一种pH敏感口服中华眼镜蛇神经毒素纳米粒及其制备方法

本发明涉及中华眼镜蛇神经毒素纳米粒的制备，尤其涉及一种ph敏感口服中华眼镜蛇神经毒素纳米粒及其制备方法。

背景技术：

1、蛇毒是由复杂的混合物组成，包括蛋白质，多肽，酶类，毒素和非蛋白杂质。其中最主要组成成分为蛋白质类，占蛇毒总干重90％-95％，具有多种生物学活性。神经毒素是蛇毒中最大的组成成分，由60-75个氨基酸组成，分子量为6000-7000da，pi高于9的碱性多肽链，神经毒素能够治疗神经性疼痛，癌症及神经硬化症等，而且是研究神经系统中神经递质产生以及传递过程分子机制的重要探针，在医药研究中具有重要的应用前景。

2、生物药物随着技术的不断创新与发展，同时技术创新又加速了新的生物药物的研发速度，提升了生产水平。近几年随着精准的个性化医疗概念的提出，将会有更多的候选生物大分子需要进行临床筛选。蛋白，多肽类，抗体类药物基本都是以注射为主，注射给药易引起患者疼痛与反感，还会导致体内药物分布过快，有呼吸抑制的副作用。国外有售nant(naja atraneurotoxin，中华眼镜蛇神经毒素)制剂为凝胶剂，经皮给药安全可靠，患者顺应性好，可以克服注射给药存在的问题，然而蛋白多肽类药物因皮肤角质层的屏障作用，难以有效透过皮肤，使其进入体内发挥作用，导致生物利用度低。

3、国内外研究现状分析：眼镜蛇毒中含有大量的神经毒素，我国有两种眼镜蛇，分别是舟山眼镜蛇(naja atra)和孟加拉眼镜蛇(najakaouthia)，前者又称为中华眼镜蛇。1933年，calmette和taguet发现肌肉注射眼镜蛇毒可产生类似吗啡的中枢性镇痛作用。美国hynson，westcott&dunning公司对中华眼镜蛇蛇毒的粗毒进行初步分离，制成两种神经毒素制剂cobroxin和nyloxin，可用于治疗疼痛和关节炎，1965年，yang等通过cm-cellulose柱和sephadex g-25柱从我国台湾眼镜蛇蛇毒中分离得到一种棒状晶体蛋白，将其命名为神经毒素，其毒性为粗毒的6.7倍，并具有热稳定性，因其在镇痛方面具有高效性，无耐受性，无成瘾性，不良反应少而被广泛研究。chen等研究揭示了神经毒素作用机制是主要作用于乙酰胆碱受体，从而阻碍神经传导达到镇痛的作用。1976年-1978年，曾才铭使用克痛宁(云南动物研究所用眼镜蛇毒提纯的神经毒素制成的真剂，原名“克痛灵”)治疗慢性腰腿痛，先后在昆钢八街矿和云南冶金三矿职工医院，试用100余例，取得一定疗效。尽管我国蛇毒制剂的应用当时得到一定程度的推广，但“克痛灵”蛇毒制剂并没有更好的发展和升级，其一，当时蛋白分离技术的限制，其二，对蛇毒制剂的检测及监管不到位，导致蛇毒假制剂四处横行，最终导致行业没落，其三，蛇毒作用机制研究进展缓慢。1988年，陈汝筑将分离纯化的眼镜蛇神经毒素注射给药，在小鼠热板及大鼠电尾嘶叫测痛模型中都显示出了明显的镇痛作用，并提出眼镜蛇神经毒素的镇痛机理可能与吗啡不同。2000年广西医科大学蛇毒研究所采用高效液相层析法分离纯化眼镜蛇神经毒素，并给大鼠中脑导水管周围灰质注入微量神经毒素，采用热辐射甩尾法观察中枢性镇痛作用。1999年1月-2000年9月应用济南军区生物制品药物研究所生产的科博肽肠溶胶囊，对68例患者耐受性好，疼痛均得到不同程度缓解，神经毒素加适当的辅料制成的肠溶胶囊能够特异地、高亲和地与神经接头突触后膜上的n型乙酰胆碱受体结合。因蛇毒蛋白神经毒素为大分子类蛋白药物，注射给药顺应差，副作用大。目前研究者正在进行蛇毒蛋白多剂型的开发。翟宁用聚乙二醇修饰眼镜蛇神经毒素与未经修饰的眼镜蛇神经毒素做参比，反复冻融稳定性和热稳定性得到提高，毒性大为降低，在同样剂量下和相同时间点的镇痛活性也得到增强。郝永龙等采用复乳溶剂挥发法制备了眼镜蛇神经毒素plga(poly(lactic-co-glycolic acid)，聚乳酸-羟基乙酸共聚物)微球，通过鼻腔给药，经过药效学实验表明，镇痛作用明显增强。朱潇冉制备了双修饰眼镜蛇神经毒素脂质体[pep2(pep1)-αct-lp)]经鼻黏膜给药后药物在大鼠脑中的药动学行为，并通过一系列表征以及质量评价后得出双修饰眼镜蛇神经毒素脂质体可以提高药物在中脑导水管周围灰质部位浓度，该结果为研究蛋白多肽类药物鼻粘膜给药的脑靶向制剂的开发提供了参考。yang等以大豆卵磷脂和胆固醇的壳层，添加脱镁叶绿酸作为光敏剂，制备了一种新型的碳纳米管纳米胶囊，红光激活脱镁叶绿酸，打开纳米胶囊和血脑屏障，帮助碳纳米管进入大脑，为中枢性疼痛的治疗提供了一种新的给药途径。夏爱晓等人制备了中华眼镜蛇神经毒素可溶性微针针型良好并证实可以有效穿透大鼠离体皮肤，实现了大分子药物的透皮递送。实验室前期还做了眼镜蛇神经毒素的栓剂，以及相转化水凝胶，来解决蛇毒蛋白吸收入血的问题。近几年随着精准的个性化医疗概念的提出，将会有更多的候选生物大分子需要进行临床筛选。蛋白，多肽类，抗体类药物基本都是以注射为主，注射给药易引起患者疼痛与反感，还会导致体内药物分布过快，有呼吸抑制的副作用。国外有售nant制剂为凝胶剂，经皮给药安全可靠，患者顺应性好，可以克服注射给药存在的问题，然而蛋白多肽类药物因皮肤角质层的屏障作用，难以有效透过皮肤，使其进入体内发挥作用，导致生物利用度低。鼻腔给药系统是递送蛋白多肽类药物以及提高生物利用度有效的药物递送系统，但是它易引起鼻粘膜的病理变化，定量不准确，药物在鼻腔中分布不均匀、易从鼻腔中流失。因此开发安全有效的蛋白多肽类药物口服制剂迫在眉睫。胃肠道有着多变的ph环境，以及蛋白酶，黏液屏障，常采用ph敏感的口服纳米递药系统的策略来克服ph，以及蛋白酶和黏液屏障问题。

4、常用的纳米载体材料可以分为两大类：(1)合成高分子材料，如聚丙交脂、聚丙交酯乙交酯共聚物、聚己内脂等。(2)天然高分子材料，包括明胶、海藻酸盐、壳聚糖、蛋白类。纳米材料是否可作为多肽类药物载体的判断标准：可以包裹药物，保护其免受消化系统中酶的降解；纳米粒的大小、形状及其分布要符合要求；有较高的载药量及包封率；载体材料必须是无毒的、可降解的。

5、壳聚糖(cs)是一种很有前途的大分子载体，cs是从甲壳类和昆虫壳中提取的一种无毒的生物相容性多糖。其安全性在动物模型和人体模型中得到了证实。cs除了保护负载的药物免受酸性变性和酶降解，还能够延长药物在小肠中的停留时间。陈红丽采用溶剂挥发法，制备了载牛血清白蛋白的plga纳米粒，选择cs分别采用直接吸附法修饰纳米粒以及共价联接法修饰纳米粒表面，并对纳米粒进行理化性质考察，为不同修饰方式制备纳米粒作为多肽类药物载体的研究提供了参考依据。高萍利用离子交联法和聚电解质凝聚法分别合成了壳聚糖纳米粒(cs-nps)和壳聚糖/羧甲基壳聚糖复合纳米粒(cs/cmcs-nps)，两者纳米粒球形完整，分布均一，并且cs/cmss-nps具有良好的生物相容性，较高的包封率，并可以保护所包载的药物达到鱼类的后肠，该纳米颗粒有望成为一种安全有效的口服疫苗运送载体。chen等制备了一种ph敏感的壳聚糖/聚谷氨酸纳米粒(cs/pga-nps)体系用于胰岛素口服给药，为了克服nps的崩解和胰岛素的降解，将纳米粒冷冻干燥，装入肠溶胶囊中，肠溶胶囊在胃酸环境中保持完好，在小肠近端迅速溶解，可作为胰岛素口服给药的一种潜在方法。sung等研究了一种由壳聚糖组成的ph响应型纳米粒系统，用于胰岛素口服给药，cs-nps能够黏附和渗透小肠黏液层的，瞬间打开上皮细胞之间的紧密连接，进入体循环。

6、海藻酸钠(alg)属于直链阴离子聚合物，易溶于水，有生物相容性，可降解等优点，可与带正电壳聚糖(cs)通过静电相互作用形成纳米粒。俞怡晨等将1.5g/l海藻酸钠和0.6g/l壳聚糖以2：1混合，并考察了ca+浓度对纳米粒影响，成功制成了cs/alg纳米粒，载药量良好。goycoolea等在实验中以三聚磷酸钠(tpp)为交联剂在m(cs)：m(tpp)：m(alg)：m(lnsulin)＝6：1：0.5：3条件下制备的纳米粒负载胰岛素为(41.2±0.4)％。

7、由于nant是一种大分子蛋白类药物，亲水性强，易被蛋白酶水解。胃内ph约为1-2.5，强酸性的胃液会影响氨基酸的电离从而破坏蛋白质和多肽空间结构的化学键，使药物降解。因此，本技术将蛇毒蛋白神经毒素做成通过静电吸引的壳聚糖/海藻酸钠口服纳米粒，有效解决了上述技术问题。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种ph敏感口服中华眼镜蛇神经毒素纳米粒及其制备方法，将蛇毒蛋白神经毒素做成通过静电吸引的壳聚糖/海藻酸钠口服纳米粒，制成口服蛋白类镇痛药物，给药方便，安全性高，顺应性好，并提高了生物利用度。解决了注射剂的顺应性差、副作用大的问题，也解决了神经毒素口服被胃蛋白酶降解的问题。同时蛇毒蛋白神经毒素与阿片类药物相比镇痛效果好，没有严重的胃肠道反应，没有成瘾性，在临床上可以用于治疗顽固性疼痛、恶性肿瘤疼痛和关节痛，是一种非常值得研究的生物药，因此开发神经毒素的新剂型在临床上有非常广阔的应用前景。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种ph敏感口服中华眼镜蛇神经毒素纳米粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：

4、步骤s1、alg水溶液的制备：将适量alg粉末溶解在超纯水中，用酸溶液调节ph，并超声，获得alg水溶液；

5、步骤s2、cs溶液的制备：称取适量cs粉末，溶解于酸溶液中，用碱溶液调节ph，并超声，获得cs溶液；

6、步骤s3、中华眼镜蛇神经毒素纳米粒的制备：将nant粉末溶解在乙醇中，以一定速度滴入alg水溶液中，先搅拌，再超声；然后将cs溶液滴入含nant溶液的alg水溶液中，在室温下搅拌设定时间，并超声，获得纳米粒悬浮液。

7、在一种可能的实施方式中，所述方法包括如下步骤：

8、步骤s1、alg水溶液的制备：将适量alg粉末溶解在超纯水中，用1％hac溶液调节ph，并超声5-10min，获得alg水溶液；

9、步骤s2、cs溶液的制备：称取适量cs粉末，溶解于1％hac中，用1mol/lnaoh溶液调节ph，并超声5-10min，获得cs溶液；

10、步骤s3、中华眼镜蛇神经毒素纳米粒的制备：将nant粉末溶解在20-40％乙醇中，以每滴3-5s的速度滴入alg水溶液中，先搅拌20-60min，超声5-10min；然后将cs溶液滴入含nant溶液的alg水溶液中，在室温下搅拌设定时间，并超声10-20min，获得纳米粒悬浮液。

11、在一种可能的实施方式中，所述alg水溶液的浓度为0.1-0.6mg/ml。

12、在一种可能的实施方式中，所述alg水溶液的ph值为4-5。

13、在一种可能的实施方式中，所述cs溶液的浓度为0.1-0.6mg/ml。

14、在一种可能的实施方式中，所述cs溶液的ph值为4-6。

15、在一种可能的实施方式中，所述搅拌设定时间为0-8h。

16、在一种可能的实施方式中，所述搅拌速度为200-1000rpm。

17、在一种可能的实施方式中，所述nant溶液的浓度为1-3mg/ml。

18、本发明还提供了一种ph敏感口服中华眼镜蛇神经毒素纳米粒，采用上述方法制备而成，所述中华眼镜蛇神经毒素纳米粒呈球形，其粒径小于500nm。

19、本发明的技术效果和优点：

20、1)通过hplc建立了nant体外分析方法，结果表明该方法专属性、精密度、稳定性和重现性良好。单因素考察结果表明，alg，cs最适宜范围在0.2-0.5mg/ml之间，投药量在1-2.5mg之间，ph为4.5，搅拌时间为2h，搅拌速度为400rpm；最后通过了box-behnken优化后的配方包括：alg为0.24mg/ml，cs为0.26mg/ml，投药量为1.41mg，得到的粒径为282.67±4.89nm，包封率为85.83±1.22％，载药量为24.11±0.26％。

21、2)利用马尔文粒径仪测得粒径<500nm，pdi<0.3，利用tem以及sem测得载药前后纳米粒形貌为不黏连的圆球形，符合纳米粒的标准；ftir，dsc结果表明，nant可能通过静电吸引成功载入cs/alg纳米载体中；贮存稳定性结果表明，纳米粒更适合储藏在低温条件中；冻干稳定性结果表明，添加2％的海藻糖可以使纳米粒复溶并有良好的粒径和pdi；体外释放结果表明nant-cs/alg-nps在40h时累计释放率达到60％，可以模拟肠液中缓慢释放。

22、3)caco-2细胞试验结果表明，cs/alg-nps对肠上皮细胞没有毒性，可以作为一种安全的载体进行口服给药；荧光酶标仪结果表明随着时间、载体浓度的增加，细胞摄取载体能力越强，同时荧光显微镜结果也证明了这点；动物成像结果表明，nant-cs/alg-nps可以达到在肠道缓释的作用。

23、4)醋酸扭体试验表明nant-cs/alg-nps显著降低了小鼠扭体次数，提高了扭体抑制率。热板法试验表明nant-cs/alg-nps可以明显延长小鼠的痛域值。

24、5)采取制备ph敏感的口服给药系统，克服了胃内强酸环境，以及胃肠道中蛋白酶对神经毒素的影响，降低了神经毒素首过效应，达到神经毒素在小肠的释放，提高神经毒素的生物利用度，并对神经毒素口服纳米粒进行体内外评价，为该制剂临床治疗疼痛提供了理论依据。

25、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书以及附图中所指出的结构来实现和获得。