一种芝麻叶外泌体纳米颗粒及其制备方法和在活性成分递送中的应用

本发明属于纳米材料及其制备，具体涉及一种芝麻叶外泌体纳米颗粒及其制备方法和在活性成分递送中的应用。

背景技术：

1、植物来源的天然活性成分，如姜黄素、白藜芦醇、木犀草素等具有抗氧化、抗炎、抗肥胖等生物活性。但由于其强疏水性，化学稳定性差，代谢快，导致其生物利用度低，开发利用受到限制。纳米技术已被应用于提高活性成分的稳定性和生理活性。植物外泌体是具有脂质双层膜的直径约30～150nm的生物纳米结构，其天生富含具有生物活性的蛋白质、脂质、rna和其他药理活性分子，可以调节受体细胞中的基因和蛋白质表达水平，从而介导多细胞生物的生理及病理功能。同时也可递送化学药物、蛋白质及多肽、基因药物、天然分子等多种活性成分，具有高生物相容性、高耐受性、可生物降解性等特性，被认为是一种理想的药食同源的天然递送载体。

2、芝麻属于胡麻科胡麻属的一年生草本植物，是世界上最重要的油料作物之一。世界芝麻的种植面积在700万～800万hm2，年产量为450万t左右。我国芝麻的种植面积约为70万hm2，年产量在60万～65万t。芝麻种子主要用于榨油，而芝麻叶作为芝麻生产中的副产物，含有丰富的蛋白质、脂肪、矿物质、多糖、多酚、黄酮等物质，具有抗炎、抗氧化、抗肥胖、缓解糖尿病、预防心血管疾病等健康功效，但目前利用率不高，多数被丢弃而造成极大的资源浪费。本发明制备芝麻叶外泌体及开发相关递送载体，不仅能发挥芝麻叶自身的生理活性，还能改善所负载活性成分的生理活性。相对于动物外泌体来说，植物外泌体应用领域更广泛，可用于食品、医药、日用品中，并且芝麻叶外泌体为植物副产物的利用，资源丰富且易得。

3、现有植物外泌体制备方法主要包括超速离心法、密度梯度离心法、聚合物沉淀法、超滤法、尺寸排阻色谱、免疫亲和层析法。超速离心法一般耗时长，通常大于5h，且需要使用昂贵的分离设备(如cn110964694a)。聚合物沉淀法和超滤法获得的外泌体纯度较低，其中聚合物沉淀法还往往需要添加额外化学试剂(如cn112574940a，cn114015640a)。尺寸排阻色谱法具有操作简单、重现性好及纯度高等优点，但是获得的外泌体浓度较低，使得外泌体的应用受到限制(如cn114591892a)。免疫亲和层析法分离的外泌体虽然特异性及纯度高，外泌体形态完整，但亲和层析介质昂贵，纯度成本较高(如cn105934670b)。鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明结合超滤法与尺寸排阻色谱法，在提高外泌体纯度的基础上提高其物质含量，该方法简单，易于控制，可高质量、高得率地获得芝麻叶外泌体，具有良好的负载功能，可用于食品、日化用品和药品等领域。

技术实现思路

1、发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种芝麻叶外泌体纳米颗粒及其高纯度制备方法和应用。

2、本发明还要解决的技术问题是提供了一种负载活性成分的外泌体纳米颗粒及其制备方法和应用，将芝麻叶外泌体纳米颗粒作为具有抗炎作用的活性成分的递送载体，实现了副产物资源利用，提高活性成分的生理活性。

3、技术方案：为实现上述技术目的，本发明提供了一种芝麻叶外泌体纳米颗粒，所述芝麻叶外泌体纳米颗粒是通过将芝麻叶匀浆后差速离心，再超滤获得芝麻叶外泌体的上清浓缩液，然后将获得的上清浓缩液通过超纯色谱柱进行外泌体的纯化，随后采用超滤管对获得的外泌体进行进一步浓缩，即得。

4、其中，所述芝麻叶外泌体纳米颗粒粒径为50-60nm。

5、本
技术实现要素：
还包括一种负载活性成分的外泌体纳米颗粒，所述负载活性成分的外泌体纳米颗粒是在所述的芝麻叶外泌体纳米颗粒中负载活性成分即得。

6、其中，所述活性成分为具有生理活性相关物质。

7、其中，作为优选地，所述活性成分为天然黄酮木犀草素(lu)。

8、本发明内容还包括所述的芝麻叶外泌体纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

9、(1)取芝麻叶，冲洗表面污渍，超纯水润洗后，加入pbs溶液浸泡匀浆，离心，收集上清液；

10、(2)取步骤(1)的上清液离心，收集上清液；

11、(3)取步骤(2)的上清液超滤取滤液，获得芝麻叶外泌体的浓缩液；

12、(4)用超纯色谱柱将浓缩液进行纯化处理，将浓缩液加入到超纯色谱柱中，待所有样品进入色谱柱后，每次加入柱床体积1/12的pbs溶液进行洗脱并收集馏分(即洗脱液)，待出口无液体流出时，该馏分收集完毕，第一次洗脱得到的馏分称为第1馏分，后续洗脱依次得到第2、3、4、5……馏分。合并第2-5馏分，再用超滤管浓缩，根据粒径和形貌分析，结合蛋白分子量和脂质组成判断，其即为外泌体，通过bca蛋白定量，蛋白含量可达500μg/ml-3mg/ml。

13、其中，步骤(1)的所述pbs溶液的ph为7.0，浓度为0.01mol/l，所述芝麻叶与pbs溶液的质量体积比为1g：2ml。

14、其中，步骤(1)中的离心力为1000g，步骤(2)中的离心力为10000g。

15、本发明内容还包括所述的负载活性成分外泌体纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：将活性成分溶解于乙醇中得到活性成分溶液，将芝麻叶外泌体纳米颗粒与活性成分溶液混合，超声制备得到负载活性成分的外泌体纳米颗粒。

16、其中，所述活性成分与芝麻叶外泌体的蛋白的质量比为2：1。

17、本发明内容还包括所述的芝麻叶外泌体纳米颗粒、所述的负载活性成分的外泌体纳米颗粒在活性成分递送或制备治疗抗炎疾病的药物方面的应用。

18、与现有技术相比，本发明的优点和有益效果如下：

19、本发明选用芝麻叶来源的外泌体作为载体，是对副产物的资源合理化利用，将天然活性成分lu通过超声辅助装入其中，得到高负载量的外泌体。与脂质体等人工合成的纳米颗粒相比，本发明利用芝麻叶来源外泌体作为活性成分载体，具有材料易得、成本低廉，高生物相容性，高负载率、应用领域广泛、操作简便，易于应用的优势。同时，本发明确定了芝麻叶外泌体的负载潜力，研究了负载木犀草素外泌体纳米颗粒的稳定性，体外释放特性和生物利用度，以及体外抗炎活性，显示了用外泌体负载活性成分优势，为芝麻叶外泌体递送体系研究提供基础。

技术特征：

1.一种芝麻叶外泌体纳米颗粒，其特征在于，所述芝麻叶外泌体纳米颗粒是通过将芝麻叶匀浆后差速离心，再超滤获得芝麻叶外泌体的上清浓缩液，然后将获得的上清浓缩液通过超纯色谱柱进行外泌体的纯化，随后采用超滤管对获得的外泌体进行进一步浓缩，即得。

2.根据权利要求1所述的芝麻叶外泌体纳米颗粒，其特征在于，所述芝麻叶外泌体纳米颗粒的粒径为50-60 nm。

3.一种负载活性成分的外泌体纳米颗粒，其特征在于，所述负载活性成分的外泌体纳米颗粒是在权利要求1所述的芝麻叶外泌体纳米颗粒中负载活性成分获得。

4.根据权利要求3所述的负载活性成分的外泌体纳米颗粒，其特征在于，所述活性成分为具有生理活性相关物质。

5.根据权利要求3所述的负载活性成分的外泌体纳米颗粒，其特征在于，所述活性成分为天然黄酮木犀草素。

6.权利要求1或2所述的芝麻叶外泌体纳米颗粒的制备方法，其特征在于， 包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）的所述pbs溶液的ph为7.0，浓度为0.01 mol/l，所述芝麻叶与pbs溶液的质量体积比为1 g：2 ml；离心力为1000 g；步骤（2）中的离心力为10000 g。

8.根据权利要求3~5任一项所述的负载活性成分的外泌体纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将活性成分溶解于乙醇中得到活性成分溶液，将芝麻叶外泌体纳米颗粒与活性成分溶液混合，超声制备得到负载活性成分的外泌体纳米颗粒。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述活性成分与芝麻叶外泌体的蛋白的质量比为2：1。

10.权利要求1或2所述的芝麻叶外泌体纳米颗粒、权利要求3~5任一项所述的负载活性成分的外泌体纳米颗粒在活性成分递送或制备抗炎药物方面的应用。

技术总结
本发明属于纳米材料及其制备技术领域，具体公开了一种芝麻叶外泌体纳米颗粒及其制备方法和在活性成分递送中的应用。所述外泌体纳米颗粒制备方法包括：将芝麻叶匀浆后差速离心，再超滤获得芝麻叶外泌体的上清浓缩液，然后将获得的上清浓缩液通过超纯色谱柱进行外泌体的纯化，随后采用超滤管对获得的外泌体进行进一步浓缩，即得。本发明制备方法具有提取步骤少、提取效率高、条件温和、所得产品纯度高等优点。该外泌体纳米颗粒通过超声辅助技术能够实现天然活性成分的高负载，减缓被负载活性成分的释放速度，提高活性成分的光稳定性和生物利用度，增强活性成分的抗炎能力，且生物相容性好、毒性低。

技术研发人员：向霞,江丹,郑明明,刘红艳,邓乾春,黄凤洪,夏晓洋
受保护的技术使用者：中国农业科学院油料作物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15