一种负载可复制型DNA疫苗的杂交型外泌体及其制备方法

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种负载可复制型dna疫苗的杂交型外泌体及其制备方法。

背景技术：

1、质粒dna的体内传递和表达是现代医学治疗各种疾病的一个重要环节，如治疗单基因疾病、癌症、缺血性心脏病及免疫治疗等其他多基因疾病。这一概念是将表达目标基因或抗原的基因递送到身体的目标部位进行表达。目前，大多数细胞内质粒传递载体有非病毒载体，如纳米颗粒、脂质体等，这些载体的一个主要限制是缺乏目标特异性，往往导致治疗效果不充分；而对于病毒载体，由于安全原因，复制缺陷腺病毒载体是唯一推荐用于人类利用的类型，因此它们的应用受到相当大的限制。

2、外泌体是所有细胞均可以分泌的一种具有脂质双分子层结构的纳米级囊泡，它具有源于母细胞的特性，参与细胞间的信息交流，在不同的生物过程中扮演重要的角色。由于外泌体的天然属性，使它具有良好的生物相容性、循环稳定性、细胞摄取的靶向特异性以及穿越生物屏障的能力，它能有效保护负载的核酸、蛋白及小分子药物，是一种良好的药物递送载体。然而，外泌体的尺寸较小，与合成纳米颗粒相比，外泌体的包封效率一般小于30％，且很难将大的核酸包裹，这导致外泌体的应用受到一定限制。

3、阳离子脂质体是已被广泛应用的基因递送纳米载体，它是由分散在水介质中的磷脂自发形成的具有双层膜结构的囊泡。阳离子脂质体携带的正电荷能够与目的基因上的负电荷发生静电吸附，从而形成稳定的复合物，可有效防止目的基因降解或稀释，延长药物半衰期。然而，合成的脂质体存在一定免疫原性，进入机体后易被免疫系统快速清除、可能诱导免疫抑制以及在肝脏等器官中的大量积累。

4、由于质粒dna具有良好相容性，生产成本低、稳定性强，许多研究者致力于基于dna疫苗的免疫治疗策略，用于治疗传染病和癌症等疾病。然而，dna在细胞中低效的转录和翻译导致低水平的抗原反应，难以诱导足够的免疫应答反应。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种负载可复制型dna疫苗的杂交型外泌体及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，该杂交型外泌体解决了外泌体难以负载大分子药物的问题，具有良好的生物相容性和无细胞毒性，能有效地被免疫细胞摄取并激活免疫细胞。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种负载可复制型dna疫苗的杂交型外泌体，所述杂交型外泌体包括负载可复制型dna疫苗的阳离子脂质体以及与其杂交的外泌体和所述外泌体表面修饰的免疫佐剂cpg，其中，所述负载可复制型dna疫苗的阳离子脂质体由可复制型dna疫苗和阳离子脂质体孵育而成。

4、优选的是，所述可复制型dna疫苗和所述阳离子脂质体的n/p为5；

5、所述可复制型dna疫苗为携带抗原基因的可复制型dna疫苗，所述抗原基因由trp-2基因和gp100基因融合而成；

6、所述阳离子脂质体包括二油酰磷脂酰乙醇胺、(1,2-二油氧基丙基)三甲基氯化铵和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，其质量比为10:10:5。

7、优选的是，所述外泌体与所述负载可复制型dna疫苗的阳离子脂质体的粒子数比为(1-5):1。

8、优选的是，所述外泌体的浓度为1μg/μl，所述外泌体表面修饰的免疫佐剂cpg的浓度为1-5μm。

9、本发明还提供一种所述的杂交型外泌体的制备方法，包括以下步骤：

10、(1)制备可复制型dna疫苗：将抗原基因转入psfv载体，构建携带抗原基因的可复制型dna疫苗；

11、(2)制备负载可复制型dna疫苗的阳离子脂质体：将脂质分子溶解后，制备单室阳离子脂质体，然后将步骤(1)制备的可复制型dna疫苗与单室阳离子脂质体孵育，制得负载可复制型dna疫苗的阳离子脂质体；

12、(3)制备负载可复制型dna疫苗的杂交型外泌体：将步骤(2)制备的负载可复制型dna疫苗的阳离子脂质体与外泌体混合孵育，经反复冻融后，再加入免疫佐剂cpg继续孵育，制得负载可复制型dna疫苗的杂交型外泌体。

13、优选的是，步骤(1)中，所述抗原基因由trp-2基因和gp100基因融合而成。

14、优选的是，步骤(2)中，所述脂质分子用乙醇溶剂后，经搅拌、超声以及滤膜过滤制得所述单室阳离子脂质体；

15、所述可复制型dna疫苗与所述阳离子脂质体n/p比为5；所述孵育条件为：室温孵育30min。

16、优选的是，步骤(3)中，所述负载可复制型dna疫苗的阳离子脂质体与所述外泌体的粒子数比为1:(1-5)混合，孵育30min；

17、所述反复冻融的方法为：液氮冷冻15min，37℃解冻20min，反复10次；

18、经反复冻融后，先孵育1h，然后再加入所述免疫佐剂cpg。

19、优选的是，步骤(3)中，所述外泌体浓度为1μg/μl，所述免疫佐剂cpg的浓度为1-5μm，孵育时间为30min。

20、本发明还提供所述的杂交型外泌体在制备提高细胞免疫效应的药物中的应用。

21、本发明公开了以下技术效果：

22、本发明提供了一种负载可复制性dna疫苗的杂交型外泌体的制备方法，该方法利用阳离子脂质体负载可复制性dna疫苗、制备外泌体，获取二者融合的杂交型外泌体，该杂交型外泌体兼具生物与合成系统的双重优势，保留各自生物学属性与特征，具有良好的生物相容性、稳定性以及无细胞毒性，能有效的将可复制性dna疫苗递送至目标细胞，最大程度的发挥免疫效应。

23、本发明利用了外泌体和脂质体相似的脂质结构以及互补的生理功能，构建了一种高质量携带可复制性dna疫苗的杂交型外泌体，解决了外泌体难以负载大分子药物的问题，通过所制备的杂交型外泌体负载可复制性dna疫苗递送至免疫细胞，有效激活免疫细胞成熟，有望将其应用于肿瘤免疫预防或治疗。

技术特征：

1.一种负载可复制型dna疫苗的杂交型外泌体，其特征在于，所述杂交型外泌体包括负载可复制型dna疫苗的阳离子脂质体以及与其杂交的外泌体和所述外泌体表面修饰的免疫佐剂cpg，其中，所述负载可复制型dna疫苗的阳离子脂质体由可复制型dna疫苗和阳离子脂质体孵育而成。

2.根据权利要求1所述的杂交型外泌体，其特征在于，所述可复制型dna疫苗和所述阳离子脂质体的n/p为5；

3.根据权利要求1所述的杂交型外泌体，其特征在于，所述外泌体与所述负载可复制型dna疫苗的阳离子脂质体的粒子数比为(1-5):1。

4.根据权利要求1所述的杂交型外泌体，其特征在于，所述外泌体的浓度为1μg/μl，所述外泌体表面修饰的免疫佐剂cpg的浓度为1-5μm。

5.一种根据权利要求1所述的杂交型外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述抗原基因由trp-2基因和gp100基因融合而成。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述脂质分子用乙醇溶解后，经搅拌、超声以及滤膜过滤制得所述单室阳离子脂质体；

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述负载可复制型dna疫苗的阳离子脂质体与所述外泌体的粒子数比为1:(1-5)混合，孵育30min；

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述外泌体浓度为1μg/μl，所述免疫佐剂cpg的浓度为1-5μm，孵育时间为30min。

10.根据权利要求1所述的杂交型外泌体在制备提高细胞免疫效应的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种负载可复制型DNA疫苗的杂交型外泌体及其制备方法，属于生物医药领域。所述杂交型外泌体包括负载可复制型DNA疫苗的阳离子脂质体以及与其杂交的外泌体和所述外泌体表面修饰的免疫佐剂CpG，其中，所述负载可复制型DNA疫苗的阳离子脂质体由可复制型DNA疫苗和阳离子脂质体融合而成。本发明利用了外泌体与脂质体相似的脂质结构及互补的生理功能，构建了一种负载可复制型DNA疫苗的杂交型外泌体，该杂交型外泌体解决了外泌体难以负载大分子药物的问题，具有良好的生物相容性和无细胞毒性，能有效地被免疫细胞摄取并激活免疫细胞，有望应用于肿瘤免疫治疗和预防中。

技术研发人员：叶邦策,左芳芳,尹斌成
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13