使用基因疗法以推迟疾病发生和发展同时提供认知保护来治疗神经变性疾病的方法

背景技术：

1、基因转移现已被广泛接受为在细胞和分子水平下分析生物事件和疾病过程的有力手段。近年来，基因疗法在治疗遗传性(例如，ada缺乏症)或获得性(例如，癌症或感染性疾病)人类疾病中的应用已受到广泛关注。

2、传统上，将基因疗法定义为治疗性基因被导入哺乳动物细胞中以纠正先天性基因错误的方法。虽然超过4500种人类疾病目前被分类为遗传性的，但这些疾病中仅有相对较少数已鉴别出人类基因组中的特定突变。直到最近，这些罕见的遗传性疾病才显现出基因疗法研究的排他靶标。因此，迄今为止，大多数nih批准的基因疗法方案是涉及将缺陷基因的功能性拷贝导入具有已知的先天性基因错误的个体的体细胞中。直到近年来，研究人员和临床医师才开始认识到，大部分人类癌症、某些形式的心血管疾病及许多变性疾病也具有重要的遗传成分，并且出于设计新型基因疗法的目的，应被视为“遗传性病症”。因此，基因疗法近年来在广义上被定义为经由向患病生物体中导入新的遗传信息而对疾病表型的纠正。

3、在体内基因疗法中，转移基因被原位导入受体生物体的细胞中，原位即在受体内。在若干动物模型中考察体内基因疗法。若干最新出版物报道了直接基因原位转移到器官和组织如肌肉、造血干细胞、动脉壁、神经系统及肺中的可行性。还报道了dna直接注射到骨骼肌、心肌中及dna-脂质复合体注射到血管系统中产生表达水平可检测的体内插入的基因产物。

4、中枢神经系统疾病(例如脑遗传性疾病)的治疗仍是一个难处理的问题。其实例为溶酶体贮积病和阿尔茨海默氏病。总体上，溶酶体贮积病(lsd)的发病率在全世界10,000个新生儿中有1例，并且在65％的病例中，存在明显的中枢神经系统(cns)参与。这些病症中缺乏的蛋白质当静脉内递送时不能通过血脑屏障，或当直接递送到脑中时，不能广泛分布。因此，需要开发用于cns缺陷的疗法。

技术实现思路

1、本发明提供治疗患有溶酶体贮积病(lsd)的哺乳动物的方法。在一个实施方案中，方法包括：

2、(a)向哺乳动物的脑或脊柱施用多个aav颗粒，所述aav颗粒(i)包含aav衣壳蛋白和插在一对aav反向末端重复(itr)之间的核酸，所述核酸编码具有溶酶体水解酶活性的多肽，及(ii)能够转导所述哺乳动物的细胞并提供所述多肽的表达；以及

3、(b)向所述哺乳动物施用第一免疫抑制剂和第二免疫抑制剂。在一个具体方面，在施用aav颗粒之前，向哺乳动物施用第一免疫抑制剂和第二免疫抑制剂。

4、在具体实施方案中，所述多肽具有三肽基-肽酶1(tpp1)活性。在具体方面，所述多肽包括tpp1、其酶原或其酶促活性变体。

5、在进一步具体的实施方案中，第一免疫抑制剂是在施用aav颗粒之前施用，且第二免疫抑制剂是在施用所述aav颗粒之前、与之同时或之后施用。

6、在具体方面，在施用所述aav颗粒之前至少约两周施用所述第一免疫抑制剂，且在施用所述aav颗粒之前约两周或之后40天内施用所述第二免疫抑制剂。

7、在具体方面，第一免疫抑制剂包括环孢菌素。在具体方面，第二免疫抑制剂包括麦考酚酯或其衍生物(例如，吗替麦考酚酯(mmf))。

8、在某些实施方案中，第一免疫抑制剂(例如，环孢菌素)是以约5-20mg/kg的剂量每天施用两次持续至少3个月。

9、在某些实施方案中，第一免疫抑制剂(例如，环孢菌素)的剂量在施用aav颗粒之后1-2个月是减少的。

10、在某些实施方案中，第二免疫抑制剂(例如麦考酚酯或其衍生物)是以每天约5-20mg/kg的剂量施用。

11、在另外的具体实施方案中，在哺乳动物的脑脊液中的三肽基-肽酶1(tpp1)活性在至少5pmol tpp1/mg蛋白质的水平下可检测持续超过350天。

12、在另外的实施方案中，由所述aav颗粒转导构成哺乳动物的脑脊液(csf)的细胞(例如室管膜细胞)。在具体方面，用aav颗粒转导的细胞(例如，室管膜细胞)表达并分泌多肽到所述哺乳动物的csf中。

13、在进一步的实施方案中，aav颗粒的施用包括向所述哺乳动物的小脑延髓池、脑室内空间、脑室、蛛网膜下腔、鞘内空间和/或室管膜的施用。

14、在更进一步实施方案中，aav颗粒的施用包括向所述哺乳动物的脑脊液(csf)的施用。

15、在仍另外的实施方案中，aav颗粒的施用包括将所述哺乳动物的室管膜细胞与aav颗粒接触。

16、在某些方面，aav颗粒的施用包括将所述哺乳动物的软膜细胞、内皮细胞或脑膜细胞与所述aav颗粒接触。

17、在某些实施方案中，aav颗粒的施用包括将aav颗粒注射到所述哺乳动物的脑或脊髓的组织或体液中。

18、在某些实施方案中，aav颗粒的施用包括将aav颗粒注射到所述哺乳动物的脑脊液中。

19、在某些实施方案中，哺乳动物为非啮齿类哺乳动物。在具体方面，非啮齿类哺乳动物为灵长类动物、马、绵羊、山羊、猪或狗。在具体方面，非啮齿类哺乳动物为人类(例如儿童，例如，约1至约4岁)。

20、在某些实施方案中，所述lsd为婴儿或婴儿晚期蜡样脂褐质沉积症(lincl)、神经元病性戈谢病、少年型巴藤病(juvenile batten)、法布里病(fabry)、mld、圣菲利波症(sanfilippo)a型、亨特病(hunter)、克腊比病(krabbe)、莫尔基奥氏病(morquio)、庞佩氏病(pompe)、尼曼-匹克病(niemann-pick)c型、泰-萨病(tay-sachs)、贺勒氏症(hurler)(mps-i h)、圣菲利波症b型、马-拉病(maroteaux-lamy)、尼曼-匹克病a型、胱氨酸贮积症、贺勒-施艾氏症(hurler-scheie)(mps-ih/s)、斯赖综合征(sly syndrome)(mps vii)、施艾氏症(scheie)(mps-is)、婴儿巴藤病(infantile batten)、gm1神经节苷脂沉积症、粘脂病ii型/iii型或桑霍夫氏病(sandhoff disease)。

21、在具体实施方案中，与lsd有关的症状被推迟、减少、减轻或改善。在某些方面，症状是以下一种或多种：本体感受反应、眼球震颤、胁迫、瞳孔对光反射、小脑共济失调及意向性震颤。

22、在具体实施方案中，与在不先前施用第一免疫抑制剂的情况下施用第二免疫抑制剂相比，与lsd有关的症状的发作在例如施用第一免疫抑制剂和第二免疫抑制剂时推迟了5-10、10-25、25-50或50-100天。

23、在具体实施方案中，与在不先前施用第一免疫抑制剂的情况下施用第二免疫抑制剂相比，与lsd有关的认知功能损失的发作在施用第一免疫抑制剂和第二免疫抑制剂时推迟了5-10、10-25、25-50或50-100天。

24、在某些实施方案中，与在不先前施用第一免疫抑制剂的情况下施用第二免疫抑制剂相比，患有lsd的哺乳动物的寿命在施用第一免疫抑制剂和第二免疫抑制剂时延长了例如5-10、10-25、25-50或50-100天。

25、在某些实施方案中，aav颗粒是以约1×108至约1×1015vg/kg的剂量施用。

26、在某些实施方案中，在施用aav颗粒之后至少30、60、90、120或更多天都未在哺乳动物的csf中检测到中和抗体(例如，针对具有溶酶体水解酶活性的aav载体颗粒或多肽)。在具体方面，在施用所述aav颗粒之后至少250天未在所述哺乳动物的csf中检测到中和抗体(例如，针对具有溶酶体水解酶活性的aav载体颗粒或多肽)。

27、在某些实施方案中，多肽是在所述哺乳动物的脾脏或心脏中表达。

28、在某些实施方案中，多肽是在所述哺乳动物的小脑中表达。

29、在某些实施方案中，aav颗粒为aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav-rh74、aav-rh10及aav-2i8颗粒。

30、在某些实施方案中，aav itr中的一个或多个为aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav-rh74、aav-rh10及aav-2i8 itr。

31、本发明还提供aav载体和aav载体颗粒。在一个实施方案中，aav载体包含aav itr序列、编码具有溶酶体水解酶活性(例如tpp1)的多肽的核酸、及表达控制元件，所述表达控制元件驱动编码具有溶酶体水解酶活性(例如tpp1)的多肽的核酸的表达。

32、在一个实施方案中，aav颗粒包括本文所述的aav载体。

33、在某些实施方案中，aav载体或aav颗粒包含aav itr序列，如一个或多个aav2itr。

34、在某些实施方案中，aav载体或aav具有编码哺乳动物tpp1的核酸。在某些方面，所述核酸编码人tpp1。在某些方面，所述核酸编码与seq id no：5中所示的人tpp1具有80％或更多同一性的蛋白质。在某些方面，所述核酸编码如seq id no：5中所示的人tpp1。

35、在某些实施方案中，表达控制元件包括cmv增强子。

36、在某些实施方案中，表达控制元件包括β肌动蛋白启动子。在具体方面，表达控制元件包括鸡β肌动蛋白启动子。

37、在某些实施方案中，表达控制元件包括cmv增强子和鸡β肌动蛋白启动子。

38、在某些实施方案中，表达控制元件包括与seq id no：9具有80％或更多同一性的序列。在具体方面，表达控制元件包括seq id no：9。

39、在某些实施方案中，aav颗粒具有衣壳序列，所述衣壳序列包含与以下序列具有90％或更多同一性的vp1、vp2和/或vp3衣壳序列：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、rh10、rh74或aav-2i8 vp1、vp2和/或vp3序列。

40、在某些实施方案中，aav颗粒具有vp1衣壳序列，所述衣壳序列与aav2 vp1衣壳序列具有80％或更多同一性或与aav2具有80％或更多同一性，其中所述衣壳序列在位置444、500和/或730处具有被不是酪氨酸的氨基酸取代的酪氨酸。在具体方面，衣壳序列与aav2vp1衣壳序列具有80％或更多同一性，其中所述衣壳序列在位置444、500和/或730处具有被苯丙氨酸取代的酪氨酸。在更具体的方面，衣壳序列包含aav2 vp1衣壳序列，其中在位置444、500和/或730处的酪氨酸已被苯丙氨酸取代。

41、在某些实施方案中，aav颗粒具有选自以下中的任一个的vp2或vp3衣壳序列：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、rh10、rh74或aav-2i8aav血清型。