非对称PCR反应中的PCR熔解曲线分析方法及其应用与流程

本公开涉及生物基因工程，尤其涉及一种非对称pcr反应中的pcr熔解曲线分析方法及其应用。

背景技术：

1、基因测序技术，是生物基因工程中常用的特异性产物分型测定方式。对于某种dna基因分型的测定，其是通过使用生物学试验检查个体的dna序列，将目标序列与另一个体的序列或参考序列进行比较来确定个体的遗传构成(基因型)差异的过程。

2、叶酸是机体所需要的重要营养素，为水溶性b族维生素，参与一系列涉及一碳单位(如甲基，甲烯基，甲酰基等)转运的重要生化反应，参加体内氨基酸，嘌呤，嘧啶的合成。叶酸代谢能力基因分型检测可评估叶酸利用能力，检测结果可为个体化增补叶酸、预防新生儿出生缺陷提供科学依据。

3、目前对人叶酸代谢能力基因分型的检测，常见的方法有直接测序法，基因芯片杂交法，pcr-taqman探针分型法，pcr-rflp法，pcr熔解曲线法。

4、现有的基因测序技术，主要有如下几类：

5、1、直接测序法，是snp位点分析的金标准，但该检测方法受到测序仪器的限制，测序仪器昂贵，推广困难。另外直接测序对模板量要求高，通常需要通过pcr扩增富集目的片段后，进行测序，操作复杂，周期长，且为开管操作，容易造成污染。

6、2、基因芯片杂交法，操作步骤烦琐，易出错，实验耗时4个小时以上，耗时较长。pcr结束后需开管操作，易造成污染的问题。此外，该检测方法用肉眼来对结果判读，准确性会受到影响，会出现假阳性、假阴性的结果判读。

7、3、pcr探针分型法，因其操作简单，分型准确，全程闭管操作，检测周期短等特点，是目前比较主流的snp分型方法。目前市面上已有通过cfda认证的成型检测试剂盒，如苏州旷远生物分子技术有限公司的“人mthfr基因多态性检测试剂盒(荧光pcr法)”，然而其产品检测需要两管反应液分别鉴定两个型别，使仪器的检测通量变小；反应液与酶还是分开两个试剂，使用时需要现配，增加了手工操作，容易出错。

8、4、pcr-rflp法将pcr与限制性酶切相结合的传统方法，由于酶切操作繁琐及污染风险已经很少在临床使用。

9、5、pcr熔解曲线法是在做实时荧光定量pcr分析时，用来确定不同反应产物，包括非特异性产物的分析方法。原理是在pcr扩增反应完成后，通过逐渐增加温度的同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线，随着反应中双链dna变性，荧光染料又恢复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图(-d—t)，得到pcr熔解曲线图(见说明书附图1所示)，在扩增产物的熔解温度上产生特征峰，所以用这个特征峰就可以将特异产物与其他的产物分开。这项技术主要优势在于可以利用不同荧光通道和不同荧光探针熔解峰温度的组合同时检测多个检测位点，从而大大节约了检测的时间与成本，与既往的taqman终点荧光法相比，不仅可以在一个荧光通道上检测多个位点，而且设计良好的探针可以通过熔解峰的变化分辨不同的亚型，而非仅仅区分野生型和突变型两种差异。

10、目前已有的方法在推广上都或多或少存在如试剂检测成本高，操作复杂，易产生污染，产生一定的假阴性和假阳性等缺陷。

11、比如pcr熔解曲线法，在非对称pcr的反应分析中，非对称pcr是利用不等量的一对引物来产生大量单链dna的方法，其能够通过不对称pcr反应制备的单链dna在用于序列测定时，不必在测序之前除去剩余引物，简化操作、节约人力物力。不对称pcr主要为测序制备大量单链dna，尤其是利用c-dna经不对称pcr进行dna序列分析、研究真核dna外显子。

12、在pcr反应中生成的pcr熔解曲线，虽然在扩增产物的溶解温度上有特征峰，可以用这个特征峰就可以将特异产物与其他的产物分开，但是在非对称pcr反应中生成的pcr熔解曲线上，会存在杂峰的出现，这是因为：

13、pcr熔解曲线分析过程，实际上利用pcr熔解曲线上的峰值信息进行产物特异性分析，以此分别出基因分型。但是pcr熔解曲线上的峰值信息包含了pcr仪器的精度误差，在此误差上，pcr熔解曲线上的峰值信息在推导计算的结果中难免会引起计算误差，导致各个温度值处出现若干杂峰。

14、见说明书附图2所示产物a在熔解曲线上的峰值，实际上存在多个杂峰。若是在pcr非特异性扩增中，温度a在pcr熔解曲线上的特征峰周围出现杂峰，则表明产物在pcr中的特异性反应差，峰值有待进一步确认，暂不适宜对结果进行分型判断。

15、因此有必要在利用pcr熔解曲线上的峰值信息进行产物特异性分析之前，对杂峰进一步地降噪处理，避免杂峰峰值范围过大而对特异产物的峰值造成影响，导致产物在结尾进行分型区分时出现较大的分型偏差。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本技术提出一种非对称pcr反应中的pcr熔解曲线分析方法及其应用和电子设备。

2、本技术一方面，提出一种非对称pcr反应中的pcr熔解曲线分析方法，包括如下步骤：

3、获取非对称pcr反应中各个产物的pcr熔解曲线的数据包并进行解析，得到生成pcr熔解曲线的初始参数；

4、对每个产物的所述pcr熔解曲线的初始参数进行分类，得到各个产物在熔解温度值下呈离散分布的峰值集合t；

5、计算出所述峰值集合t中的最大峰值和最小峰值之间的差值δ，并按照所述差值δ，将所述峰值集合t划分为n个子集；

6、计算并根据所述子集的平衡值构建新的峰值集合t*，按照上述方式对所述pcr熔解曲线的初始参数进行轮次收敛，得到pcr熔解曲线的矫正参数，并基于pcr熔解曲线的矫正参数重新生成pcr熔解曲线。

7、作为本技术的一可选实施方案，可选地，获取非对称pcr反应中各个产物的pcr熔解曲线的数据包并进行解析，得到生成pcr熔解曲线的初始参数，包括：

8、预设数据包解析格式；

9、从生成pcr熔解曲线的应用中，导出非对称pcr反应中各个产物的pcr熔解曲线的数据包；

10、按照所述数据包解析格式，对所述pcr熔解曲线的数据包进行解析，得到生成所述pcr熔解曲线的初始参数；

11、将各个产物的所述pcr熔解曲线的初始参数按照预先部署的第三方应用格式，分别导入并保存在第三方应用的数据库中。

12、作为本技术的一可选实施方案，可选地，在将各个产物的所述pcr熔解曲线的初始参数导入并保存在第三方应用的数据库之前，还包括：

13、获取非对称pcr反应中的各个产物属性；

14、根据各个产物属性，在预先部署的第三方应用的数据库中，建立与各个产物属性相对应的存储空间。

15、作为本技术的一可选实施方案，可选地，对每个产物的所述pcr熔解曲线的初始参数进行分类，得到各个产物在熔解温度值下呈离散分布的峰值集合t，包括：

16、获取每个产物的熔解温度值；

17、根据所述熔解温度值，从每个产物的所述pcr熔解曲线的初始参数中，找到与所述熔解温度值相对应的所有的峰值；

18、将各个产物在熔解温度值下的所有峰值，组成一个峰值呈离散分布的峰值集合t，并存储至各个产物在数据库中对应的存储空间中。

19、作为本技术的一可选实施方案，可选地，在得到各个产物在熔解温度值下呈离散分布的峰值集合t之后，还包括：

20、预设有序排列规则；

21、对各个产物的所述峰值集合t中呈离散分布的的峰值进行有序排列处理，按照从低到高的顺序进行排列。

22、作为本技术的一可选实施方案，可选地，在对所述峰值集合t进行有序排列处理之后，还包括：

23、计算出所述峰值集合t中的相邻两个峰值之间的差值tδ和最小差值tmin；

24、以所述最小峰值tmin为基准，判断相邻两个峰值之间的差值tδ是否满足：

25、tδ＞ntmin，n为2-2.5的自然数，

26、若满足，则将当前两个相邻峰值中远离所述峰值集合t中心的峰值排除。

27、作为本技术的一可选实施方案，可选地，计算并根据所述子集的平衡值构建新的峰值集合t*，按照上述方式对所述pcr熔解曲线的初始参数进行轮次收敛，得到pcr熔解曲线的矫正参数，并基于pcr熔解曲线的矫正参数重新生成pcr熔解曲线，包括：

28、计算出各个产物的所述峰值集合t中每个子集的平均峰值；

29、根据所述峰值集合t中所有子集的平均峰值，构建与各个产物相对应的首轮峰值集合t*，所述首轮峰值集合t*为各个产物在熔解温度值下峰值经过首轮收敛处理得到的峰值集合。

30、作为本技术的一可选实施方案，可选地，计算并根据所述子集的平衡值构建新的峰值集合t*，按照上述方式对所述pcr熔解曲线的初始参数进行轮次收敛，得到pcr熔解曲线的矫正参数，并基于pcr熔解曲线的矫正参数重新生成pcr熔解曲线。

31、预设收敛轮次条件；

32、继续进行收敛处理，对首轮的所述新的峰值集合t*，直到满足收敛轮次条件，停止迭代，得到最终的峰值集合t#；

33、以最终的峰值集合t#为生成pcr熔解曲线的矫正参数，并导入生成pcr熔解曲线的应用中，重新生成对应的pcr熔解曲线。

34、本技术另一方面，提出一种所述的非对称pcr反应中的pcr熔解曲线分析方法的应用，采用重新生成的pcr熔解曲线，根据曲线上的熔解温度值来进行基因分型。

35、本技术另一方面，还提出一种实现所述的非对称pcr反应中的pcr熔解曲线分析方法的装置，包括：

36、数据包解析模块，用于获取非对称pcr反应中各个产物的pcr熔解曲线的数据包并进行解析，得到生成pcr熔解曲线的初始参数；

37、数据集合模块，用于对每个产物的所述pcr熔解曲线的初始参数进行分类，得到各个产物在熔解温度值下呈离散分布的峰值集合t；

38、差值计算模块，用于计算出所述峰值集合t中的最大峰值和最小峰值之间的差值δ，并按照所述差值δ，将所述峰值集合t划分为n个子集；

39、轮次收敛模块，用于计算并根据所述子集的平衡值构建新的峰值集合t*，按照上述方式对所述pcr熔解曲线的初始参数进行轮次收敛，得到pcr熔解曲线的矫正参数，并基于pcr熔解曲线的矫正参数重新生成pcr熔解曲线。

40、本技术另一方面，还提出一种电子设备，包括：

41、处理器；

42、用于存储处理器可执行指令的存储器；

43、其中，所述处理器被配置为执行所述可执行指令时实现所述的非对称pcr反应中的pcr熔解曲线分析方法。

44、本发明的技术效果：

45、本技术通过获取非对称pcr反应中各个产物的pcr熔解曲线的数据包并进行解析，得到生成pcr熔解曲线的初始参数；对每个产物的所述pcr熔解曲线的初始参数进行分类，得到各个产物在熔解温度值下呈离散分布的峰值集合t；计算出所述峰值集合t中的最大峰值和最小峰值之间的差值δ，并按照所述差值δ，将所述峰值集合t划分为n个子集；计算并根据所述子集的平衡值构建新的峰值集合t*，按照上述方式对所述pcr熔解曲线的初始参数进行轮次收敛，得到pcr熔解曲线的矫正参数，并基于pcr熔解曲线的矫正参数重新生成pcr熔解曲线。能够重新得到可用于适当精确参数分析的pcr熔解曲线。该pcr熔解曲线经过两次降噪、收敛处理，将多余的杂峰去除，使得在利用pcr熔解曲线上的峰值信息进行产物特异性分析之前，对杂峰进一步地降噪处理，避免杂峰峰值范围过大而对特异产物的峰值造成影响，导致产物在结尾进行分型区分时出现较大的分型偏差。采用本方案，能够降低各个产物在熔解温度上的不同杂峰对特异性分型分析的影响，使得分型结果更为准确。

46、根据下面参考附图对示例性实施例的详细说明，本公开的其它特征及方面将变得清楚。