一种利用低共熔溶剂提取芦笋中黄酮的方法

本发明属于提取，涉及一种芦笋粉中提取黄酮的工艺，具体涉及一种利用低共熔溶剂提取芦笋中黄酮的方法。

背景技术：

1、芦笋是一种高营养低热量的蔬菜，属天门冬科，被称为“蔬菜之王”。世界上的芦笋品种非常丰富，从年产量上来看，中国排名第一，占全球产量的84％以上。芦笋具有非常丰富的植物化学成分(多酚、皂甙、天冬氨酸和生物碱)，同时对神经保护、抗焦虑、抗酪氨酸酶、抗氧化、抗菌和抗哮喘有一定作用。

2、其中，绿芦笋是酚类化合物的良好来源，不但含有多酚，天冬氨酸，生物碱还含有非常丰富的黄酮类化合物。黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环(a-与b-环)通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮，结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团。此外，它还常与糖结合成苷。黄酮具有很好的抗氧化性能，可以抑制并且清除人体内的氧自由基，黄酮的抑制作用是维生素e的十倍，这种优良的抗氧化性能可以阻止细胞的退化、衰老，也可以阻止癌症的发生，黄酮还可以抑制炎性生物酶的渗出，黄酮因其抗氧化抗炎、抗菌等特性，在制药和食品等行业有着很好的应用前景。

3、目前，黄酮类化合物的提取有着不同的方法，如碱提酸沉法、溶剂法、传统的方法提取黄酮需要使用酸碱，对环境会造成一定程度的污染，提取过程中酸碱使用浓度难以控制，且由于黄酮类物质较为敏感，若碱浓度过高在加热过程中会破坏黄酮类化合物的母核进而影响提取物质量；提取时酸性若过强，会生成盐，导致析出的黄酮类化合物又重新溶解。如何方便快捷的提取黄酮类化合物逐渐成为其发展道路上的阻碍，因此寻求一种经济、绿色高效的提取技术，被广泛关注。在过去的研究中，从植物中提取生物活性物质的方法大都采用有机溶剂，如甲醇，乙醇，丙酮等，但这些溶剂因其自身的有毒性、挥发性、和选择性差等因素导致其在提取方面有着很大的局限性。同时，传统方法在提取生物活性物质时，常常对温度和提取时间有着非常苛刻的要求，并且伴随着能量的过多浪费和消耗。

4、对此，研究者们进行了一系列的优化提取技术，m.solana采用超临界流体和加压液体提取芦笋中的酚类化合物，通过高压大大减少了提取时间超声辅助法目前在工业上非常流行，在芦笋提取功能性化合物中的应用中已得到广泛的研究。但是将其利用在规模化操作还有待进一步研究。因此，如何开发研究一种天然绿色无污染的提取方法，且能提升黄酮的溶出率和提纯纯度成为众多学者研究的方向之一。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种利用低共熔溶剂提取芦笋中黄酮的方法通过利用冷冻及阶段冻干升温膨化的方法，保证了所有有效成分的充分保留不流失前提下，协同增强低共熔溶剂与芦笋细胞壁之间的相互作用，更有利于黄酮的溶出，同时利用阶段离心方式，极大地提升了黄酮物质的提纯纯度，该制备方法操作简单，过程易于控制，绿色环保，提取效率高，生产成本低廉，可用于大规模商业化生产。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种利用低共熔溶剂提取芦笋中黄酮的方法，按照如下的步骤顺序依次进行：

4、s1、将鲜芦笋切成5-10cm小段后放置于阴凉处2-3天，得a；

5、s2、将a置于冰箱中于-20℃下冷冻干燥2h，得b；

6、s3、将b转移至冷冻干燥机中抽真空条件下于15℃/h升温速率由-35℃升温至25℃，取出待用，得c；

7、s4、将c置于粉碎机中粉碎，过孔径为0.45mm的筛子，得d；

8、s5、取d和低共熔溶剂置于容器中并超声30min，溶液转移至离心管中，将其放入气浴恒温震荡器中进行震荡，于40℃、转速为100rp/min下提取2h，之后转移至离心机中，离心后离心管上部的悬浮液用带有滤膜的注射器从混合溶液中分离出黄酮物质，得e；

9、s6、取e并用高效液相色谱法进行黄酮定量。

10、作为本发明的一种限定，步骤s5中，所述低共熔溶剂为氯化胆碱、水和脯氨酸按5:2:5的质量比混合，在80℃下搅拌反应至颗粒溶化形成的均匀液体。

11、本发明的低共熔溶剂的物质配伍和配比是较为重要的，其影响着芦笋细胞内黄酮的溶出率和提取效率，氯化胆碱作为氢键受体，水和脯氨酸作为氢键供体，适量的水不但能降低低共熔溶剂的黏度，而且电导率也随含水量的增加而增大，并在达到10～100倍后下降，由于低共熔溶剂组分间由氢键相连，因此水的存在不仅能改变其理化性质，还会对其提取能力产生影响，提升其提取能力，而当含水量进一步增大时，此作用会逐步降低直至消失。另一方面，本发明的低共熔溶剂中的脯氨酸一方面可作为氢键供体，另一方面因其含有n基团，在芦笋经过低温冷冻膨化干燥后，由于芦笋细胞失水升华，细胞壁间的间隙增大，含有n基团脯氨酸更有利于增强低共熔溶剂与细胞壁之间的相互作用，提升黄酮的溶出率。

12、作为本发明的第二种限定，步骤s5，所述d与低共熔溶剂的质量体积比为0.5g/ml。

13、作为本发明的第三种限定，步骤s5，所述离心为三阶段离心，具体的程序按照如下进行：

14、a、于500rad/min离心3-5min，重复操作2次，收集并合并离心管上部的悬浮液，得a1；

15、b、将a1转移至离心管中，于1000rad/min离心3-5min，重复操作2次，收集并合并离心管上部的悬浮液，得b1；

16、c、将b1转移至离心管中，于2000rad/min离心1min，重复操作2次，收集并合并离心管上部的悬浮液。

17、本发明经过三阶段的离心程序提取，通过依次增大的离心转速，可将黄酮黄酮物质最大程度的溶解于低共熔溶剂中，并将其余的杂质以沉淀的形式进行分离，由于黄酮类化合物是由两个具有酚羟基的苯环(a-与b-环)通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化合物，其基本母核为2-苯基色原酮，结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团，此外，它还常与糖结合成苷，因此该类物质的分子大小是不一致的，如通过单一的离心进行分离，是较难最大程度的将其进行提纯分离的，因此本发明通过三个不同等级的离心速度将其进行提纯分离，使得黄酮类物质能最大化的进行溶解和分离，防止小分子的黄酮类物质与其余的沉淀物附着结合后造成流失，本发明的阶段离心有利于提升其黄酮类物质的纯度和提取率。

18、本发明还有一种限定，步骤s6中，所述高效液相色谱法采用spheriosorb ods-2色谱柱进行黄酮分离，使用水和质量浓度0.5％h3po4，乙腈和质量浓度0.5％ h3po4作为流动相，以20μl/min的流速泵入高效液相色谱系统。

19、本发明上述技术方案作为一个整体，其各个步骤是息息相关，不可分割的，其共同影响着芦笋中黄酮类物质的溶出率和提取率。

20、由于采用本发明上述技术方案后，本发明所取得的有益效果如下：

21、1、本发明制备方法简单，过程易于控制，能耗低，整个过程绿色环保。

22、2、本发明通过利用冷冻及阶段冻干升温膨化的方法，保证了所有有效成分的充分保留不流失前提下，协同增强低共熔溶剂与芦笋细胞壁之间的相互作用，更有利于芦笋细胞中黄酮的溶出，同时利用阶段离心方式，极大地提升了黄酮物质的提纯纯度，提纯效果好，黄酮的提取率高。

23、本发明适用于提取芦笋中的黄酮物质。

24、下面将结合说明书附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。