，sirna1转染肺癌nci-h1299细胞后再用trail处理，可以使细胞活力在400-800ng/ml的trail显著下降，显著提高了敏感性；并且联合使用sirna1和50ng/ml的trail时，肺癌nci-h1299细胞的凋亡率上升，凋亡相关蛋白的表达被激活，细胞膜上的死亡受体dr4和dr5的表达水平显著上升，表明sirna1转染后，肺癌细胞对trail敏感性显著增强。因此可以利用sirna1制备促进肺癌细胞对trail敏感性的药物或协同trail治疗肺癌的药物；此外还可以用于制备增强trail诱导肺癌细胞凋亡的药物，对肺癌细胞的治疗具有重要的指导意义。同时pycr1在79％的癌症中均存在表达量增加的情况，因此本发明也可以指导其他癌症治疗药物的开发。

技术特征：

1.pycr1表达或活性抑制剂在以下a-c至少一种中的应用：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述pycr1表达或活性抑制剂为sirna，sirna的序列为seq id no:3和seq id no:4。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌症细胞为肺癌nci-h1299细胞，所述癌症为肺癌。

4.pycr1 表达或活性抑制剂增强trail敏感性的方法，其特征在于：包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的pycr1 表达或活性抑制剂增强trail敏感性的方法，其特征在于：步骤（1）所述的sirna的序列为seq id no:3和seq id no:4。

6.根据权利要求4所述的pycr1 表达或活性抑制剂增强trail敏感性的方法，其特征在于：步骤（2）所述的癌症细胞为肺癌nci-h1299细胞，转染前将细胞培养至对数生长期，转染时细胞密度为60%-70%。

7.根据权利要求4所述的pycr1 表达或活性抑制剂增强trail敏感性的方法，其特征在于：步骤（2）所述的sirna浓度为50-100nm，转染时间为48h。

8.根据权利要求4所述的pycr1 表达或活性抑制剂增强trail敏感性的方法，其特征在于：步骤（3）所述的trail的处理浓度为50-200 ng/ml，trail处理的时间为48h。

9.根据权利要求4所述的pycr1 表达或活性抑制剂增强trail敏感性的方法，其特征在于：步骤（2）和（3）所述的培养条件为5%co2，37℃湿化孵箱。

技术总结
本发明公开了PYCR1 siRNA在增强肺癌细胞对TRAIL敏感性中的应用及方法，采用RNAi技术，显著抑制了PYCR1基因的表达量，并获得了抑制效果最佳的PYCR1 siRNA1，通过将PYCR1 siRNA1转染至肺癌细胞NCI‑H1299中，分析发现肺癌细胞对TRAIL的敏感性由400ng/mL降低至50ng/mL，敏感性显著提高，建立了一种能够显著增强TRAIL治疗肺癌患者的策略和方法。通过联合使用PYCR1 siRNA和TRAIL，可以提高TRAIL的疗效，降低计量依赖性，同时对于TRAIL相对不敏感的患者也可以起到良好的效果，从而扩大了TRAIL治疗在肺癌患者的临床应用。

技术研发人员：尤程程,黄益玲,黄利鸣,胡火军,鲁华,向珺昱,夏玉桦,黄紫弦,王霖,张小玲
受保护的技术使用者：三峡大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14