赶黄草提取物及其活性单体化合物在制备抗癌药物中的应用以及制备方法

本发明属于中药提取物，具体涉及赶黄草提取物及其活性单体化合物在制备抗癌药物中的应用以及制备方法。

背景技术：

1、癌症是导致人类死亡的重要因素之一，严重危害人类的生命健康。在癌症死亡病例中，结直肠癌的发病率以及死亡率分别位居第三和第二，且发病率继续呈现年轻化趋势，严重威胁人类健康。同时，肝癌在所有癌症致死病例中排列第三，而中国肝癌新病例占全球肝癌新病例的45％左右，因此，肝癌的防控也是重中之重。

2、目前，癌症的治疗方法主要为手术治疗、化学药物治疗、放射治疗以及生物治疗。国际上除呼吁加强早期癌症筛查外，仍然侧重于化学预防和治疗药物的筛选。化学药物多需长期服用，且副作用较大。天然药物尤其是中草药对于肿瘤的治疗功效独特、副作用相对较小，在抑制肿瘤生长的同时，还可以改善患者的临床症状，从而提高其生存质量。因而，从天然药物、特别是从传统的中草药中寻找有效的抗癌活性成分在癌症的治疗中十分重要。

技术实现思路

1、针对以上问题，本发明提供赶黄草提取物及其活性单体化合物在制备抗癌药物中的应用以及制备方法。本发明提供的赶黄草提取物和活性单体化合物对肝癌细胞、结肠癌细胞的增殖具有显著的抑制作用，其中部分化合物还具有诱导细胞凋亡的作用，可用于制备抗癌药物。

2、为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了赶黄草提取物在制备抗癌药物中的应用，所述抗癌药物的活性成分包括所述赶黄草提取物，所述赶黄草提取物中包括结构式如式i～式x所示的化合物中的至少一种：

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6、本发明通过实验研究，从赶黄草中获得了一种含有结构式如式i～式x所示的化合物的提取物，在上述化合物中，结构式如式i～式ⅷ所示的化合物为未见报道的新化合物，结构式如式ix所示的化合物为penthorinol b，结构式如式x所示的化合物为(7'e,8s)-2',4,8-trihydroxy-3-methoxy-2,4'-epoxy-8,5'-neolign-7'-en-7-one。

7、经实验验证，上述赶黄草提取物以及各活性单体化合物对肝癌细胞hepg2、结肠癌细胞ht29、lovo的增殖均有抑制活性，其中结构式如式i、iv、vi和ix所示的化合物对肝癌细胞hepg2的抑制活性强于五氟尿嘧啶，结构式如式i、v和vi所示的化合物对结肠癌细胞ht29、lovo的抑制活性强于五氟尿嘧啶，其中结构式如式i和vi所示的化合物不仅具有更强的抑制结肠癌细胞增殖的活性，还能抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭以及parp蛋白的表达，发挥促进癌细胞凋亡的作用。

8、结合第一方面，所述抗癌药物为防治结直肠癌的药物。

9、结合第一方面，所述抗癌药物为防治肝癌的药物。

10、结合第一方面，所述赶黄草提取物中包括结构式如式i和/或式vi所示的化合物，所述抗癌药物为诱导癌细胞凋亡的药物。结构式如式i所示的化合物和结构式如式vi所示的化合物能够上调bax的表达，并下调bcl-2的蛋白水平，从而促进癌细胞凋亡。

11、优选地，所述抗癌药物为parp抑制剂。结构式如式i所示的化合物和结构式如式vi所示的化合物能够呈浓度依赖性抑制parp蛋白的表达，因此，二者可用于制备parp抑制剂。

12、结合第一方面，所述抗癌药物还包括药学上可接受的赋形剂。具体赋形剂可根据药物剂型进行常规选择，本发明对具体赋形剂、剂型及制备方法不进行限定，赋形剂、剂型及制备方法的选择以不对上述化合物的药理活性和理化稳定性产生不良影响、符合临床用药需求为宜。

13、第二方面，本发明提供了赶黄草活性单体化合物在制备抗癌药物中的应用，所述抗癌药物的活性成分包括结构式如式i～式x所示的化合物中的至少一种：

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16、结合第二方面，所述抗癌药物为防治结直肠癌的药物。

17、结合第二方面，所述抗癌药物为防治肝癌的药物。

18、结合第二方面，所述抗癌药物的活性成分包括结构式如式i和/或式x所示的化合物，所述抗癌药物为诱导癌细胞凋亡的药物。

19、优选地，所述抗癌药物为parp抑制剂。结构式如式i所示的化合物和结构式如式vi所示的化合物能够呈浓度依赖性抑制parp蛋白的表达，因此，二者可用于制备parp抑制剂。

20、结合第二方面，所述抗癌药物还包括药学上可接受的赋形剂。具体赋形剂可根据药物剂型进行常规选择，本发明对具体赋形剂、剂型及制备方法不进行限定，赋形剂、剂型及制备方法的选择以不对上述化合物的药理活性和理化稳定性产生不良影响、符合临床用药需求为宜。

21、第三方面，本发明提供了上述赶黄草提取物的制备方法，具体包括以下操作：

22、将赶黄草以90％～100％v/v乙醇溶液回流提取，将所得提取液浓缩后，用乙酸乙酯-水萃取，取乙酸乙酯萃取物，即得含有结构式如式i～式x所示的化合物的提取物。

23、结合第三方面，所述乙醇溶液的浓度为95％v/v。

24、第四方面，本发明还提供了从上述赶黄草提取物中提取抗癌活性单体的方法，具体包括以下步骤：

25、s1、将所述提取物浓缩后经硅胶柱吸附，依次用100:0、100:1(v/v)的二氯甲烷-甲醇进行洗脱，收集100:1(v/v)二氯甲烷-甲醇洗脱流份，标记为pce 5；

26、s2、将所述pce 5经ods柱吸附，依次用35:65、45:55、55:45、60:40、65:35(v/v)的甲醇-水进行洗脱，收集55:45(v/v)甲醇-水洗脱流份，标记为pce 5-12；收集60:40(v/v)甲醇-水洗脱流份共四份，依次标记为pce 5-13、pce 5-14、pce 5-15、pce 5-17；收集65:35(v/v)甲醇-水洗脱流份，标记为pce 5-18；将所述pce 5-12、pce 5-13、pce 5-14、pce 5-15、pce 5-17、pce 5-18经制备型hplc色谱柱分离。

27、上述赶黄草提取物按上述制备方法经硅胶柱层析、ods柱层析以及制备色谱分离后，可得到结构式如式i、式ii、式iii、式iv、式vi、式vii、式ⅷ、式ix和式x所示的化合物。

28、结合第四方面，s2中将所述pce 5-12经制备型hplc色谱柱分离时，流动相为38:62(v/v)乙腈-1％v/v乙酸，色谱柱为cosmosil 5c18-ms-ii column，得到结构式如式vii所示的化合物。

29、结合第四方面，s2中将所述pce 5-13经制备型hplc色谱柱分离时，流动相为40:60(v/v)乙腈-1％v/v乙酸，色谱柱为cosmosil 5c18-ms-ii column，得到结构式如式vi所示的化合物和结构式如式ⅷ所示的化合物。

30、结合第四方面，s2中将所述pce 5-14经制备型hplc色谱柱分离时，先以40:60(v/v)乙腈-1％v/v乙酸为流动相进行分离，流速为9.0ml/min，收集tr为43.9～48.6min的洗脱流份，标记为pce 5-14-1，再将所述pce 5-14-1以60:40(v/v)甲醇-1％v/v乙酸为流动相进行分离将收集，色谱柱均为cosmosil5c18-ms-ii column，得到结构式如式x所示的化合物。

31、结合第四方面，s2中将所述pce 5-15经制备型hplc色谱柱分离时，流动相为43:57(v/v)乙腈-1％v/v乙酸，色谱柱为cosmosil 5c18-ms-ii column，得到结构式如式i所示的化合物。

32、结合第四方面，s2中将所述pce 5-17经制备型hplc色谱柱分离时，流动相为46:54(v/v)乙腈-1％v/v乙酸，色谱柱为cosmosil 5c18-ms-ii column，得到结构式如式iv所示的化合物和结构式如式ix所示的化合物。

33、结合第四方面，s2中将所述pce 5-18经制备型hplc色谱柱分离时，先以50:50(v/v)乙腈-1％v/v乙酸为流动相进行分离，流速为9.0ml/min，收集tr为36.9～41.1min的洗脱流份，标记为pce 5-18-3，收集tr为41.5～44.7min的洗脱流份，标记为pce 5-18-4，再将所述pce 5-18-3，pce 5-18-4分别以65:35(v/v)甲醇-1％v/v乙酸为流动相进行分离将收集，色谱柱均为cosmosil5c18-ms-ii column，分别得到结构式如式ii所示的化合物和结构式如式iii所示的化合物。

34、第五方面，本发明还提供了另一种从上述赶黄草提取物中提取抗癌活性单体的方法：

35、s1、将所述提取物浓缩后经硅胶柱吸附，依次用100:0、100:1、100:3(v/v)的二氯甲烷-甲醇进行洗脱，收集100:3(v/v)二氯甲烷-甲醇洗脱流份，标记为pce 6；

36、s2、将所述pce 6经ods柱吸附，依次用10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40(v/v)的甲醇-水进行洗脱，收集60:40(v/v)甲醇-水洗脱流份，标记为pce 6-9；将所述pce6-9经制备型hplc色谱柱分离，得到结构式如式v所示的化合物。

37、上述赶黄草提取物按上述制备方法经硅胶柱层析、ods柱层析以及制备色谱分离后，可得到结构式如式v所示的化合物。

38、结合第五方面，s2中将所述pce 6-9经制备型hplc色谱柱分离时，先以34:66(v/v)乙腈-1％v/v乙酸为流动相进行分离，流速为9.0ml/min，收集tr为45.0～49.5min的洗脱流份，标记为pce 6-9-3，再将所述pce 6-9-3以55:45(v/v)甲醇-1％v/v乙酸为流动相进行分离将收集，色谱柱均为cosmosil5c18-ms-ii column，得到结构式如式v所示的化合物。

39、本发明的有益效果是：本发明通过乙醇溶液提取、乙酸乙酯萃取的方法获得了具抗癌活性的提取物，进而经柱层析和制备色谱分离，可获得10种具有抗癌活性的单体化合物。经scifinder检索发现，该10种化合物仅存在于赶黄草中，可能为赶黄草的特征性成分，其中8种化合物为未见报道的新化学成分。本发明以肝癌细胞hepg2以及结肠癌细胞ht29、lovo进行上述提取物和化合物的抗癌活性研究，发现本发明提供的赶黄草提取物和化合物对三种细胞系的增殖均具有抑制作用，其中结构如式i和式vi所示的化合物还能够显著抑制ht29和lovo细胞的增殖、迁移和侵袭，并能通过上调bax，下调bcl2以及parp蛋白的表达发挥促进癌细胞凋亡的作用。上述提取物和化合物可作为抗结直肠癌和肝癌的活性成分，用于抗结肠癌和肝癌用药物的开发。