一种白及提取物的制备方法及其产品和应用与流程

1.本发明属于植物提取技术领域，涉及一种白及提取物的制备方法及其产品和应用，具体涉及一种具有优异皮肤保湿和修复作用的白及提取物的制备方法及其产品和应用。


背景技术：

2.皮肤是人体最大的器官，在生物体和环境之间提供了一个有效的屏障，保护我们免受有害环境的影响，也保护我们免受不受控制的水分流失。形成皮肤屏障的角质形成细胞是表皮中主要的细胞类型，约占表皮细胞的90%，角质形成细胞通过经历高度复杂的分化过程形成皮肤屏障，该过程涉及改变其形态和结构的完整性，这一过程称为角化，而表皮角化过程的改变影响着皮肤屏障的形成，并导致皮肤屏障紊乱，免疫反应进入皮肤组织，将促进炎症的发生发展。皮肤屏障受损导致的相关性皮肤疾病包括：特应性皮炎、慢性光化性皮炎、银屑病、黄褐斑、痤疮、皮肤鳞状细胞癌等，因此需重视皮肤屏障的保护与修复。
3.水通道蛋白-3 aqp3在角质形成细胞发挥功能的过程中起着关键作用，在皮肤的水合作用中起着重要作用，在维持皮肤水分和皮肤功能方面发挥重要作用，且能够促进人角质形成细胞的增殖和迁移，与皮肤屏障的生成与修复紧密关联。
4.白及bletilla striata来源于兰科白及属地生草本植物，2020年版《中国药典》记载，其具有收敛止血、消肿生肌之功。白及主要有促进伤口愈合、抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、止血等药理活性。其中白及多糖作为白及药材发挥药理作用的主要成分，具有促进溃疡创面愈合、抗菌、止血等功效。
5.目前针对白及多糖的提取方法，传统提取法包括加热回流提取法、浸提法、煎煮法，其它提取方法，包括超声提取法、微波提取法以及酶辅助提取法等。其中加热提取法温度高，多糖在持续高温的环境下，结构容易被破坏；超声波提取法是利用高频震荡、机械剪切效应等多种物理机制共同发挥作用，超声波对温度要求不高，但超声时间过久会使糖苷键断裂，影响多糖的提取效率；微波提取法提取效率高、加热均匀，但功率稍高会导致多糖糊化；酶辅助提取法反应条件温和、低耗能，但酶价格高、反应条件需控制严格，否则容易失活。cn113754791a采用酶解法进行白及多糖物质的提取，提取条件严格，酶活性不易控制，工艺复杂不便于工业化生产，且该制备方法中采用sevage试剂，该试剂包含正丁醇及氯仿，该有机试剂毒性大，在环保及安全问题存在很大隐患。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种白及提取物的制备方法及其产品和应用，具体提供一种具有优异皮肤保湿和修复作用的白及提取物的制备方法及其产品和应用。
7.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种白及提取物的制备方法，所述白及提取物的制备方法
包括如下步骤：
9.（1）将白及原料与水混合后进行超高压处理，再将处理后的白及进行真空减压回流提取处理，得到提取液；
10.（2）将提取液进行滤布过滤和减压抽滤，得到滤过液；
11.（3）将滤过液进行冷冻干燥，即得所述白及提取物。
12.本发明所涉及的白及提取物的制备方法创造性地采用超高压前处理协同真空减压回流提取处理对白及原料进行水提，一方面能使制得的水提物中多糖含量处于高水平，具有更优异保湿、激活皮肤细胞、增强皮肤免疫、促进胶原蛋白生成、加快皮肤修复功效的基础；另一方面，其与其他提取工艺（即使提取物多糖水平相当）相比，能够最大程度地确保提取物在上述功效上持久稳定地发挥，具有更加优异的促进表皮细胞中水通道蛋白-3表达的功效，具有更加优异的促进表皮修复的功效，因此该制备方法制得的提取物可广泛地应用于保湿或修复功效类化妆品。且该制备方法全程的温度较低，全程不采用有机试剂，制备方法简单、环保、适用于工业化生产。
13.优选地，所述白及原料为白及饮片，所述白及饮片与水的料液比为1:(10-20) g/ml，例如1:10 g/ml、1:12 g/ml、1:14 g/ml、1:15 g/ml、1:16 g/ml、1:18 g/ml、1:20 g/ml等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
14.所述白及饮片与水的料液比特定地选择为1:(10-20) g/ml是因为若料液比进一步增加，提取物中多糖含量不会有明显提升，若料液比进一步降低，提取物中多糖含量会有明显的下降趋势。
15.在本发明中，优选采用白及饮片（干燥的白及块茎切片）作为提取原料，是因为白及饮片能够避免采用白及粉末作为提取原料进行提取所带来的提取液黏性大、固液分离困难的问题，且能在保证制备工艺简单可行的前提下，能够最大程度地保证白及药材的利用率。
16.优选地，所述超高压处理的压力为200-350 mpa，例如200 mpa、220 mpa、240 mpa、250 mpa、280 mpa、300 mpa、350 mpa等；保压时间为4-8 min，例如4 min、5 min、6 min、7 min、8 min等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
17.当超高压处理选择上述特定的工艺参数时，其制得的白及提取物中具有更高含量的多糖成分，且能更大程度地保证多糖的有效性。
18.优选地，所述真空减压回流提取处理的真空度为0.04-0.08 mpa，例如0.04 mpa、0.05 mpa、0.06 mpa、0.07 mpa、0.08 mpa等；加热温度为45-65℃，例如45℃、47℃、50℃、52℃、55℃、60℃、65℃等；提取时间为30-60 min，例如30 min、35 min、40 min、45 min、50 min、60 min等；提取的次数为1-4次，例如1次、2次、3次、4次。上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
19.当真空减压回流提取处理选择上述特定的工艺参数时，其制得的白及提取物中具有更高含量的多糖成分，且能更大程度地保证多糖的有效性。
20.优选地，所述滤布过滤使用的滤布孔径为150-250目，例如150目、170目、180目、200目、220目、240目、250目等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
21.所述减压抽滤使用助滤剂，所述助滤剂包括硅藻土和/或活性炭，所述助滤剂的用
量为提取液质量的0.1-1%，例如0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
22.所述减压抽滤使用的助滤剂更优选使用硅藻土和活性炭的组合，使得滤液的质量更高，获得的提取物具有更优异的保湿和修复功效。
23.第二方面，本发明提供根据第一方面所述的制备方法制备得到的白及提取物。
24.第三方面，本发明提供根据第二方面所述的白及提取物在制备具有皮肤保湿和/或皮肤修复作用的化妆品中的应用。
25.第四方面，本发明提供根据第二方面所述的白及提取物在制备水通道蛋白-3表达促进剂中的应用。
26.根据本发明的研究结果可知，由上述特定方法制得的白及提取物具有促进水通道蛋白-3表达的作用，因此，由上述特定方法制得的白及提取物用于制备水通道蛋白-3表达促进剂，在对水通道蛋白-3的生理作用机制系统理论研究中发挥作用。
27.第五方面，本发明提供一种促进表皮细胞中水通道蛋白-3表达的方法，所述方法包括：向表皮细胞给予有效量的第二方面所述的白及提取物。
28.根据本发明的研究结果可知，由上述特定方法制得的白及提取物具有促进水通道蛋白-3表达的作用，因此，本发明还开发了一种促进表皮细胞中水通道蛋白-3表达的方法，即向表皮细胞提供有效量的白及提取物，用于科学研究。
29.第六方面，本发明提供一种促进表皮细胞划痕愈合的方法，所述方法包括：向表皮细胞给予有效量的第二方面所述的白及提取物。
30.根据本发明的研究结果可知，由上述特定方法制得的白及提取物具有促进表皮细胞划痕愈合的作用，因此，本发明还开发了一种促进表皮细胞划痕愈合的方法，即向表皮细胞提供有效量的白及提取物，用于科学研究。
31.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
32.本发明所涉及的白及提取物的制备方法创造性地提出超高压技术前处理结合真空减压回流提取处理制备白及提取物，超高压技术对植物细胞壁进行有效破碎，使水充分进入细胞中，再采用真空减压回流提取使有效成分充分提取，一方面能使制得的水提物中多糖含量处于高水平，具有更优异保湿、激活皮肤细胞、增强皮肤免疫、促进胶原蛋白生成、加快皮肤修复功效的基础；另一方面，其与其他提取工艺（即使提取物多糖水平相当）相比，能够最大程度地确保提取物在上述功效上持久稳定地发挥，具有更加优异的促进表皮细胞中水通道蛋白-3表达的功效，具有更加优异的促进表皮修复的功效，因此该制备方法制得的提取物可广泛地应用于保湿或修复功效类化妆品。且该制备方法全程的温度较低，全程不采用有机试剂，提取条件温和，同时解决了实际生产中由于提取温度过高黏性物质易糊化等风险问题，制备方法简单、环保、适用于工业化生产。
附图说明
33.图1是水通道蛋白-3表达量免疫荧光检测图；
34.图2是细胞划痕修复试验显微镜视野图。
具体实施方式
35.为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
36.下述实施例所涉及的白及饮片采购于云南红河。
37.下述测试例所涉及的hacat细胞来源于中国科学院上海细胞库。
38.下述涉及的白及总多糖含量检测方法（硫酸苯酚法）步骤如下：
39.（1）标准溶液的配制：配制0.1mg/ml的葡萄糖标准溶液，依次吸取0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2ml于试管中，加入ddh2o于各试管补足2ml，待用。样品溶液的配制：准确称取样品粉末，加ddh2o配制成0.1mg/ml的样品溶液，待测。5%苯酚溶液的配制：准确称取2.5g苯酚固体粉末，加入47.5ml ddh2o于75℃进行溶解，避光保存。
40.（2）标准品溶液及样品溶液的反应：依次吸取配制好的标准品溶液及样品溶液1ml加入到试管中，加入0.5ml 5%苯酚溶液及2.5ml浓硫酸溶液进行反应，轻轻震荡，以ddh2o为空白对照，于490nm下用酶标仪测定其吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，为y=0.0049x+0.0018（r2=0.9984）。将样品溶液的吸光度代入标曲中，进行计算。
41.实施例1
42.本实施例提供一种白及提取物的制备方法：
43.（1）将白及饮片与水混合，进行超高压处理，压力为250 mpa，保压时间为5 min，料液比为1:15 g/ml；
44.（2）将处理后的混合液进行真空减压回流提取，提取条件为：真空度0.06 mpa，温度为50℃，提取时间为60 min，共提取2次；
45.（3）收集提取液，过200目滤布，加入0.5%助滤剂（质量比2:1的硅藻土和活性炭）进行减压抽滤；
46.（4）将滤液进行冷冻干燥，即得。
47.实施例2
48.本实施例提供一种白及提取物的制备方法：
49.（1）将白及饮片与水混合，进行超高压处理，压力为300 mpa，保压时间为4 min，料液比为1:18 g/ml；
50.（2）将处理后的混合液进行真空减压回流提取，提取条件为：真空度0.07 mpa，温度为45℃，提取时间为60 min，共提取2次；
51.（3）收集提取液，过200目滤布，加入0.5%助滤剂（质量比2:1的硅藻土和活性炭）进行减压抽滤；
52.（4）将滤液进行冷冻干燥，即得。
53.实施例3
54.本实施例提供一种白及提取物的制备方法：
55.（1）将白及饮片与水混合，进行超高压处理，压力为200 mpa，保压时间为6 min，料液比为1:12 g/ml；
56.（2）将处理后的混合液进行真空减压回流提取，提取条件为：真空度0.05 mpa，温度为60℃，提取时间为50 min，共提取2次；
57.（3）收集提取液，过200目滤布，加入0.5%助滤剂（质量比2:1的硅藻土和活性炭）进
min，提取温度为40℃，提取结束后于80℃下灭酶15 min；
85.（2）收集提取液，过200目滤布，加入0.5%助滤剂（质量比2:1的硅藻土和活性炭）进行减压抽滤；
86.（3）将滤液进行冷冻干燥，即得。
87.测试例1
88.对实施例1-7和对比例1-4制得的白及提取物进行总多糖含量的测定，结果如表1所示：
89.表1
[0090][0091]
由表1数据可知：本发明所涉及的白及提取物的制备方法采用超高压前处理结合真空减压回流提取处理，能使制得的提取物中多糖含量处于高水平，且超高压前处理的工艺参数、真空减压回流提取处理的工艺参数、料液比显著影响提取物中多糖含量的水平。
[0092]
测试例2
[0093]
对多糖水平接近的实施例1、实施例7、对比例2-4制得的白及提取物进行保湿及修复活性的测定：
[0094]
（1）保湿功效活性测定：
[0095]
水通道蛋白-3在维持皮肤水分和皮肤功能方面发挥重要作用，实验采用免疫荧光法进行测定白及提取物对水通道蛋白-3表达量的影响，将hacat细胞接种于24孔板中，实验设置正常对照组及不同组别得到的白及提取物给药组（120 μg/ml），于培养箱中（37℃，5%
co2）孵育12 h，待铺板率达到40%~60%时，进行分组给药，给药完成后于培养箱中孵育24 h，孵育结束后，用4%多聚甲醛固定细胞，24 h后，进行免疫荧光检测，采用荧光显微镜拍摄，结果如图1所示，并使用image-pro
ⓡ
plus图像处理软件进行分析。测试结果如表2所示：
[0096]
表2
[0097][0098]
由表2数据可知：与对比例采用的提取工艺相比，即使提取物中多糖含量的水平相当，但采用本发明特定提取工艺制得的白及提取物具有显著优异的促进水通道蛋白-3表达的功效。同时，超高压前处理的工艺参数显著影响对水通道蛋白-3表达的促进功效。
[0099]
（2）划痕修复活性的测定：
[0100]
将hacat细胞接种于12孔板中，于37℃，含5%co2培养箱中用维持培养基培养24h，于每孔培养板中放入插件造细胞划痕模型，于培养箱中培养24h，设置正常对照组（无血清的dmem培养基）和阳性对照组（表皮生长因子egf溶液浓度为10000 iu/ml），及受试物处理组（不同组别提取的白及提取物120 μg/ml）在显微镜下观察16小时、24小时及48小时划痕处的细胞生长状态，并分别拍照记录，如图2所示，并用imagej软件计算愈合面积。愈合率计算公式如下：愈合率=（初始划痕面积-待测时间划痕面积）/初始划痕面积。测试结果如表3所示：
[0101]
表3
[0102][0103]
由表3数据可知：与对比例采用的提取工艺相比，即使提取物中多糖含量的水平相当，但采用本发明特定提取工艺制得的白及提取物具有显著优异的促进表皮细胞愈合修复的功效。同时，超高压前处理的工艺参数显著影响上述功效。
[0104]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种白及提取物的制备方法及其产品和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0105]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0106]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。