一种胶原蛋白壳聚糖复合支架及其制备方法及应用

本发明属于医用生物材料领域，特别涉及一种胶原蛋白壳聚糖复合支架及其制备方法及应用。

背景技术：

1、组织工程旨在使用装有细胞和生长因子的支架来支持和促进受损或患病组织的再生，组织工程支架有望替代细胞外基质(ecm)，并为细胞生长提供临时场所。因此，支架的材料应根据其生物相容性、黏附性、机械性能等严格选择，明胶和壳聚糖(cs)是组织工程支架的首选天然生物材料，因为它们与ecm密切相关；明胶是ecm的主要成分胶原蛋白水解的产物，因其抗原性和生物相容性而在组织工程中得到了广泛的应用，然而较低的机械强度和黏附性能限制了其应用；壳聚糖是一种由甲壳素脱乙酰化制得的多糖，具有良好的抗菌性能，由于其优异的生物学特性，明胶和cs的混合物已被用于制造各种支架，例如皮肤，骨骼，神经，肝脏等。

2、尽管明胶和cs基水凝胶有其优势，但机械性能差成为限制其作为支架应用的一大障碍。为了提高此支架的机械强度，多采用加入如碳二亚胺、戊二醛等一类的化学交联剂，但是此种方法会使支架内部残留未反应的交联剂从而导致毒性反应，不适合用于伤口。因此不使用交联剂而利用紫外进行光交联来增强支架机械强度的方法受到广泛关注。如ji等开发了一种基于明胶甲基丙烯酰基和巯基化壳聚糖的双交联水凝胶[ji,s.,et al.,adual-crosslinked hydrogel based on gelatin methacryloyl and sulfhydrylatedchitosan for promoting wound healing.international journal of molecularsciences,2023.24(3):p.2447]，此水凝胶的压缩模量可以达到31.78±3.315kpa，具有很高的刚性和抗压性；ana isabel 等人制备了一种由化学交联壳聚糖和明胶组成的生物相容性支架[canas,a.i.,j.p.delgado,and c.gartner,biocompatible scaffoldscomposed of chemically crosslinked chitosan and gelatin for tissueengineering.journal of applied polymer science,2016.133(33).]，此交联支架的压缩模量在0.416–2.216mpa范围内；国家发明专利申请cn108047465a则公开了一种甲基丙烯酸酯明胶/壳聚糖互穿网络水凝胶，该水凝胶具有生物相容性好、无毒、机械性能优良的特点，可以作为组织修复的材料应用。尽管上述现有技术已经对明胶/壳聚糖复合支架的制备进行了优化，显著提高了其机械性能，但是若将此支架用在皮肤愈合领域，那么太高的机械性能虽然在受到外界压缩时具有抵抗力，但是不可避免的削弱了其抗疲劳性和韧性。因此要使支架在伤口愈合中表现出更好的性能，就要求支架材料同时具备刚性、韧性和粘弹性等性能，为伤口愈合提供足够的保护。

3、因此，仍需对凝胶进一步优化，使其克服上述不足之处。

技术实现思路

1、本发明的首要目的在于提供一种胶原蛋白壳聚糖复合支架的制备方法。

2、本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的胶原蛋白壳聚糖复合支架。

3、本发明的再一目的在于提供上述胶原蛋白壳聚糖复合支架的应用。

4、本发明的目的通过下述技术方案实现：一种胶原蛋白壳聚糖复合支架的制备方法，包括如下步骤：

5、(1)制备甲基丙烯酸缩水甘油酯胶原蛋白(rcol-gma)：将胶原蛋白溶解在纯水中形成胶原蛋白溶液；按体积比1：0.5～1将胶原蛋白溶液与甲基丙烯酸缩水甘油酯(gma)混合反应，接着在纯水中透析，透析完毕后冷冻干燥，得到甲基丙烯酸缩水甘油酯胶原蛋白；

6、(2)制备甲基丙烯酸壳聚糖(csma)：将壳聚糖溶解在乙酸溶液中，得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液和甲基丙烯酸酐混合，反应，透析，冷冻干燥，得到甲基丙烯酸壳聚糖；

7、(3)制备甲基丙烯酸多巴胺(dma)：

8、a、将四硼酸钠和碳酸氢钠溶解在去离子水中，用氮气鼓泡后加入盐酸多巴胺，并在氮气搅拌下混合均匀后，得到多巴胺溶液；

9、b、将四氢呋喃除氧后和甲基丙烯酸酐混合均匀，得到甲基丙烯酸酐溶液；

10、c、将甲基丙烯酸酐溶液滴加入多巴胺溶液中，将得到的体系的ph值保持为8～10，搅拌反应；

11、d、将得到的反应产物用乙酸乙酯萃取，保留水层，调节ph值至1～4；

12、e、继续用乙酸乙酯萃取，保留有机层，去除溶剂，得到甲基丙烯酸多巴胺；

13、(4)制备胶原蛋白壳聚糖复合支架：将步骤(1)得到的甲基丙烯酸缩水甘油酯胶原蛋白用纯水溶解，得到甲基丙烯酸缩水甘油酯胶原蛋白溶液；将步骤(2)得到的甲基丙烯酸壳聚糖用乙酸溶液溶解，得到甲基丙烯酸壳聚糖溶液；将步骤(3)得到的甲基丙烯酸多巴胺用二甲基亚砜溶解，得到甲基丙烯酸多巴胺溶液；将甲基丙烯酸缩水甘油酯胶原蛋白溶液和甲基丙烯酸壳聚糖溶液混合，得到混合液a；将铜离子与甲基丙烯酸多巴胺溶液混合，得到混合液b；将混合液a和混合液b混合后，加入苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(lap)溶液搅拌均匀，得到反应体系，接着进行光固化反应，得到胶原蛋白壳聚糖复合支架。

14、步骤(1)中所述的胶原蛋白优选为重组人源胶原蛋白；更优选为重组人源i型胶原蛋白(rcol)；最优选氨基酸序列如seq id no.1所示的重组人源i型胶原蛋白。

15、所述的重组人源ⅰ型胶原蛋白是由促纤维细胞黏附序列(gergdlgpqgiagqrgvvgergergergas)和整合素α2β1识别序列(gfpger)组合得到，其大小为120kda，具有良好的生物相容性和黏附性。

16、步骤(1)中所述的胶原蛋白溶液的浓度优选为80～120μg/ml；更优选为100μg/ml。

17、步骤(1)中所述的胶原蛋白溶液与所述的甲基丙烯酸缩水甘油酯优选按体积比1：0.6配比。

18、步骤(1)中所述的反应的条件优选为于2～8℃搅拌反应8±2小时。

19、步骤(1)中所述的透析的时间优选为5±2天。

20、步骤(2)中所述的乙酸溶液的浓度优选为体积百分比2～4％；更优选为体积百分比3％。

21、步骤(2)中所述的溶解的时间优选为24±12小时。

22、步骤(2)中所述的壳聚糖溶液的浓度优选为2～4％(w/v)；更优选为3％(w/v)。

23、步骤(2)中所述的甲基丙烯酸酐的用量是相对于壳聚糖为过量，优选按甲基丙烯酸酐：壳聚糖溶液＝体积比3：1配比计算。

24、步骤(2)中所述的反应的条件优选为室温下反应3±1小时。

25、所述的室温指的是10～40℃；优选为20～30℃；更优选为24～26℃。

26、步骤(2)中所述的透析的时间优选为5±2天。

27、步骤(3)a中所述的四硼酸钠和所述的碳酸氢钠优选按质量比5：2配比。

28、步骤(3)a中所述的盐酸多巴胺的用量按四硼酸钠：盐酸多巴胺＝质量比2：1配比。

29、步骤(3)a中所述的鼓泡的时间优选为60±20分钟。

30、步骤(3)b中所述的四氢呋喃为反应介质，不参与反应，其用量优选为甲基丙烯酸酐体积的4～6倍。

31、步骤(3)b中所述的甲基丙烯酸酐的用量相对于盐酸多巴胺为过量，优选按盐酸多巴胺：甲基丙烯酸酐＝质量比10：9.5～10配比。

32、步骤(3)c中所述的ph值优选为通过除氧后的1.0m naoh溶液调节。

33、步骤(3)c中所述的反应的条件优选为室温搅拌15±5小时。

34、所述的室温指的是10～40℃；优选为20～30℃；更优选为24～26℃。

35、步骤(3)d中所述的萃取的次数优选为1次。

36、步骤(3)d中所述的ph值优选为2～3。

37、步骤(3)d中所述的ph值优选为通过6m hcl溶液调节。

38、步骤(3)e中所述的萃取的次数优选为2次。

39、步骤(3)e中所述的去除溶剂的具体步骤优选为：用无水硫酸镁干燥后减压蒸馏。

40、步骤(4)中所述的甲基丙烯酸缩水甘油酯胶原蛋白溶液的浓度优选为4wt％。

41、步骤(4)中所述的乙酸溶液的浓度优选为0.5％(v/v)。

42、步骤(4)中所述的甲基丙烯酸壳聚糖溶液的浓度优选为4wt％。

43、步骤(4)中所述的甲基丙烯酸多巴胺溶液的浓度优选为8.225％。

44、步骤(4)中所述的铜离子来源于可溶性铜盐，优选为氯化铜。

45、步骤(4)中所述的铜离子与所述的甲基丙烯酸多巴胺优选按摩尔比1：1～3配比；更优选按摩尔比1：2配比。

46、步骤(4)中所述的反应体系中甲基丙烯酸缩水甘油酯胶原蛋白、甲基丙烯酸壳聚糖和甲基丙烯酸多巴胺按质量比16：16：16.45～65.8配比。

47、步骤(4)中所述的lap在所述的反应体系中的浓度优选为0.01～0.1wt％；更优选为0.05wt％。

48、步骤(4)中所述的光固化的条件优选为紫外光下照射10～30秒；更优选为紫外光下照射15秒。

49、所述的紫外光的波长优选为365nm。

50、所述的紫外光的功率优选为1w/cm2。

51、一种胶原蛋白壳聚糖复合支架，通过上述制备方法得到。该支架是兼具刚性、韧性和粘弹性的水凝胶支架，能解决目前明胶/壳聚糖复合支架机械性能太高，抗疲劳性较差的问题。

52、上述胶原蛋白壳聚糖复合支架在制备组织修复材料或组织工程支架在组织工程领域中的应用。

53、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

54、本发明首先将明胶替换为组织相容性和黏附性能都较明胶优良的胶原蛋白，同时将壳聚糖和重组胶原蛋白进行甲基丙烯酸化，以实现在紫外光下的共价键交联，同时引入了甲基丙烯酸化多巴胺-铜体系，以期整个支架产生的双网络交联体系能降低其刚性，使其不仅具有一定机械强度，而且能抵抗一定外界压力的情况下，增加其韧性、抗疲劳性和黏弹性。

55、进一步地，本发明使用的重组的胶原蛋白不仅避免了动物来源的胶原蛋白的免疫原性和交叉感染风险，且与明胶相比，胶原蛋白对于创面来说其生物相容性更好。

56、进一步地，本发明使用含有大量的整合素和纤维细胞黏附序列的重组人源ⅰ型胶原蛋白，具有良好的细胞黏附性能和生物相容性。